黄芪多糖影响Ca2+调节蛋白及其复合体而促进IEC-6细胞迁移的研究

目的：观察黄芪多糖对小肠上皮细胞（IEC-6）迁移过程多胺信号通路Ca2+调节指标的影响，以探讨益气健脾中药黄芪促进胃肠黏膜损伤修复的作用机制。方法：划痕法造细胞迁移模型并观察黄芪多糖在无钙培养时对细胞迁移的影响；荧光定量PCR法检测TRPC1、STIM1和STIM2 mRNA表达；免疫荧光法检测STIM1蛋白分布及表达；Western Blot法检测TRPC1、STIM1和STIM2蛋白表达；免疫沉淀法检测STIM1/TRPC1、STIM1/STIM2蛋白复合体表达。结果：①无钙培养（去除胞外Ca2+内流来源）减弱了黄芪多糖促进细胞迁移的作用；②黄芪多糖对钙通道蛋白TRPC1的影响：能提高TRPC1mRNA和蛋白表达，逆转DFMO（多胺合成抑制剂）所致的TRPC1mRNA和蛋白表达降低；③黄芪多糖对Ca2+感受器正、负向调节蛋白（STIM1和STIM2）的影响：促进STIM1向胞膜移位并提高其表达，改善DFMO所致的STIM1向胞膜移位延迟及表达抑制；提高STIM1mRNA和蛋白表达，逆转DFMO对STIM1mRNA和蛋白表达的抑制；降低STIM2mRNA和蛋白表达，逆转DFMO对STIM2mRNA和蛋白表达的提高；④黄芪多糖对Ca2+调节蛋白复合体（STIM1/TRPC1、STIM1/STIM2）的影响：提高STIM1/TRPC1表达，逆转DFMO对STIM1/TRPC1表达的抑制；通过提高复合体中STIM1表达和降低STIM2表达而调节STIM1/STIM2表达，并能拮抗DFMO对STIM1/ STIM2表达的影响。结论：黄芪多糖促进IEC-6细胞迁移的作用与其影响Ca2+调节蛋白及蛋白复合体表达有关。     

TRPC的激活机制研究现状

TRPC是TRP超家族中的一员,是一类对Ca2＋通透的非选择性阳离子通道蛋白。TRPC通道可被各种化学性和物理性刺激（如神经递质、激素、温度和机械刺激等）所激活,激活机制相当复杂,一般认为是通过PKC-PLC-IP3或PKC-PLC-DAG途径激活,参与受体介导的Ca2＋内流。也有证据表明,它可直接被钙库排空所激活,参与SOCE（store-operated calcium entry）。本文对TRPC激活机制的研究现状做一综述。     

TRP通道对心肌缺血再灌注损伤保护作用研究进展

瞬时受体电位（transient receptor potential,TRP）通道是一类位于细胞膜上的阳离子通道。TRP通道被分为7个亚家族（TRPC、TRPA、TRPM、TRPV、TRPN、TRPP和TRPML）,在心肌组织中广泛表达。近年来,随着基因敲除和转基因模型动物的应用,发现TRP通道超家族成员中TRPM、TRPC和TRPV与心肌缺血再灌注损伤密切相关。TRP通道的激活或抑制参与了心肌缺血再灌注损伤的调控,减少了心肌的梗死面积,发挥保护作用。因此,本文首先对TRPM、TRPC、TRPV结构特征及其在心血管系统分布情况做了概述,再分别对TRPM、TRPC、TRPV调控心肌缺血再灌注的机制做了总结,为心肌缺血再灌注损伤的治疗提供一定的理论依据。     

TRPC通道在阿尔茨海默病(AD)大鼠的蛋白表达及其功能研究

【立论依据】 阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease, AD)也称老年痴呆症,是发生在老年人的一种中枢神经系统退行性疾病。临床表现为进行性记忆力丧失、认知功能减退以及人格改变。AD的发病病因和机制至今尚不清楚。瞬时受体电位阳离子通道(TRPC)是一类非选择性Ca²⁺通道,广泛表达于平滑肌细胞、内皮细胞和中枢神经系统,主要维持细胞内、ER和线粒体的Ca²⁺水平。在神经系统,主要参与神经增殖和退行性变。单核苷酸多态性(SNP)研究表明,TRPC4通道参与到阿尔茨海默病的发病中,但目前TRPC通道在阿尔茨海默病动物模型神经组织中的表达和功能机制尚不清楚。 【设计思路】 本项目采用寡聚型Aβ早期AD大鼠模型,对TRPC家族通道在神经系统的表达进行分析,给予TRPC通道激活剂和阻断剂,观察分离神经细胞的钙代谢变化及AD大鼠的行为学改变,探讨TRPC通道在AD发病过程中的作用。 【实验内容】 (1)大鼠海马区注射Aβ寡聚体构建早期的阿尔茨海默病模型;Morris水迷宫检测大鼠的神经元损伤和学习记忆功能障碍及病理学改变。(2) 分离海马区的神经元细胞,利用RT-PCR和蛋白质印迹法检测TRPC家族通道在神经组织中的表达。(3)分离海马区的神经元细胞,给予TRPC通道的激活剂和阻断剂,利用激光扫描共聚焦显微镜技术,检测神经细胞的胞内钙离子浓度变化。(4)给予在体AD大鼠模型TRPC通道的激活剂和阻断剂,观察大鼠的行为学改变。 【材料】 Morris水迷宫设备、激光扫描共聚焦显微镜。 【可行性】 研究室拥有本实验所需的设备和大鼠AD模型制备技术。学生拥有基本的分子生物学实验技能。 【创新性】 目前TRPC通道在阿尔茨海默病动物模型神经组织中的表达及其功能机制尚不清楚,未见有相关报道;试验结果可以为以TRPC通道为靶点的阿尔茨海默病的药物治疗提供理论基础。     

TPRC3通道对MPP~+所致MN9D细胞损伤的保护作用

目的探讨经典瞬间受体电位通道蛋白(transient receptor potential-canonical channel,TRPC)家族在1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-Methyl-4-phenylpy ridinium ion,MPP+)导致的MN9D细胞毒性损伤中的作用。方法用不同浓度(62.5、125、250、500、1000μmol/L)的MPP+处理MN9D细胞24h,500μmol/L MPP+处理MN9D细胞不同时间(3、6、12、24、36h),建立细胞损伤模型。用RT-PCR的方法检测MN9D细胞中内源性TRPC的表达情况;500μmol/L MPP+作用于MN9D细胞,以Western blot法检测MN9D细胞内源性TRPC表达的变化;构建GFP与TRPC3-GFP腺病毒载体,转染到MN9D细胞中,以四甲基偶氮唑盐比色法(methods the tetrazolium,MTT)的方法检测过表达的TRPC3对MPP+引起的MN9D细胞损伤的保护作用。结果500μmol/LMPP+处理MN9D细胞6h就可以显著降低细胞内TRPC3蛋白水平的表达,但对TRPC6的表达无影响。过表达TRPC3能够保护MN9D细胞免受MPP+的毒性损伤。结论MPP+特异性地降低MN9D细胞TRPC3蛋白水平,过表达TRPC3可以抑制MPP+引起的MN9D细胞损伤。这种现象提示TRPC3通道可能参与了帕金森病发病的分子机制。     

瞬时受体电位阳离子通道6作为疾病治疗靶点研究进展

瞬时受体电位阳离子通道6(TRPC6)在肾、心脏和肺等多个器官均有表达,是构成细胞膜钙库操纵性通道的分子基础,在细胞信号转导中起着重要作用。其基因突变或过量表达可引起细胞内钙离子信号通路异常,使得大量钙离子内流,导致机体各种病理生理过程的变化。通过特异性TRPC6通道抑制剂和RNA干扰技术干预其在相关疾病中的过量表达,可以改善或缓解病情,提示TRPC6可能作为疾病治疗的新靶点。本文就近年来关于TRPC6作为疾病治疗靶点的研究进展进行综述。     

RNA干扰瞬时受体电位阳离子通道1表达抑制缺氧诱导的胶质瘤血管内皮生长因子上调的实验研究

目的探讨瞬时受体电位阳离子通道1（TRPCI）是否参与缺氧诱导的胶质瘤细胞血管内皮生长因子（VEGF）表达。方法通过RT-PCR和钙图检测技术观察U87细胞上表达的TRPC亚型;采用RNAi技术、real-timeRT-PCR、免疫印迹和ELISA方法,在基因和外分泌蛋白水平观察TRPCI对缺氧U87细胞VEGF表达的影响。结果U87胶质瘤细胞表达TRPCI,TRPC3,TRPC4和TRPC5亚型。TRPC通道激动剂OAG增加了胞内Ca^2＋浓度,而TRPC通道阻断剂2-APB可抑制激动剂诱导的胞内Ca^2＋浓度增加。化学合成的siRNA-1,siRNA-2和siRNA-3分别减少TRPCI mRNA到64％,39％和36％（P〈0．01）;分别减少TRPCI蛋白到48％。29％和33％（P〈0．01）。siRNA-2和siRNA-3显著抑制了缺氧诱导的VEGF基因上调（P〈0．01）。同时缺氧U87细胞VEGF蛋白的分泌亦受到抑制（P〈0．01）。结论U87胶质瘤细胞表达功能性的TRPC通道,TRPCI参与缺氧诱导的胶质瘤VEGF表达。     

缺血再灌注后脑组织中TRPC4 mRNA水平的变化

目的　在建立的大鼠大脑中动脉阻塞性脑缺血 (MCAO)模型上 ,观察脑组织不同部位瞬间受体电位通道蛋白 4 (TRPC4 ,TransientReceptorPotentialChannel 4 )mRNA表达的变化 ,以说明TRPC4可能参与缺血后再灌注引起的神经细胞损伤。方法　动物分为缺血后再灌注 6h、12h、1d、3d及假手术对照组 ,断头取脑后分别提取纹状体、海马及皮层各部位的总RNA ,采用逆转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)一步法 ,并以 β actin为内参 ,检测TRPC4mRNA的表达。结果　结果显示 ,TRPC4mRNA在纹状体、海马中有强表达 ,而在皮层中有弱表达。缺血组同侧纹状体TRPC4mRNA表达与对照组相比显著增加 (P <0 .0 0 5 ) ,其中 12h组同侧达到最高 ;在海马区 ,结果与纹状体完全相似 (P <0 .0 0 0 1)。结论　TRPC4为Ca2 通道蛋白 ,在脑缺血时 ,TRPC4mRNA随之出现变化 ,提示可能与急性期脑损伤有一定关系     

地塞米松拮抗脂多糖对TRPC6表达及足细胞损伤的影响

目的观察脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）诱导足细胞（podocyte,PC）瞬时受体电位阳离子通道蛋白6（transient receptor potential cation channel 6,TRPC6）表达及胞内Ca2＋浓度的变化,探讨地塞米松（dexamethasone,DEX）对TRPC6及Ca2＋变化的影响。方法体外分化培养的永生化小鼠PC随机分为：1对照组;2LPS组;3DEX组;4LPS＋DEX组。Fura-2/AM负载检测细胞内Ca2＋浓度,Annexin V-FITC/PI标记流式细胞测定PC的凋亡百分率,免疫荧光染色及半定量分析骨架蛋白F-肌动蛋白分布及数量,Western blotting检测足细胞TRPC6、nephrin及desmin蛋白的表达。结果1对照组、DEX组、LPS组、LPS＋DEX组PC Ca2＋荧光强度变化分别为15.6±6.1、17.8±6.5、116.2±15.4、57.2±13.6;凋亡百分率分别为（0.44±0.24）%、（0.45±0.18）%、（2.28±0.36）%、（1.78±0.33）%;F-肌动蛋白平均荧光强度分别为925±136、924±148、217±44.4、634±71.9;TRPC6蛋白的表达分别为0.33±0.09、0.36±0.08、0.81±0.13、0.61±0.12;nephrin表达为1.14±0.15、1.10±0.15、0.39±0.11、0.68±0.10;desmin表达为0.32±0.05、0.38±0.04、1.01±0.15、0.84±0.14。2与对照组及DEX组相比,LPS组足细胞Ca2＋浓度增加,凋亡百分率增加,F-肌动蛋白减少,TRPC6、desmin表达增加,nephrin表达降低。3与LPS组相比,LPS＋DEX组足细胞Ca2＋浓度及凋亡百分率降低,F-肌动蛋白增加,TRPC6、desmin表达下调,nephrin表达上调。结论 DEX拮抗LPS引起足细胞TRPC6高表达及细胞内Ca2＋水平增加,对足细胞有保护作用。     

TRPC_3参与缺氧诱导人脐静脉血管内皮细胞凋亡

目的:探讨瞬时受体电位通道蛋白3(TRPC3)在缺氧诱导人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)凋亡中的作用。方法:采用HUVECs细胞株,复苏传代后计数稀释,接种于6孔培养板中,实验组分为常氧对照组(5%CO2+95%空气)和缺氧组(1%O2+5%CO2+94%N2),处理24h后,应用实时荧光定量RT-PCR法及WesternBlot法检测TRPC3mRNA和蛋白水平的表达变化。构建靶向TRPC3基因的siRNA和无关序列质粒表达载体,分别转染至HUVECs,缺氧处理后再用四甲基偶氮唑盐比色法(Methods the tetrazolium,MTT)检测各组细胞存活率,Hoechest33342荧光染色观察细胞凋亡。结果:缺氧处理24h,HUVECs中TRPC3mRNA和蛋白表达明显升高,细胞存活率为67.4%,与常氧对照组有显著性差异(P<0.05);缺氧+TRPC3干扰组细胞存活率为92.7%,与缺氧组有显著性差异(P<0.05);缺氧+TRPC3假干扰组与缺氧组无显著性差异(P>0.05)。荧光显微镜下观察,常氧对照组胞核均匀蓝染;缺氧处理组和缺氧+TRPC3假干扰组胞核明显固缩、凝聚,可见凋亡小体;而缺氧+TRPC3干扰组胞核均匀蓝染。结论:TRPC3参与缺氧诱导HUVECs凋亡。     

规范瞬时受体电位离子通道对血管重构的作用机制及研究进展

 规范瞬时受体电位离子通道（canonical transient receptor potential channel,TRPC）对钠和钙离子具有通透性。各种TRPC同聚体或异聚体复合物调节着血管中平滑肌和内皮细胞的诸多生理功能,它们的异常表达通常与高血压、内皮通透性增加等疾病的发生相关,是导致血管重构的重要分子基础。因此,研究TRPC在血管重构过程中的作用,能够为疾病的治疗提供新思路。     

TRPC通道阻滞剂SKF96365调节人血管内皮细胞内游离钙离子浓度

新生血管形成在肿瘤的形成与转移中起重要作用.通过干扰血管形成来抑制肿瘤已成为临床生物治疗策略\[1-2\],其中血管内皮细胞生长因子(VEGF)单克隆抗体贝伐单抗(bevacizumab,商品名Avastin),已被美国食品药品监督管理局(FDA)批准为大肠癌肝转移的临床治疗一线用药\[3\].在VEGF的胞内信号转导过程中,Ca2 作为第二信使分子,其浓度变化,可以通过下游的信号途径使多种相关酶的活性改变,促进内皮细胞的增殖与分化,调节新生血管形成\[4-5\].为了明确一种新的钙通道蛋白瞬间受体电位通道C亚家族(TRP-canonical, TRPC)是否参与VEGF的调节过程,本研究选用TRPC3、6、7通道的阻滞剂SKF96365观察其对血管内皮细胞内游离钙离子浓度的影响.     

成骨细胞钾离子通道研究进展

成骨细胞是一种由骨髓间充质干细胞分化而来的细胞,它也表达电压门控钾通道、内向整流钾通道、ATP敏感钾通道、双孔钾通道及钙激活钾通道,其功能涉及骨重塑、信号转导以及成骨细胞增殖和凋亡。成骨细胞膜上表达多种钾离子通道并具有重要生理功能,其可能在各种骨疾病(如骨肿瘤)中扮演重要角色。现就成骨细胞钾离子通道的研究进展,存在的问题及进一步研究方向予以综述。     

酸敏感性离子通道及相关疾病

酸敏感离子通道(ASICs)是一类由胞外H+激活的阳离子通道,对Ca2+或Na+具有通透性,分布亦具有特异性。目前已发现的7个ASICs亚基在视觉、学习记忆、树突发育等过程中有重要的生理作用。同时,它们还参与某些病理反应,与缺血性脑损伤、腰椎间盘突出症、肿瘤、类风湿性关节炎、心绞痛、癫痫等疾病密切相关,并为这些疾病的治疗提供了新的潜在靶标。现就ASICs的结构、生理功能,以及相关的一些疾病进行综述。     

心脏中的T型钙通道

T型钙通道被认为在心脏自律性、细胞生长和心血管重塑中起关键性的作用，一直是研究的热点。目前三种编码T型钙通道的基因已经被确定，但是这些T型钙通道的天然构型尚未被确定。文章从分子结构、功能及调控方面对心脏T型钙通道目前的研究作一综述。     

钙激活钾通道在钙离子致神经细胞损伤中的作用

采用膜片钳单通道记录方法,观察原代培养新生ＳＤ大鼠皮层神经元的钙激活钾通道比（Ｋｃａ）特征及胞内不同游离钙水平对通道开放动力学的调节,结果显示：培养ＳＤ大鼠皮层神经元的Ｋｃａ以大电导活动占优势,胞内游离钙为１０＾－８ｍｏｌ／Ｌ时,通道几乎不开放,在１０＾－６ｍｏｌ／Ｌ时达最大激活。由此表明神经元上Ｋｃａ通道开放概率明显依赖于胞浆中钙离子和膜电位,Ｋｃａ对胞内钙离子浓度变化极为敏感,钾通道的开放剂可     

心肌细胞中的钙火花

细胞离子钙是最普遍、最重要的第二信使之一,参与包括肌肉收缩、突触传递、激素分泌、基因转录以及细胞分裂、受精、代谢和凝血等多种生理过程.对心肌细胞来说,离子钙将电活动与收缩联系起来,即介导细胞的兴奋-收缩耦联.1993年我们首次在激光共聚焦显微镜下发现心肌细胞胞内钙释放的基本单位--钙火花.历经十几年的研究,人们对钙火花和胞内钙信号的本质及兴奋-收缩耦联的微观机理的认识日趋深刻.特别是,新发展起来的非紧密封接膜片钳和激光共聚焦显微镜成像合成技术可以激活单个L型钙通道,通过钙致钙释放机制,诱发钙火花.此文简要介绍心肌细胞中自发和诱发钙火花的研究及其意义,并对有关研究领域的前景作一展望.     

Understanding alternative splicing of Ca_v 1.2 calcium channels for a new approach towards individualized medicine

Calcium channel blockers（CCBs）are widely used to treat cardiovascular diseases such as hypertension,angina pectoris,hypertrophic cardiomyopathy,and supraventricular tachycardia.CCBs selectively inhibit the inward flow of calcium ions through voltage-gated calcium channels,particularly Ca v 1.2,that are expressed in the cardiovascular system.Changes to the molecular structure of Ca v 1.2 channels could affect sensitivity of the channels to blockade by CCBs.Recently,extensive alternative splicing was found in Ca v 1.2 channels that generated wide phenotypic variations.Cardiac and smooth muscles express slightly different,but functionally important Ca v 1.2 splice variants.Alternative splicing could also modulate the gating properties of the channels and giving rise to different responses to inhibition by CCBs.Importantly,alternative splicing of Ca v 1.2 channels may play an important role to influence the outcome of many cardiovascular disorders.Therefore,the understanding of how alternative splicing impacts Ca v 1.2 channels pharmacology in various diseases and different organs may provide the possibility for individualized therapy with minimal side effects.     

TRPM7与肿瘤

瞬时受体电位(transient receptor potential,TRP)通道是位于细胞膜上的一类重要的阳离子通道超家族。TRPM(transient receptor potential melastatin)7是TRPM亚族的一员,是具有离子通道和激酶活性双功能的膜蛋白。它对阳离子有通透性,使细胞去极化,可使自身和底物磷酸化。TRPM7可以介导感觉信号的传递,调节细胞钙镁平衡和影响发育,其表达及活性异常与多种疾病特别是肿瘤的发生具有相关性。TRPM7通道激酶在细胞的增殖、存活、分化、生长和迁移等一系列细胞活动中起重要作用。