星形胶质细胞特异性敲除Adam10基因对周细胞和血脑屏障的影响

目的:探讨Adam10基因对于星形胶质细胞与周细胞之间信号交流及对血脑屏障(BBB)完整性的影响。方法:利用Cre-loxp技术得到星形胶质细胞特异性敲除Adam10基因小鼠(Gfap~(cre)-Adam10~(lox/lox))纳入敲除组,将同胎基因型为Adam10~(lox/lox)的小鼠纳入对照组。免疫荧光双标技术检测周细胞心肌素(myocardin)蛋白和平滑肌肌动蛋白(SMA)的表达;电镜分析周细胞的变性和凋亡、基底膜和BBB的破坏;激光散斑衬比成像技术观察脑组织局部血流灌注的改变。结果:特异性敲除星形胶质细胞Adam10基因后,可影响相邻的星形胶质细胞和周细胞之间的信号交流,导致周细胞表达myocardin蛋白和SMA蛋白减少;敲除组呈现出更为明显的周细胞变性、凋亡和BBB破坏;进而影响血管密度和血流速度。结论:Adam10基因可能影响星形胶质细胞与周细胞之间的信号交流,并可能因此而影响BBB完整性和脑组织的血流灌注。     

水通道蛋白4基因沉默与体外培养星形胶质细胞的形态生长及其增殖效应

目的:研究短发夹环质粒载体对体外培养的星形胶质细胞水通道蛋白4表达的基因沉默效果。方法:实验于2003-12/2005-05在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所完成。实验动物为SPF级Wistar新生3d大鼠20只,进行大鼠星形胶质细胞分离、培养。实验使用传至第三代的星形胶质细胞。构建特异性抑制水通道蛋白4表达的短发夹环质粒载体水通道蛋白4RNAipGenesil-2,将体外培养的星形胶质细胞分为水通道蛋白4基因沉默组、水通道蛋白4基因沉默对照组、脂质体组和正常对照组,运用脂质体法转染质粒载体,分别于转染后2,3,5,7d通过观察细胞形态和数量的改变,应用反转录-聚合酶连反应、免疫组织化学分别检测水通道蛋白4mRNA和蛋白的表达,水通透实验验证水通道蛋白4基因沉默后星形胶质细胞的水通透功能。结果:星形胶质细胞水通道蛋白4基因沉默后,水通道蛋白4mRNA及蛋白的表达呈进行性减少,至第7天水通道蛋白4mRNA和蛋白表达水平分别减少了(80.12±1.01)%和(80.2±2.54)%,细胞数量减少约60%,星形胶质细胞从扁平和多角形变成类纤维形胶质细胞。水通透实验证实经水通道蛋白4基因沉默的星形胶质细胞体积增大的速度慢于正常星形胶质细胞。结论:构建的水通道蛋白4基因沉默pGenesil-2质粒载体可抑制星形胶质细胞水通道蛋白4的表达;水通道蛋白4参与星形胶质细胞快速水转运过程;水通道蛋白4也对维持体外培养的星形胶质细胞形态、生长、增殖起重要作用。     

水通道蛋白4基因沉默与体外培养星形胶质细胞的形态生长及其增殖效应

目的：研究短发夹环质粒载体对体外培养的星形胶质细胞水通道蛋白4表达的基因沉默效果。 方法：实验于2003-12／2005-05在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所完成。实验动物为SPF级Wistar新生3d大鼠20只，进行大鼠星形胶质细胞分离、培养。实验使用传至第三代的星形胶质细胞。构建特异性抑制水通道蛋白4表达的短发夹环质粒载体水通道蛋白4RNAi pGenesil-2，将体外培养的星形胶质细胞分为水通道蛋白4基因沉默组、水通道蛋白4基因沉默对照组、脂质体组和正常对照组，运用脂质体法转染质粒载体，分别于转染后2，3，5，7d通过观察细胞形态和数量的改变，应用反转录-聚合酶连反应、免疫组织化学分别检测水通道蛋白4mRNA和蛋白的表达，水通透实验验证水通道蛋白4基因沉默后星形胶质细胞的水通透功能。 结果：星形胶质细胞水通道蛋白4基因沉默后，水通道蛋白4mRNA及蛋白的表达呈进行性减少，至第7天水通道蛋白4mRNA和蛋白表达水平分别减少了（80．12&;#177;1．01）％和（80．2&;#177;2.54）％，细胞数量减少约60％，星形胶质细胞从扁平和多角形变成类纤维形胶质细胞。水通透实验证实经水通道蛋白4基因沉默的星形胶质细胞体积增大的速度慢于正常星形胶质细胞。 结论：构建的水通道蛋白4基因沉默pGenesil-2质粒载体可抑制星形胶质细胞水通道蛋白4的表达；水通道蛋白4参与星形胶质细胞快速水转运过程；水通道蛋白4也对维持体外培养的星形胶质细胞形态、生长、增殖起重要作用。     

磁刺激通过星形胶质细胞磷酸化蛋白影响星形胶质细胞迁移

目的 研究1.0Hz 60%最大刺激强度的磁刺激通过调控星形胶质细胞磷酸化蛋白（PEA-15）对星形胶质细胞迁移的影响。 方法 取第3～4代体外分离培养的大鼠星形胶质细胞,分为对照组、转染组、磁刺激组和转染+磁刺激组。对照组进行阴性siRNA转染,转染组应用化学合成的siRNA进行脂质体瞬时转染,干扰PEA-15的蛋白表达;磁刺激组的星形胶质细胞在铺板24h后接受60%最大强度磁刺激;转染+磁刺激组进行PEA-15的siRNA转染,并给予60%最大强度磁刺激。用细胞划痕试验检测星形胶质细胞的迁移程度,用免疫印迹试验检测PEA-15的蛋白表达和磷酸化水平变化。 结果 ①PEA-15 siRNA的转染效果明显,Western Blot检测与对照组比较,PEA-15的蛋白表达明显降低。②体外划痕实验中,转染组、磁刺激组、转染+磁刺激组的细胞迁移面积分别与对照组比较,其星形胶质细胞迁移程度增加,差异均有统计学意义（P<0.05）。③与对照组相比,磁刺激组的PEA-15磷酸化明显增加。 结论 干扰PEA-15表达后的星形胶质细胞迁移增加明显;磁刺激可通过增强PEA-15磷酸化促进星形胶质细胞的迁移。     

星形胶质细胞升高基因-1与肿瘤血管生成的关系

AEG-1对肿瘤多种生物学特性均有促进作用,并与肿瘤血管生成密切相关.实验证实AEG-1过度表达的肿瘤部分新生血管较多,AEG-1也可以提高VEGF启动子的活性以及相关分子的表达水平.与AEG-1介导血管生成有关的分子包括PI3k/Akt、Tie2、Angl、H-ras和HIF-1α等.在信号转导途径中最为重要的是PI...     

体外培养大鼠星形胶质细胞划伤模型

目的复制体外培养大鼠星形胶质细胞划伤模型。方法利用传至第2代的体外培养的大鼠星形胶质细胞进行细胞划伤实验。分别于划伤前10min、划伤后1、3、6、12、24h观察细胞形态变化,并取培养上清液进行乳酸脱氢酶活性测定。结果细胞划伤后划痕两侧边缘整齐,随时间推移细胞突起逐渐向划痕区延伸,且划痕区出现星形胶质细胞。细胞划伤后乳酸脱氢酶漏出量短时间内迅速增加,之后各时间点持续增加(P<0.05),且均高于相应时间点的对照组(P<0.05)。结论细胞形态变化及培养上清液中乳酸脱氢酶漏出量证实体外培养大鼠星形胶质细胞划伤模型复制成功。     

神经胶质细胞与神经突触的相互作用——从星形胶质细胞到小胶质细胞和少突胶质细胞谱系细胞

哺乳动物的大脑是一个由神经元、神经胶质细胞和超过1×1014个突触组成的复杂的器官。神经元是一组异质的电活性细胞,形成大脑复杂电回路的框架。然而,神经胶质细胞约占哺乳动物中枢神经系统(CNS)所有神经细胞的一半,主要分为星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞(OL)和少突胶质细胞前体细胞(OPC);神经胶质细胞主要为大脑中的神经元提供营养支持。近二十年来,“三联突触”的概念引起了广泛关注,该概念强调星形胶质细胞是突触的组成部分,并在接受神经元信号后以反馈方式调节神经元活动。自此,神经胶质细胞的突触调节得到了广泛的研究和实质性的修改。本综述总结了关于神经胶质细胞(特别是小胶质细胞和OL谱系细胞)如何影响和重塑大脑突触结构和功能的最新重要发现。我们的综述强调了神经元-神经胶质细胞串扰的细胞和分子方面,并提供了有关神经元和神经胶质细胞之间的异常突触通讯如何导致神经病理学的额外信息。     

应用组织芯片技术研究COX-2、c-erbB-2和Ki-67在星形胶质细胞增生和星形胶质细胞瘤中的表达及意义

目的研究COX-2、c-erbB-2、Ki-67在星形胶质细胞增生及星形胶质细胞瘤中的表达,并探讨三者在鉴别反应性与肿瘤性星形胶质细胞方面的作用.方法利用组织芯片技术及PV6000通用型二步法免疫组化方法检测COX-2、c-erbB-2、Ki-67在正常脑组织、星形胶质细胞增生、低/高级别星形胶质细胞瘤中的表达.结果正常组织中COX-2、c-erbB-2、Ki-67表达均为（-）;增生组中阳性表达率分别为28.9%、37.8%和22.2%,与正常组比较,COX-2、Ki-67表达差异不显著,c-erbB-2差异显著（P＜0.05）;低级别肿瘤组中三者阳性表达率分别为68.1%、63.8%和70.2%,与增生组比较,均差异显著（P＜0.05）;高级别肿瘤组中三者阳性表达率分别为88.1%、83.3%和95.2%,与低级别肿瘤组比较,均差异显著（P＜0.05）.COX-2、c-erbB-2与组织学分级密切相关（r值分别为0.989和0.988）.结论COX-2、c-erbB-2、Ki-67有可能成为鉴别星形胶质细胞增生与低级别星形胶质细胞瘤的客观指标,且COX-2、c-erbB-2在星形胶质细胞瘤的发生、发展过程中有重要作用.     

星形胶质细胞的形态可塑性:理解突触微环境

在大脑中记忆的形成被认为是依赖突触连接的重塑,最终导致神经网络重构。这种重塑可能涉及兴奋性突触附近经常发生的超薄星形胶质细胞突起。这种星形胶质细胞重组的现象、细胞机制和因果关系,仍然知之甚少。这在很大程度上是因为监测和探索纳米级星形胶质细胞结构的基础分子机械技术仍然是一个挑战。本文简要地总结了目前关于突触微环境下星形胶质细胞的细胞组织知识,讨论可能涉及依赖星形胶质细胞形态发生的分子机制。本文还讨论了最近有关星形胶质细胞的形态可塑性的观察,相应的监测方法,和一些可能有助于该领域进展的新兴技术。     

补体C3对神经病理性疼痛模型脊髓星形胶质细胞的影响

目的:观察补体C3对神经病理性疼痛模型脊髓星形胶质细胞的影响。方法:81只补体C3基因敲除小鼠随机分三组(n=27):A组:假手术组;B组:慢性坐骨神经结扎模型(CCI)组;C组:CCI模型补体C3干预组。测定小鼠的热痛阈值和机械痛阈值,并取腰5、6脊髓节段测定GFAP mRNA和GFAP表达。结果 :术前三个组小鼠热和机械痛阈无明显差异,术后1天A组热和机械痛阈下降,其后恢复。B组和C组继续下降,C组下降幅度更大(P<0.05)。术后第1天,B组和C组胶质细胞激活轻微,术后第3、7天B组和C组脊髓组织GFAP mRNA和GFAP表达量逐渐增加,且C组其表达量明显高于B组。结论 :补体C3的存在与神经病理性模型小鼠星形胶质细胞激活显著相关,并由此影响到慢性疼痛状态的出现和维持。     

选择性敲除小鼠神经细胞Adam10基因导致大脑皮质发育不良

目的:研究Adam10基因在小鼠神经系统发育中的作用。方法:利用Cre-loxp转基因鼠技术,将Gfapcre转基因鼠和Adam10lox/lox转基因鼠杂交,得到神经细胞特异性Adam10基因敲除鼠(Gfapcre-Adam10lox/lox),在出生后第14天对大脑切片行HE染色,观察Adam10基因敲除后神经系统发育情况。结果:选择性敲除小鼠神经细胞Adam10基因(Gfapcre-Adam10lox/lox),小鼠可存活至出生后3周左右,部份小鼠大脑皮质单侧或双侧缺失,未出现皮质缺失的小鼠大脑皮质经HE染色提示出现层次结构紊乱。结论:Adam10基因在小鼠神经系统发育中具有重要作用,选择性敲除神经细胞Adam10基因后导致小鼠大脑皮质缺失或层次结构紊乱。     

小分子干扰RNA抑制293T细胞中外源基因OX40的表达

目的研究小分子干扰RNA（siRNA）抑制293T细胞中OX40基因表达的可行性。方法根据大鼠OX40 cDNA已知序列，设计并化学合成一条含19个核苷酸siRNA。将此siRNA包装入质粒载体后，转化质粒到大肠杆菌中，经克隆，扩增，纯化。应用Lipofectamine 2000将OX40基因表达载体与其相应siRNA（OX40-siRNA）质粒共转染293T细胞，观察siRNA载体对OX40基因的抑制效应。在转染后48h用实时定量PCR从基因转录水平检测OX40基因的表达率，并以western blot在蛋白水平检查293T细胞中OX40蛋白的表达水平。结果siRNA转染293T细胞28h后，OX40靶mRNA及OX40蛋白的表达水平明显下降；且siRNA所介导的抑制效应与干扰载体剂量大小有关。结论siRNA能抑制293T细胞中OX40基因表达，从而为siRNA作为一种可能的治疗手段提供了理论依据。     

RNA特异性干扰bcr-abl融合基因联合p27基因克隆对K562细胞的影响

本研究旨在探讨RNA干扰抑制慢性髓系白血病bcr-abl融合基因表达,以及RNAi和p27基因克隆联合作用对K562细胞的细胞增殖、细胞周期及凋亡等的调控作用。以细胞系K562为研究对象,合成并转染针对K562细胞bcr-abl融合基因融合位点的21nt siRNA,应用Northern blot法检测bcr-abl融合基因的表达,Western blot法检测BCR-ABL蛋白及凋亡相关蛋白BCL-xL的表达;同时应用RT-PCR扩增p27基因,构建P27-pcDNA3.1载体,转染p27基因入缺失p27基因的K562细胞,经筛选得到G418抗性的K562细胞株;经Western blot证实有P27蛋白表达后,联合应用RNA干扰及p27基因克隆,通过MTT法及流式细胞仪等检测联合作用后对K562细胞的细胞增殖、细胞周期及凋亡等的调控作用。结果表明,RNA干扰组K562细胞bcr-abl融合基因的表达水平明显下降,转染24小时时有18.4%的K562细胞发生凋亡,细胞凋亡相关蛋白BCL-xL的表达水平下调,出现明显的G1期阻滞;表达外源性P27蛋白的P27-pcDNA3.1-K562细胞株生长速度明显慢于对照K562细胞株。流式细胞仪检测显示,G0/G1期细胞增多,S期细胞明显减少;RNA干扰与p27基因克隆联合作用于K562细胞后,凋亡细胞比例明显上升(33.4%)。MTT法显示,细胞存活率较单纯p27-K562细胞组及RNA干扰-K562细胞组均明显下降(p0.01和p0.05)。结论:特异性siRNA分子可以抑制bcr-abl融合基因的表达,诱导K562细胞分化或凋亡。RNA干扰联合p27基因克隆对抑制K562细胞增殖及促凋亡方面具有协同作用。     

靶向转酮醇酶样基因1 siRNA表达载体的构建及鉴定

目的构建针对转酮醇酶样基因1(TKTL1)特异性小干扰RNA(siRNA)真核表达载体并检测其沉默效应。方法采用人U6 SnRNA启动子,分别把被9 bp序列间隔的19 bp长短的TKTL1靶序列的反向重复序列,置于pEGFP-C1-U6质粒载体中,构建成TKTL1短发夹环RNA,产生重组质粒pEGFP-C1-U6/TKTL1,分别用PstⅠ和SalⅠ酶切鉴定及测序分析,并将重组质粒转染人结肠癌细胞株LoVo,通过RT-PCR检测TKTL1基因表达水平的变化。结果酶切鉴定与DNA测序分析证明,TKTL1基因的siRNA表达载体构建正确,RT-PCR结果表明转染重组质粒的LoVo细胞TKTL1基因的表达水平明显降低。结论成功构建了针对TKTL1基因的siRNA表达载体,转染LoVo细胞后可显著抑制TKTL1基因表达。     

小鼠Qa-1基因有效shRNA干扰质粒的构建与筛选

本研究构建3个针对小鼠Qa-1基因的小发夹RNA（shRNA）表达质粒，观察其对Qa-1基因的沉默作用，筛选出有效靶位。通过美国Ambion公司提供的siRNA web设计工具，选择3段针对Qa-1的siRNA，交由晶赛公司合成3个小发夹表达质粒，采用脂质体转染法转染NIH3T3细胞，第1、2、3组细胞分别转染3个小发夹表达质粒，第4组细胞单纯加入脂质体作为阴性对照，收集转染后24、48、72小时的细胞，用RT-PCR技术及流式细胞术对Qa—1在RNA水平的变化和细胞表面表达进行分析，筛选最有效的干扰片段。结果表明：成功构建了3个针对小鼠Qa—1的小发夹表达质粒。RT—PCR及流式细胞术检测证实，转染后3个组shRNA载体均可抑制Qa-1基因的表达，但抑制程度不一：24、48、72小时3个组细胞表面Qa-1表达减低率分别为H2-T231：60．9％，81．9％，43．6％；H2-T232为：64．5％。73．9％。61．1％；H2-T233为：61．9％，71．2％，47．5％．其中H2-T232组在3个时间点抑制作用均最明显。结论：构建的3个针对Qa-1的小发夹表达质粒均能抑制Qa-1的表达，其中H2-T232具有最有效抑制作用。     

慢病毒载体介导survivin基因siRNA对裸鼠移植人肺腺癌的体内抗癌机制研究

目的探讨慢病毒载体介导survivin基因小片段干扰RNA(siRNA)对裸鼠移植人肺腺癌的体内抑瘤活性。方法制备表达survivin-siRNA的慢病毒载体,构建裸鼠移植人肺腺癌模型,将裸鼠分为空白组(PC组)、空白载体组(NC组)、实验组(RNAi组)3组,分别给予生理盐水、空白病毒载体和siRNA;siRNA组肿瘤组织局部注射表达survivin-siRNA的慢病毒载体,观察肿瘤体积及其随时间的生长变化曲线;分别采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)及蛋白质印迹法检测各组裸鼠肿瘤组织中survivin基因的信史RNA(mRNA)及其表达的蛋白水平变化;采用流式细胞术检测肿瘤细胞周期组方图变化。结果慢病毒载体介导survivin-siRNA对裸鼠肺腺癌的抑瘤率为46.07%;siRNA组瘤重与NC组和PC组比较,差异有统计学意义(P0.05),而NC组与PC组瘤重比较差异无统计学意义(P0.05);siRNA组survivin基因mRNA及蛋白表达较NC组和PC组明显降低,抑制率分别为72.00%、53.00%;G1期细胞百分比明显增加,S期细胞百分比则明显减少。结论慢病毒载体介导的siRNA能有效抑制裸鼠移植人肺腺癌survivin基因的表达,有效激发细胞凋亡。     

小分子RNA干扰鞘氨醇激酶1表达对APP/PS1小鼠海马细胞凋亡的影响

目的:观察腺病毒介导的鞘氨醇激酶1(sphk1)低表达对AD小鼠海马细胞凋亡的影响。方法:构建siRNA-Sphk1腺病毒载体,立体定位法将携带siRNA-Sphk1的腺病毒载体(siRNA-Sphk1组)或等量生理盐水(saline组)注射至APP/PS1双转基因AD模型鼠海马齿状回;30 d后,荧光显微镜下观察各组小鼠海马绿色荧光蛋白的表达,westen blot法观察海马Sphk1及caspase-3蛋白的表达,Tunel法观察海马齿状回细胞凋亡的情况。结果:siRNA-Sphk1组海马齿状回可见绿色荧光的表达,saline组无绿色荧光表达;siRNA-Sphk1组海马Sphk1蛋白的表达较saline组下降(P<0.05),caspase-3蛋白较saline组的表达升高(P<0.05);siRNA-sphk1组小鼠海马组织的细胞凋亡率较saline组和阴性对照组升高(P<0.05)。结论:成功构建siRNA-sphk1的重组腺病毒,移植后,可抑制AD小鼠海马Sphk1蛋白的表达,促进海马齿状回细胞的凋亡。     

特异性抑制Aqp1基因对K562细胞生长的抑制作用

本研究探讨靶向aqp1(aquaporin 1)基因的siRNA对K562细胞生长的抑制作用。设计siRNA,转染K562细胞,在相差显微镜观察细胞形态变化;用MTT法观察aqp1-siRNA对K562细胞活力的影响;使用流式细胞仪、DNA片段化分析K562细胞凋亡;用RT-PCR半定量检测转染前后aqp1基因表达。结果表明:苏木素-伊红染色后,细胞呈现明显的凋亡形态;转染24小时后aqp1-siRNAs对K562细胞的活性有显著抑制作用;aqp1-siRNA转染K562细胞后可见明显的凋亡峰,24、48和72小时的细胞凋亡率持续上升,分别为24.2%、36.1%和42.9%;48小时后aqp1-siRNA组出现明显的DNA凋亡"梯形电泳带";aqp1基因的表达水平在aqp1-siRNA转染后24、48和72小时,分别减少了33%、46%和57%。结论:aqp1-siRNA能够抑制K562细胞的增殖,诱导其凋亡,可作为治疗恶性肿瘤的新靶点。