反义寡核苷酸抑制人肾癌细胞系生长及Ki-67表达

目的 探讨Ki-67基因翻译起始区及义寡核苷酸对人肾癌细胞生长及Ki-67基因表达的影响。方法人工合成反义寡核苷酸，脂质体转染肾癌786-0细胞系，采用免疫组化法、^3H-TdR掺入试验和原位末端标记(TUNEL)法检测786-0肾癌细胞Ki-67抗原的表达、细胞增殖和凋亡情况。结果在反义寡核苷酸浓度大于10μmol／L时，TUNEL法显示细胞凋亡增加，^3H-TdR掺入试验表明掺入率下降，免疫组化实验发现Ki-67抗原表达下降。结论Ki-67基因翻译起始区反义寡核苷酸能阻遏人肾癌786-0细胞系Ki-67抗原的表达，抑制肿瘤细胞增殖和生长，加快其凋亡，并且有明显的剂量依赖性。     

C-myc反义寡脱氧核苷酸抑制人乳腺癌细胞系生长的研究

采用胎盼蓝染色法，３Ｈ－ＴｄＲ掺入试验和流式细胞计数分析技术研究了ｃ－ｍｙｃｍＲ－ＮＡ帽区反义寡脱氧核苷酸对人乳腺癌ＭＣＦ－７细胞系增殖及其ｃ－ｍｙｃ蛋白表达的影响，结果表明：ｃ－ｍｙｃ反义寡脱氧核苷酸能抑制人乳腺癌ＭＣＦ－７细胞系生长和增殖，这种抑制作用有明显的剂量依赖性，同时也能抑制ＭＣＦ－７细胞ｃ－ｍｙｃ蛋白的表达。此外，本文对ｃ－ｍｙｃ基因调控细胞增殖及反义核苷酸的可能机制进行了探讨。     

姜黄素对前列腺癌LNCaP细胞PSA生成及AR表达的影响

【目的】研究姜黄素对前列腺癌细胞株LNCaP细胞增殖的影响。【方法】化学发光法检测不同浓度的姜黄素处理前列腺癌细胞株LNCaP后前列腺特异抗原(PSA)含量,利用荧光素酶报告基因pGL-3构建含PSA基因5’侧启动子区640 bp DNA的荧光素酶表达载体pGL3-PSA,并将其转染LNCaP细胞,不同浓度姜黄素作用24 h后应用荧光素酶测定系统检测荧光素酶表达活性。用免疫印迹Western-blotting技术检测雄激素受体(AR)的表达。【结果】姜黄素抑制LNCaP细胞培基中PSA蛋白及含PSA启动子的荧光素酶活性的表达;形态学结果显示姜黄素可抑制前列腺癌细胞LNCaP的增殖;Western-blotting技术检测结果显示姜黄素抑制AR的表达,并且对AR表达的抑制程度依赖于姜黄素的浓度。【结论】姜黄素对PSA启动子的影响及PSA蛋白表达的抑制作用是通过抑制雄激素受体(AR)的表达实现的,姜黄素能够抑制前列腺癌细胞LNCaP的增殖。     

RNAi沉默PSA基因对人前列腺癌细胞系LNCaP生长的影响

目的研究运用RNA干扰技术沉默PSA基因后对人前列腺癌细胞系LNCaP细胞产生的影响。方法构建针对PSA基因的小分子干扰RNA(PSA-siRNA),将前列腺癌LNCaP系进行分组,设PSA-siRNA转染组、阴性对照组、转染液组(只由转染试剂进行转染实验)和对照组(不添加任何转染试剂)进行实验。应用蛋白印迹法检测PSA的变化,并通过MTT法和流式细胞技术检测LNCaP细胞的调亡和细胞增殖方面的变化。结果蛋白印迹法检测结果显示,与阴性对照组、转染液和对照组比较,应用PSA-siRNA处理48h后的LNCaP细胞株,PSA的表达明显降低,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。MTT法和流式细胞仪检测示,转染组的细胞生长抑制率为27.5%,且观察到更强的细胞调亡(19.3%)。结论运用RNA干扰技术沉默PSA基因可以有效抑制LNCaP细胞中PSA基因的表达,进而抑制LNCaP细胞的生长与增殖,并可有效诱导细胞调亡。     

联合应用反义bcl-2和反义IL-6寡核苷酸对小细胞肺癌细胞株NCI-H446的作用

目的　观察联合应用反义 bcl- 2硫代磷酸寡脱氧核苷酸 (bcl- 2 AS- PS- ODN)和白细胞介素 6 (IL - 6 )AS- PS- ODN对小细胞肺癌细胞株 NCI- H4 4 6增殖和活力的影响。　方法　以 bcl- 2 AS- PS- ODN和 IL- 6 AS- PS-ODN单独及联合作用于 NCI- H4 4 6 ,经细胞克隆形成实验、细胞增殖实验观察其对细胞增殖和活力的影响 ,经细胞凋亡线粒体流式检测试剂盒检测细胞凋亡的变化 ,经半定量 RT- PCR检测 IL - 6 m RNA表达水平的变化。　结果　细胞增殖曲线、细胞克隆形成实验及细胞凋亡实验显示联合用药能更强地抑制细胞活力 ,促进细胞凋亡。 bcl- 2 AS-PS- ODN单独作用时 ,IL- 6 m RNA表达上升 74 .3% ,IL- 6 AS- PS- ODN单独作用以及与 bcl- 2 AS- PS- ODN联合作用时 ,IL- 6分别下调 6 7.7%和 5 2 .4 %。　结论　联合用药较单独用药对 NCI- H4 4 6细胞株显示出更好的抑制效果     

联合应用反义bcl-2和反义IL-6寡核苷酸对小细胞肺癌细胞株NC1-H446的作用

目的 观察联合应用反义bcl-2硫代磷酸寡脱氧核苷酸(bcl-2AS-PS-ODN)和白细胞介素6(IL-6)AS-PS-ODN对小细胞肺癌细胞株NCI-H446增殖和活力的影响。方法 以bc1-2AS-PS-ODN和IL-6AS-PS-ODN单独及联合作用于NCI-H446，经细胞克隆形成实验、细胞增殖实验观察其对细胞增殖和活力的影响，经细胞凋亡线粒体流式检测试剂盒检测细胞凋亡的变化，经半定量RT-PCR检测IL-6 mRNA表达水平的变化。结果 细胞增殖曲线、细胞克隆形成实验及细胞凋亡实验显示联合用药能更强地抑制细胞活力，促进细胞凋亡。bc1-2AS-PS-ODN单独作用时，IL-6mRNA表达上升74．3％，IL-6AS-PS-ODN单独作用以及与bcl-2AS-PS-ODN联合作用时，IL-6分别下调67．7％和52．4％。结论 联合用药较单独用药对NCI-H446细胞株显示出更好的抑制效果。     

转染人Rb反义寡脱氧核苷酸对骨肉瘤细胞生长的影响

目的从分子水平研究Rb基因对骨肉瘤生长的影响,为骨肉瘤的基因治疗提供依据.方法用脂质体将人工合成的Rb反义寡脱氧核苷酸转入有Rb表达的人成骨肉瘤细胞.免疫组化方法检测肿瘤中Rb蛋白表达,MTT法检测细胞转染前后的增殖情况.同时流式细胞术检测细胞周期.结果转染Rb反义寡核苷酸后肿瘤细胞的Rb蛋白表达明显下降,G1期细胞比例减少,细胞增殖增加.结论转染Rb反义寡核苷酸的细胞,Rb蛋白表达明显降低,并引起肿瘤细胞增殖增加.     

原位杂交技术检测增殖细胞核抗原反义寡脱氧核苷酸对BIU-87细胞体外增殖的影响

运用原位杂交技术检测脂质体介导增殖细胞核抗原(PCNA)反义寡脱氧核苷酸抑制人膀胱癌细胞BIU-87PCNA mRNA的表达水平.结果表明脂质体介导PCNA反义寡脱氧核苷酸处理组中BIU-87细胞PCNA mRNA的表达水平明显低于对照组.结果提示脂质体介导PCNA反义寡脱氧核苷酸可抑制人膀胱癌细胞BIU-87体外增殖活性,其抑制作用可通过阻断PCNA蛋白表达来实现.     

反义bcl-2基因抗白血病作用的研究

目的 研究反义bcl-2基因抗白血病作用及其特点,探讨反义基因或联合药物体外净化和治疗白血病可行性。方法 （1）RT－PCR和蛋白印迹方法检测HL－60、U937、K562、CEM白血病细胞株以及常见白血病类型的bcl-2 mRNA和P26蛋白表达情况。（2）选择高表达bcl-2基因的HL－60细胞株作为靶细胞,用人工合成bcl-2正反义硫代寡聚脱氧核苷酸（PS－ODN）体外培养处理。检测bcl-2 mRNA和P26蛋白的变化;DNA梯形分析细胞凋亡,锥虫蓝拒染法和克隆培养观察细胞生长;同时将HL－60细胞与PS－ODN培养孵育7天后的活细胞腹腔接种Scid鼠,半巢式RT－PCR和病理分析该HL－60细胞在体内生物学行为改变。（3）建立三种白血病细胞株CEM、K562、HL－60 Scid鼠白血病模型和有效监测与追踪白血病细胞株的方法,掌握体内白血病细胞株生物学行为;用bcl-2正反义PS－ODN腹腔给药治疗HL－60 Scid鼠白血病模型,观察治疗后体内白血病进展变化。（4）用RT－PCR方法克隆bcl-2基因和构建其两种不同的反义RNA逆转录病毒表达载体。（5）转染高表达bcl-2的HL－60细胞,比较两种反义RNA在对抗bcl-2的作用与降低内源性bcl-2蛋白水平上的异同性。观察两种反义RNA介导的靶基因抑制对烷化溶血磷脂（ALP）和四种化疗药物诱导的HL－60细胞凋亡的影响。（6）RT－PCR检测基因转染HL－60在化疗药物作用下FGFβ1表达。结果 （1）白血病细胞株表达bcl-2有差异,bcl-2 mRNA和它的P26蛋白不平行。（2）三种白血病细胞株HL－60,K562,CEM可在Scid鼠增殖,产生典型白血病浸润模型特征,白血病增殖和浸润程度与白血病细胞生物特性有关,其顺序为CEM＞K562＞HL－60。（3）人工合成的bcl-2反义硫化寡脱氧核苷酸（ASPO）能够下调HL－60细胞bcl-2表达,诱导凋亡,抑制增殖和克隆形成;同时使其失去在体内的致白血病能力。（4）bcl-2反义硫代寡脱氧核苷酸,腹腔给药能够抑制肿块增长,白血病扩张,延长Scid鼠生存期,呈剂量依赖性。（5）部分编码区的反义RNA能够降低HL－60细胞内源性Bcl-2蛋白水平,提高ALP和四种化疗药物对HL－60杀伤率,促进它们诱导的HL－60细胞凋亡。（6）反义基因转染的HL－60细胞在化疗药物作用下负调控因子TGFβ1基因表达增加。结论 bcl-2反义基因可有效对抗bcl-2原癌基因表达,发挥明显的抗白血病作用,为体外净化白血病细胞和体内治疗白血病提供依据。     

bcl-2反义寡聚脱氧核苷酸抑制人喉癌细胞系增殖的研究

目的：探讨bcl-2反义寡聚脱氧核苷酸在喉癌基因治疗中的可能作用及机理．方法：采用人工合成与bcl-2mRNA起始码及其后4个密码子互补的寡聚脱氧核苷酸（简称反义核酸）片段，处理培养的人喉癌细胞系Hep-2细胞，观察其对细胞增殖的影响．同时采用原位分子杂交及免疫组化技术，检测细胞内bcl-2mRNA及Bcl-2蛋白水平，分析其变化规律．结果：bcl-2反义核酸片段对细胞内bcl-2mRNA无明显影响，但可以显著抑制Bcl-2蛋白合成，抑制率与反义核酸浓度及作用时间呈正相关．20．0μmol／Lbcl-2反义核酸可以有效地抑制细胞增殖．结论：提示bcl-2反义核酸可以在翻译水平特异性地抑制Hep-2细胞中Bcl-2蛋白的合成与细胞增殖．进一步证明bcl-2基因在喉癌的发生发展中具有十分重要的作用．     

维生素E琥珀酸酯对顺铂抑制LNCaP细胞PSA分泌和诱导细胞凋亡的影响

[目的]从细胞水平研究维生素E琥珀酸酯(VES)对顺铂(CP)引起的前列腺癌(LNCaP)细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用,并分析其对前列腺特异性抗原(PSA)表达的影响。[方法]VES、CP及二者联合分别作用LNCaP 24h或48 h,采用MTT法测定其对细胞生长的抑制作用,用荧光染色和透射电镜等形态学方法检测细胞凋亡,并用酶免疫法检测前列腺癌细胞特异性抗原(PSA)的表达情况。[结果]CP、VES和二者合用的IC50分别为1.92 mg.L-1、16.7 mg.L-1和1.02 mg.L-1;CP 4 mg.L-1、VES 25 mg.L-1和二者合用的凋亡率分别为37.2%、57.4%和77.8%;VES可以加强CP抑制LNCaP细胞分泌PSA的作用。[结论]VES可增强CP抗LNCaP细胞的作用。     

雄激素受体反义RNA对前列腺癌细胞LNCaP生长特性的影响

目的　观察雄激素受体 (Androgenreceptor ,AR)反义RNA对前列腺癌细胞LNCaP生长特性的影响。方法　用含不同浓度雄激素培养基培养前列腺癌细胞LNCaP、LNCaPas AR(基因组DNA中整合了AR反义RNA逆转录病毒载体的LNCaP细胞 )和LNCaPNeo(基因组DNA中整合了空逆转录病毒载体的LNCaP细胞 ) ,用台盘蓝染色细胞计数法及3 H 胸腺嘧啶核苷掺入试验观察体外细胞增殖状况。结果　在 1nmol/L合成雄激素R1881、10nmol/L 17β 雌二醇和 1nmol/L孕酮浓度下 ,与LNCaPNeo和LNCaP相比 ,LNCaPas AR生长显著受抑制 (P <0 0 5 ) ,LNCaPNeo与LNCaP细胞增殖无显著性差异 (P >0 0 5 )。3 H 胸腺嘧啶核苷掺入试验表明LNCaPas AR的DNA合成明显抑制率非常显著地高于对照组LNCaPNeoDNA合成抑制率 (P <0 0 1) ,显微镜下观察见LNCaP和LNCaPNeo生长状态良好 ,而LNCaPas AR细胞稀疏且有较多细胞死亡。结论　雄激素受体反义RNA可以改变LNCaP细胞的雄激素非依赖性特征 ,抑制前列腺癌细胞LNCaP对激素的增殖反应     

微小RNA-221作用蓬乱蛋白2影响前列腺癌细胞系的侵袭功能研究

目的:探讨微小RNA-221(microRNA-221,miR-221)在前列腺癌细胞系中的表达,对神经内分泌样(NE)转化及其侵袭功能的影响.方法:以Northern blot检测雄激素依赖性前列腺癌(LNCaP) 细胞系,雄激素非依赖性前列腺癌(LNCaP-AI) 细胞系中miRNA的表达;细胞转染法检测在雄激素剥夺环境中LNCaP和LNCaP-AI细胞系中miR-221的作用;细胞增殖检测法检测细胞在不同阶段的生长增殖水平;Transwell法检测转染细胞的侵袭能力;定量逆转录聚合酶链反应和Western blot检测转染细胞中神经元特异性烯醇化酶及蓬乱蛋白2 (DVL2)表达的变化.结果:与LNCaP相比,miR-221在 LNCaP-AI中明显高表达.通过转染使miR-221在LNCaP中高表达可促进细胞的神经元特异性烯醇酶的表达,加速NE转化.而在LNCaP-AI中下调miR-221水平可增强靶基因DVL2的表达,并增强LNCaP-AI的迁移和侵袭能力(P<0.01).结论:LNCaP和LNCaP-AI中miR-221表达有差异.miR-221可促进前列腺癌细胞的NE转化,可能是导致前列腺癌雄激素非依赖转化的重要原因.MiR-221可通过作用DVL2调节前列腺癌细胞的转移和侵袭.     

原位杂交技术检测增殖细胞核抗原反义寡脱氧核苷酸对BIU—87细胞体外增殖的影响

运用原位杂交技术检测脂质体介导增殖细胞核抗原（PCNA）反义寡脱氧苷酸抑制人膀胱癌细胞BIU－87 PCNA mRNA的表达水平。结果表明脂质体介导PCNA反义寡脱氧核苷酸处理组中BIU－87细胞PCNA mRNA的表达水平明显低于对照组。结果提示脂质体介导PCNA反义寡脱氧核苷酸可抑制人膀胱癌细胞BIU－87体外增殖活性,其抑制作用可通过阻断PCNA蛋白表达来实现。     

反义技术封闭增殖细胞核抗原对骨肉瘤细胞生物学行为的影响

为探讨用反义技术治疗骨肉瘤的可能性，将针对增殖细胞核抗原(PCNA）mRNA的不同剂量的反义寡核苷酸（ASODN）导入人骨肉瘤Saos-2细胞株，用^3H-TdR掺入法，免疫组化及双层软琼脂培养法检测其对肿瘤细胞增殖。PCNA表达及成瘤能力的影响。结果表明，ASODN能显著抑制Saos-2细胞增殖及PCNA表达，抑制作用呈剂量依赖性，30μmol/L浓度即可完全抑制PCNA表达，软琼脂培养无集落形成。表明通过反义技术抑制PCNA基因表达可对骨肉瘤细胞恶性表型产生逆转作用，开辟了骨肉瘤基因治疗的新途径。     

bcl-2反义寡核苷酸对小细胞肺癌细胞NCI-H69放射敏感性的影响

目的研究bcl-2反义寡核苷酸对人小细胞肺癌细胞NCI-H69放射敏感性的影响。方法将NCI-H69细胞培养传代,然后将细胞分为反义寡核苷酸组、正义寡核苷酸组、无义寡核苷酸组和空白对照组,通过脂质体将不同寡核苷酸导入细胞中,用Western-Blot法检测Bcl-2蛋白的表达。采用直线加速器分别以不同剂量（0、2、4、6、8、10 Gy）X线照射4组细胞。收集照射后的细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡率,MTT法测定细胞存活分数。结果Western-Blot杂交显示反义寡核苷酸组无Bcl-2蛋白表达,相对正义寡核苷酸组、无义寡核苷酸组及空白对照组Bcl-2蛋白表达明显受到抑制（F=7.24-15.31,q=5.03-7.80,P〈0.01）。细胞经X线照射后,反义寡核苷酸组细胞凋亡率明显高于空白对照组,差异具有显著性（F=7.24-15.31,q=5.03-7.80,P〈0.01）;正义寡核苷酸组和无义寡核苷酸组与空白对照组相比无统计学差异。4组细胞接受辐射后,反义寡核苷酸组在未照射和照射不同剂量后的存活分数均低于空白对照组,差异有统计学意义（F=11.04-45.56,q=5.10-14.75,P〈0.01）,而正义寡核苷酸和无义寡核苷酸组与空白对照组比较则无统计学差异。结论bcl-2反义寡核苷酸能有效封闭bcl-2基因的表达,增强小细胞肺癌细胞NCI-H69对X线的敏感性。     

bcl-2反义寡核苷酸对小细胞肺癌细胞NCI-H69放射敏感性的影响

目的 研究bcl-2反义寡核苷酸对人小细胞肺癌细胞NCI-H69放射敏感性的影响.方法 将NCI-H69细胞培养传代,然后将细胞分为反义寡核苷酸组、正义寡核苷酸组、无义寡核苷酸组和空白对照组,通过脂质体将不同寡核苷酸导入细胞中,用Western-Blot法检测Bcl-2蛋白的表达. 采用直线加速器分别以不同剂量(0、2、4、6、8、10 Gy)X线照射4组细胞.收集照射后的细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡率,MTT法测定细胞存活分数.结果 Western-Blot杂交显示反义寡核苷酸组无Bcl-2蛋白表达,相对正义寡核苷酸组、无义寡核苷酸组及空白对照组Bcl-2蛋白表达明显受到抑制(F=7.24～15.31,q=5.03～7.80,P＜0.01).细胞经X线照射后,反义寡核苷酸组细胞凋亡率明显高于空白对照组,差异具有显著性(F=7.24～15.31,q=5.03～7.80,P＜0.01);正义寡核苷酸组和无义寡核苷酸组与空白对照组相比无统计学差异.4组细胞接受辐射后,反义寡核苷酸组在未照射和照射不同剂量后的存活分数均低于空白对照组,差异有统计学意义(F=11.04～45.56,q=5.10～14.75,P＜0.01),而正义寡核苷酸和无义寡核苷酸组与空白对照组比较则无统计学差异.结论 bcl-2反义寡核苷酸能有效封闭bcl-2基因的表达,增强小细胞肺癌细胞NCI-H69对X线的敏感性.     

中药对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用的研究*

[目的]研究中药抑制血管平滑肌细胞(VSMC)生长增殖的作用和机制.[方法]采用3H-TdR(氚胸腺苷)掺入和外源性c-jun cDNA在血管平滑肌细胞中表达的方法,观察血管平滑肌细胞(VSMC)生长增殖变化.[结果]与对照血清+内皮素组(cpm 2 534.54±54.2/105细胞)相比,中药血清+内皮素组(cpm 1 104.33±37.31/105细胞)血管平滑肌细胞3H-TdR掺入量有显著下降(P＜0.01),而且血管平滑肌细胞原癌基因的c-jun mRNA表达也较弱.[结论]本实验表明复方丹参对血管平滑肌细胞增殖及其原癌基因c-jun mRNA的表达有明显的抑制作用.     

染料木黄酮通过PI3K/AKT途径抑制雄激素非依赖性LNCaP细胞

目的 利用LNCaP细胞建立去势抵抗前列腺癌细胞模型,研究染料木黄酮(GEN)对去势抵抗前列腺癌细胞生长的影响及可能的机制.方法 在无激素的血清环境下长时间培养LNCaP细胞,获得稳定生长的雄激素非依赖性 LN-CaP前列腺癌细胞,并鉴定细胞.以不同浓度的 GEN(0、6. 25、12. 5、25、50、100、200 μmol/L)分别作用于雄激素依赖性LNCaP和雄激素非依赖性LNCaP细胞24、48、72 h ,利用CCK-8法检测细胞增殖活性,Western blot法检测前列腺特异性抗原(PSA)、P53抑癌基因、细胞周期蛋白(Cyclin D1)、增殖细胞核抗原( PCNA)在雄激素非依赖LNCaP细胞中的表达水平. Western blot法检测其对PI3K/AKT信号通路的调节作用.结果 GEN对雄激素非依赖性LNCaP细胞增殖具有明显的抑制作用,并呈剂量、时间依赖关系. Western blot显示雄激素非依赖性前列腺癌细胞内PCNA、Cyclin D1随着GEN浓度的增加逐渐下调,P53随着GEN浓度的增加逐渐上调(P＜0. 05). GEN抑制了PI3K和AKT的磷酸化.结论 GEN可以在体外抑制雄激素非依赖性LNCaP细胞的增殖,其作用可能是通过抑制PI3K/AKT信号通路,进而抑制细胞增殖实现的.     

Bcl-2反义寡核苷酸对顺铂诱导肺癌细胞凋亡的促进作用

据《中华结核和呼吸杂志》2000年12月23卷第12期报道 广州呼吸疾病研究所欧阳能太等,为研究凋亡抑制基因bcl-2的反义寡脱氧核苷酸(ODN)对顺铂诱导肺癌细胞