铁皮石斛原球茎液体悬浮培养的研究

目的研究铁皮石斛Dendrobiumcandidum原球茎液体悬浮培养的可行性以及接种量和培养液体积对原球茎生长的影响。方法利用完全随机实验设计和正交试验设计研究不同基本培养基、接种量和培养液体积对原球茎生长的影响。结果无论鲜重还是干重,铁皮石斛原球茎在液体培养基上均极显著好于固体培养基(P<0.001)。不同基本培养基对铁皮石斛原球茎生长影响的研究表明,培养天数为30d时,对于鲜重67-V极显著好于B5(P<0.01),B5极显著好于1/2MS(P<0.01),1/2MS显著好于MS(P<0.05);对于干重67-V与B5没有显著性差异(P>0.05),B5极显著好于1/2MS(P<0.01),1/2MS极显著好于MS(P<0.01)。接种量和培养液体积对原球茎生长影响的研究表明,接种量影响最大,体积其次,互作最小,若不考虑互作,对于鲜重和干重,最佳处理为接种量6.194g/瓶 培养液体积150mL/瓶或100mL/瓶;对于干重,若考虑互作,接种量为6.194g/瓶时,应选培养液体积150mL/瓶或100mL/瓶,接种量为3.102g/瓶时,应选培养液体积150mL/瓶或100mL/瓶,接种量为1.693g/瓶时,应选150mL/瓶或50mL/瓶。结论液体悬浮培养对铁皮石斛原球茎的生长有利,获得了最佳基本培养基、接种量和培养液体积的最佳搭配方案,表明通过液体悬浮培养生产铁皮石斛原球茎具有较好的开发应用前景。     

铁皮石斛原球茎悬浮培养研究

目的　建立铁皮石斛原球茎悬浮系 ,作为人工种子繁殖体。方法　对铁皮石斛原球茎悬浮培养条件进行比较选择 ,并测定生长增殖状况。结果　悬浮培养的原球茎分散性好、整齐均一。悬浮培养的最适培养基为 1/ 4 MS+40 mg/ L Vc,p H5 .6 ,摇床转速为 5 0 r/ m in,15 d继代一次 ,黑暗培养。培养基中添加 0 .5 m g/ LABA预培养 30 d,原球茎的质量提高、同步性更好。结论　首次报道了铁皮石斛原球茎悬浮系的建立 ,为铁皮石斛大规模培养开创了新途径。     

霍山石斛细胞悬浮培养及条件优化

目的利用细胞悬浮培养技术生产霍山石斛单细胞,解决石斛药用植物资源短缺问题。方法以霍山石斛叶片等外植体为实验材料,通过不同的制备方法获得霍山石斛单细胞,研究霍山石斛细胞培养的多种影响因素,应用正交设计优化霍山石斛细胞悬浮培养的条件。结果在蔗糖35 g/L,NH4NO3 1.3 g/L,pH 5.6,激素IAA 0.4 mg/L,6-BA 1.0 mg/L,培养时间14～18 d,在此条件下培养的霍山石斛细胞数为9.42×105个/mL。结论经过4次继代培养后石斛细胞多为圆状或椭圆状,细胞碎片减少。应用优化的细胞悬浮培养条件,能获得较大量的霍山石斛细胞。     

霍山石斛的研究进展

检索近50年来国内外有关霍山石斛的研究文献,并进行整理、分析、归纳.对霍山石斛的药用资源、活性及其成分的研究进展作一综述,为霍山石斛资源的可持续开发利用提供参考.霍山石斛多糖具有显著的提高机体免疫和抗白内障活性,但其野生资源濒危,人工抚育尚不成熟,药理活性的物质基础尚不清楚.如何实现霍山石斛资源的可持续发展,并阐明霍山石斛药理活性的物质基础应是今后研究的重点.     

铁皮石斛原球茎与活体真菌液体悬浮共培养研究

目的:建立铁皮石斛原球茎与活体真菌MF24液体悬浮共培养体系,为原球茎产业化生产提供科学依据。方法:研究原球茎的培养体系是否适用于MF24真菌的生长,对光照和黑暗条件下单独培养的原球茎及与真菌共培养的原球茎的生长状况进行研究,测定生物量及增殖倍数,用HPLC分析比较原球茎中11个特征峰面积的变化。结果:MF24真菌在培养原球茎的6,7-V液体培养基中能正常生长,以1 500 lx光照8～10 h.d-1会延缓真菌的生长速度。原球茎在光照或暗培养条件下都能正常生长,在原球茎培养初期加入MF24真菌,两者相互抑制生长。在原球茎的生长稳定期接入5块直径9 mm真菌菌块,对原球茎的生长和化学成分的种类无显著影响,但光照条件下共培养5 d的原球茎中有10个化合物含量比对照降低13.64%～138.47%,暗培养条件下共培养5 d的原球茎中有7个化合物含量比对照提高0.71%～12.82%,4个化合物含量比对照小幅降低3.03%～14.14%。结论:在适宜的条件下,活体真菌MF24可与铁皮石斛原球茎共培养,并影响其次生代谢水平。     

固体培养铁皮石斛原球茎化学成分研究

目的：研究固体培养的铁皮石斛原球茎的化学成分。方法：利用硅胶、葡聚糖凝胶柱色谱法,分离化学成分,根据理化性质和MS、NMR等技术对化合物进行结构鉴定。结果：从固体培养的铁皮石斛原球茎甲醇提取物中分离鉴定了8个化合物,分别为：3-羟基-24-亚甲基-环羊毛脂烷（1）,3,5-二羟基-24-甲基-环羊毛脂烷（2）,3,5-二羟基-环羊毛脂烷（3）,β-谷甾醇（4）,豆甾醇（5）,N-阿魏酰基酪胺（6）,反式对羟基桂皮酸（7）和阿魏酸（8）。结论：化合物1,2,3和6均为首次从石斛属植物中分离得到。     

铁皮石斛原球茎多糖的研究

 目的 研究铁皮石斛原球茎多糖的理化性质。方法 经过水提醇沉、脱蛋白和透析等步骤获得铁皮石斛粗多糖（CDO）和原球茎粗多糖（CDOP）;CDOP经过纤维素DE-52和葡聚糖凝胶Sephadex G-200柱层析获得6个均一多糖;用高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）测定均一多糖的纯度及相对分子质量;用气相色谱法（GC）分析粗多糖和均一多糖的单糖组成;用高碘酸氧化-Smith降解反应研究均一多糖的一级结构。结果 CDO主要由甘露糖和葡萄糖组成,物质的量比为4.29∶1.00;CDOP主要由半乳糖、阿拉伯糖和葡萄糖组成,物质的量比为2.80∶1.00∶0.61。从CDOP中获得了6个质量均一的多糖,分别为DOPW-1（78×103）、DOPW-2（37×103）、DOPS1-1（287×103）、DOPS1-2（351×103）、DOPS1-3（335×103）和DOPS1-4（171×103）;它们的单糖组成及物质的量比等特点与DOP的相同;各均一多糖分子中的1→3糖苷键均主要由半乳糖组成,还含有阿拉伯糖、葡萄糖和鼠李糖;除DOPS1-4外,各均一多糖的一级结构中均不存在1→4糖苷键。结论 这6个均一多糖为首次从铁皮石斛原球茎中得到。     

真菌诱导子对铁皮石斛原球茎的影响

 目的研究固体培养条件下一种真菌诱导子对铁皮石斛原球茎生长及总生物碱含量的影响。方法在铁皮石斛原球茎固体培养的后期加入内生真菌诱导子,并以加入等量葡萄糖溶液、麦麸培养基、蒸馏水为对照,考察真菌诱导子对原球茎鲜重、干重及总生物碱含量的影响。结果与加蒸馏水的对照相比,真菌诱导子、对照的麦麸培养基和葡萄糖溶液均可以极显著性地提高铁皮石斛原球茎的干重(P<0.01),分别提高了35.7%,34.3%和22.7%;并显著性地提高原球茎的折干率达20.7%,20.7%和16.3%(P<0.05)。与加真菌诱导子的原球茎相比,附加等量麦麸培养基和葡萄糖溶液培养的原球茎总生物碱含量分别降低了23%和17%。结论在铁皮石斛原球茎固体培养的后期加入真菌诱导子能促进原球茎的生长,并对总生物碱含量有一定的影响。     

霍山石斛杂交种与其亲本生长生理指标及药效成分含量的比较

目的：对霍山石斛杂交种与其亲本进行生长、生理指标及主要药效成分含量的比较，为霍山石斛种质资源改良提供理论依据。方法：叶绿素含量用无水乙醇法，光合速率用CI-310便携式光合作用测定系统测定；多糖含量用浓硫酸-苯酚比色法，总生物碱含量用溴甲酚绿酸性染料比色法测定。结果：杂交种生长量积累表现为近铜皮石斛的特性，较霍山石斛有极大优势；一年生杂交种叶绿素含量及光合速率均极显著高于其亲本；杂交种二年茎与三年茎多糖含量和总生物碱含量均与霍山石斛接近。结论：杂交种在生长和药效成分积累方面结合了2个亲本之间的优势，具有很大的开发利用前景。     

不同光照强度和培养时间下铁皮石斛类原球茎生物量、多糖和生物碱量的动态变化

目的探讨不同光照强度下铁皮石斛类原球茎(PLBs)生物量、主要药用成分多糖和生物碱的动态变化规律。方法以MS为基本培养基,采用光照强度单因素试验设计,烘干法测定生物量,苯酚-硫酸法测定多糖量,酸性染料比色法测定生物碱量,数据采用SPSS 16.0软件包分析。结果铁皮石斛PLBs生物量在光照强度≥2 000 lx下培养40～50 d均较高,生产上需要PLBs维持旺盛的分裂,获得最高生物量的培养条件为光照强度2 000 lx条件下培养40 d,生物量达到0.74 g;多糖量以光照强度2 000 lx下培养30 d最高,达到16.88%;生物碱量以光照强度500 lx下培养30 d最佳,达到0.028 0%。结论不同的光照强度和培养时间对铁皮石斛PLBs的生长、多糖和生物碱的变化有显著影响,适宜的光照强度和培养时间对铁皮石斛主要药用成分的生产具有重要的实践意义。     

霍山石斛未成熟种胚的离体培养研究

霍山石斛九月和十月的未成熟种胚可以在含BA1mg/L和NAA0.5mg/L的MS或Kundson培养基正常发育并形成完整植株。未成熟种胚先在暗中培养22天,以后在低光强下培养,可以得到最高发芽率(91%),其最适的发芽温度是25～27℃。     

鼓槌石斛组织培养研究

目的 :建立鼓槌石斛快速繁殖体系。方法 :组织培养 ,虫荧光素 荧光素酶生物发光法及苯酚 硫酸法。结果 :胚在光照及黑暗条件下均可以萌发 ,但苗的生长需要光照条件 ,MS,1/2MS ,B₅,N₆培养基对苗的生长均比较适宜 ,0.5mg·L^-1NAA与 1mg·L^-16-BA利于鼓槌石斛组培幼苗的生长与分化。三磷酸腺苷 (adenosine triphosphate ,ATP)在鼓槌石斛培养时发生节律性变化。组培苗多糖含量 7.254% ,原植物为 2.833%。结论 :光照对胚的萌发没有影响 ,分化出幼苗后 ,培养基中的激素、氮源及有机元素对苗的生长及分化有较大的影响 ,因此要及时将苗转移到附加NAA与 6-BA的MS ,1/2MS ,B₅,N₆培养基中。ATP可作为鼓槌石斛培养时的动态指标 ,反应其发育过程中对营养和能量的需求。组培苗的多糖高于原植物。     

不同培养条件对铁皮石斛类原球茎生物反应器培养的影响

目的 研究不同培养条件对铁皮石斛类原球茎在生物反应器培养的影响。方法 采用接种量、通气量、蔗糖浓度、光照强度等单因素试验设计,烘干法测定生物量,苯酚-硫酸法测定多糖量,数据采用SPSS 16.0软件分析。结果 在生物反应器培养条件下,利于铁皮石斛类原球茎增殖和多糖积累的培养基组分为1/2 MS基本培养基添加1.0 mg/L NAA、5%椰乳、3%蔗糖,pH值为6.0;接种量为40 g/L,采用孔径为15 μm的多孔喷头,通气量用1.0 L/min和0. 5 L/min交替使用以及光照强度为2 000 lx等培养条件有效地提高3类原球茎增殖系数和多糖量。结论 不同的培养条件对铁皮石斛类原球茎的生长、多糖的变化有显著影响,适宜的培养条件对铁皮石斛类原球茎的生物量和主要药用成分的生产具有重要的实践意义。     

铁皮石斛组培苗规范化生产标准操作规程(SOP)＊

根据《中药材生产质量管理规范》（GAP）的要求，对铁皮石斛组培苗生产的物种选择、种质特征、生态习性、组织培养、瓶内炼苗、移栽炼苗、出圃、装框、运输和档案记录等方面进行规定，明确各个生产过程的最优方法和指标，以规范铁皮石斛组培苗的生产流程，为保障铁皮石斛组培苗的质量提供理论指导和技术支撑。     

恒温条件下采收时机对铁皮石斛多糖的影响

为揭示铁皮石斛多糖积累的规律,明确采收时机对铁皮石斛多糖的影响,该研究在组培室恒温条件下,于2015年12月至2016年11月预培养铁皮石斛D21无性系小苗至1 cm左右,然后转接培养2~5个月后采收,用苯酚硫酸法测定多糖含量、柱前衍生-UPLC分析单糖组分的差异,结果显示多糖及其关键组分甘露糖的含量与培养月龄呈正相关,但各种培养月龄多糖含量均在5—6月份具有峰值,并与大田种植条件下的趋势吻合,表明即使在组培室恒定条件下,采收季节仍然显著影响多糖及其组分的含量,这种植物内在调控的多糖积累动态变化趋势可能与铁皮石斛固有的感知四季变化的生命节律有关。     

铁皮石斛根尖诱导丛生芽研究

目的探索铁皮石斛根尖再生丛生芽的适宜条件及类原球茎的起源。方法切取0.3~0.5cm的根尖为外植体,以B5为基本培养基,附加不同种类和质量浓度的植物生长调节剂进行培养。结果诱导根尖形成了愈伤组织、类原球茎或直接转化成芽且获得再生植株。通过细胞学观察认为铁皮石斛的类原球茎是单细胞起源的体细胞胚。结论为铁皮石斛组织快繁建立新的体系。     

4种内生真菌对金钗石斛无菌苗生长及其多糖和总生物碱含量的影响

目的 :研究离体培养时 4种菌根真菌对金钗石斛生长及化学成分含量的影响。方法 :利用纯培养的菌根真菌分别与金钗石斛无菌苗共生培养 ,观测它们对金钗石斛生长及其多糖和总生物碱含量的影响。结果 :与对照相比 ,Mycena sp. (MF2 3 )极显著降低了金钗石斛鲜重的 2 4.9% (P<0 .0 1) ;所有实验菌株对金钗石斛干重均无显著性影响 ;Epulorhiza sp. (MF18)和MF2 3显著提高了金钗石斛的折干率 (P<0.0 5) ,Mycena sp. (MF2 4)极显著提高了金钗石斛的折干率 (P<0. 0 1) ,分别最多提高了 51.3 % ,43 8%和 63. 3 % ;Epulorhizasp (MF15)和MF2 4比对照极显著增加了金钗石斛气生根数量的 4.25倍和 4.13倍 (P<0 .0 1) ;MF2 3极显著减少了金钗石斛基生根数量的46.5% (P<0. 0 1) ;MF15,MF18,MF2 3和MF2 4分别可使金钗石斛多糖含量提高 153 .4% ,52. 1% ,18.5% ,76.7% ;MF2 3使金钗石斛总生物碱含量提高 18.3 %。结论 :在离体培养条件下 ,内生真菌与金钗石斛共生培养能影响金钗石斛的生长和总生物碱的含量 ,提高多糖的含量。     

石斛多糖抗肿瘤作用的实验研究

 目的 观察石斛多糖（Dendrobium candidum polysaccharides, DP）对在体肿瘤和离体培养肿瘤细胞的抑制作用,探讨其抑制作用的可能机制。方法 以接种肉瘤( S180)的小鼠为模型,观察DP对接种肉瘤瘤体生长的抑制作用,分析荷瘤小鼠内脏指数的变化。ELISA法检测小鼠外周血中细胞因子白介素-2（IL-2）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量。以人肝肿瘤细胞(SMMC27721)为模型,采用cell counting kit-8(CCK-8)检测DP的体外抗肿瘤活性。结果 DP处理能够有效抑制小鼠肉瘤(S180)瘤体生长和离体肝肿瘤细胞生长（P＜0.05）;有效提高荷瘤小鼠胸腺指数和脾脏指数,提高外周血中IL-2和TNF-α含量（P＜0.05）。结论 DP具有显著的抗肿瘤效应,其抑瘤机制可能与DP促进免疫器官功能和提高细胞免疫能力有关。