结核分枝杆菌Pup、Dop、PafA、Mpa基因重组穿梭表达质粒的构建及鉴定

目的构建结核杆菌泛素样蛋白-蛋白酶体系统中Pup、Dop、PafA和Mpa基因的重组大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMV361/Pup、pMV361/Dop、pMV361/PafA和pMV361/Mpa,并对其进行鉴定。方法提取结核杆菌国际标准强毒株H37Rv基因组DNA,以此为模板PCR扩增Pup、Dop、PafA和Mpa基因编码序列并测序。扩增产物克隆至大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMV361,并转化E.coli DH5α感受态细胞,利用PCR技术、双酶切技术及基因测序技术对构建的重组穿梭表达质粒进行鉴定。结果 PCR扩增的Pup、Dop、PafA和Mpa基因片段分别为213、1 683、1 377、和1 848bp,与预期长度一致;双酶切鉴定Pup、Dop、PafA和Mpa基因均成功插入穿梭表达质粒pMV361,测序显示插入穿梭表达质粒pMV361的Pup、Dop、PafA和Mpa基因序列与GenBank公布的序列一致。结论成功构建了重组大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMV361/Pup、pMV361/Dop、pMV361/PafA和pMV361/Mpa,为进一步研究结核分枝杆菌泛素样蛋白-蛋白酶体系统奠定了基础。     

结核分枝杆菌lhp-esat6融合基因穿梭表达载体的构建及在BCG中的表达

目的　构建能表达结核分枝杆菌早期分泌蛋白CFP10 -ESAT6融合蛋白的重组卡介苗 (recombinantBCG ,rBCG)。方法　以 pQE30 -CFP10 -ESAT6质粒为模板 ,通过PCR扩增 6 33bplhp -esat6基因 ,将该基因定向克隆到穿梭表达载体pJCH0 2中构建重组 pJCH0 2 -CFP10 -ESAT6质粒。用电穿孔法将重组质粒导入BCG菌构建rBCG ,将rBCG培养 2 3天 ,于收菌前 3天每天 4 5℃热诱导 4 5min ,对表达产物作SDS -PAGE及免疫印迹分析。结果　重组质粒 pJCH0 2 -CFP10 -ESAT6经酶切及测序证实构建成功 ,并在BCG中经热诱导成功表达出了具有CFP10及ESAT6抗原性的CFP10 -ESAT6融合蛋白。结论　成功构建能表达CFP10 -ESAT6融合蛋白的重组BCG ,为发展新型结核病疫苗奠定了基础。     

结核分枝杆菌mpt51基因原核表达载体的构建、表达和纯化

目的 构建结核分枝杆菌mpt51基因原核表达载体并进行表达、纯化.方法 用PCR扩增结核分枝杆菌mpt51基因,并克隆入pTA2质粒.测序正确后.再亚克隆人pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):mpt51重组体.结果 以pET30a(+):mpt51转化BL21(DE3)后.经0.4 mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导,重组菌表达出相对分子质量为38 000的重组蛋白.SDS-PAGE分析显示,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导4小时重组蛋白的表达量最高.表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中.表达量占全菌蛋白质的30%.经Ni-NTA树脂纯化,获得纯度为90%的重组蛋白.结论 成功地构建原核表达载体pET30a(+):mpt51,并获得MPT51重组蛋白.为血清学诊断活动性结核病奠定了基础.     

结核分枝杆菌分泌蛋白MPT51在原核表达载体中的克隆、表达、纯化与鉴定

目的对结核分枝杆菌的一种分泌蛋白MPT51的基因进行克隆,表达,纯化与鉴定,为核酸疫苗的研制与应用打下基础。方法以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,用PCR法对编码MPT51蛋白的抗原基因进行扩增,产物克隆到表达载体pET22b中,构建了含mpt51的重组质粒,将此重组质粒先转化到E.coliXLI-Blue内提取质粒,酶切及测序鉴定,再转化入E.coliBL21(DE3)PLysS菌株内,以IPTG进行诱导后,破菌,离心,包涵体经尿素变性溶解后用His·Bind亲和层析柱纯化,透析复性,纯化后蛋白进行SDS-PAGE,通过电转移将胶中蛋白转到硝酸纤维素薄膜上后进行特异性免疫检测。结果电泳发现转化了重组质粒的菌株有蛋白表达,所表达的蛋白质相对分子质量为27800,抗体检测有特异条带,大小为27.8kDa。结论目的基因克隆到了表达载体内并证明表达,重组结核杆菌分泌蛋白MPT51的成功表达为核酸疫苗的研制与应用和免疫效应检测以及上述抗原、抗体的大规模制备打下基础。     

结核分枝杆菌glcB基因原核表达载体的构建、表达和纯化

目的构建结核分枝杆glcB基因原核表达载体,并进行表达,纯化。方法用PcR扩增结核分枝杆菌glcB基因,并克隆入pTA2质粒。测序正确后,再亚克隆入pET30a（＋）质粒,构建pET30a（＋）：glcB重组体。结果以重组体转化BL21（DE3）后,经0．4mM异丙基硫代-β．D．半乳糖苷（IPTG）诱导,表达出分子量为92KD重组蛋白。SDS—PAGE分析显示,IPTG诱导4h重组蛋白的表达量最高。表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中,表达量占全菌蛋白质的50％。经Ni-NTA柱纯化,获得纯度为90％的重组蛋白。结论成功地构建原核表达载体pET30a（＋）：glcB,并获得GIcB重组蛋白,为血清学诊断活动性结核病奠定了基础。     

结核分枝杆菌rv3873基因原核表达载体的构建、表达和纯化

目的构建结核分枝杆菌（M.tb）rv3873基因原核表达载体并进行表达。方法用PCR扩增MTB rv3873基因，并克隆入pGEM-T Easy质粒。测序正确后，再亚克隆入pET30a（＋）质粒，构建pET30a（＋）：rv3873重组体。结果以重组体分别转化DH5α和BL21（DE3）菌后，经0．4mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导，pET30a（＋）：rv3873表达出分子量为47000左右的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示，IPTG诱导4h重组蛋白的表达量最高。表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中，表达量占全菌蛋白质的50％，Western blot证实其具有良好的抗原性。经Ni—NTA柱纯化，获得纯度为90％的重组蛋白。结论成功地构建原核表达载体pET30a（＋）：rv3873，并获得PPE68重组蛋白，为辅助诊断结核菌的感染奠定了基础。     

结核分枝杆菌rv3873基因原核表达载体的构建、表达和纯化

目的构建结核分枝杆菌（M．tb）rv3873基因原核表达载体并进行表达。方法用聚合酶链反应（PCR）扩增MTBrv3873基因,并克隆入pGEM～TEasy质粒。测序正确后,再亚克隆入pET30a（＋）质粒,构建pET30a（＋）：rv3873重组体。结果以重组体分别转化DH5a和BL21（DE3）菌后,经0．4mmol／L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导,pET30a（＋）：rv3873表达出相对分子质量为47000左右的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示,IPTG诱导4h重组蛋白的表达量最高。表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中,表达量占全菌蛋白质的50％,Westernblot证实其具有良好的抗原性。经Ni-NTA柱纯化,获得纯度为90％的重组蛋白。结论成功地构建原核表达载体pET30a（＋）：rv3873,并获得重组Rv3873蛋白,为辅助诊断结核菌的感染奠定了基础。     

结核分枝杆菌重组Bb-ESAT-6疫苗的构建、鉴定和表达及其保护力

目的构建和鉴定结核分枝杆菌(MTB)重组双歧杆菌(Bifidobacteria bifidum,Bb)-ESAT-6疫苗,研究该疫苗对鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。方法以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到ESAT-6抗原编码基因;将该基因定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-ESAT-6;用电穿孔法将该质粒导入Bb及BL21(DE3),构建结核分枝杆菌重组Bb-ESAT-6疫苗。用IPTG诱导重组BL21(DE3)菌表达ES-AT-6/GST融合蛋白;SDS-PAGE及Western blot对表达产物进行鉴定。65只BALB/c雌性小鼠,随机分为5组:A组(SC)、B组(IM)、C组(IN)、D组(Bb)、E组(PBS)。分别于免疫后8周用5×105CFU MTB H37Ra减毒株悬浮于10μL PBS中进行鼻腔粘膜接种感染。攻击感染后6w剖杀各组小鼠8只,计数肝、肺组织荷菌量,常规ELISA检测血清IgG及其亚类和IgE,MTT法检测特异性脾淋巴细胞增殖。结果PCR成功扩增出288bp的ESAT-6基因;双酶切证实ESAT6基因成功插入pGEX-1λT中;PCR证实rBb-ESAT-6疫苗构建成功。免疫印迹分析发现重组质粒pGEX-ESAT-6的表达产物在相对分子量(35kDa)处有明显的蛋白表达条带,表达效率为20%,且能被活动性结核病人血清特异识别。鼻腔内接种组的肝、肺组织荷菌量明显低于其他免疫组。疫苗接种组IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b明显升高,IgG3和IgE无明显变化;疫苗接种组的脾淋巴细胞明显增殖。结论成功构建了结核分枝杆菌重组Bb-ESAT-6疫苗,重组Bb-ESAT-6疫苗在抗结核分枝杆菌感染过程中具有一定免疫保护作用。     

结核分枝杆菌Rv1246c和Rv1247c基因的重组质粒构建及蛋白表达

目的应用生物信息学方法分析结核分枝杆菌的Rv1246c和Rv1247c所编码蛋白的结构特征,并对其进行克隆和表达。方法利用Bioedit、Dnaman及Pfam等对Rv1246c和Rv1247c所表达蛋白结构进行分析;以结核分枝杆菌H37Rv的基因组为模板,用PCR分别扩增Rv1246c和Rv1247c基因片段,并重组到原核表达载体pET32a( )中,转化E.coliBL21(DH3)菌株,用IPTG诱导蛋白表达。通过SDS-PAGE及Western-blot免疫印迹法检测目的蛋白的表达情况。用纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,间接ELISA检测抗体效价。结果生物信息学分析表明它们与大肠杆菌的relBE家族有相似的蛋白模块,Rv1246c蛋白与大肠杆菌RelE同源性是21.55%,Rv1247c同源性是23.85%;两个重组质粒构建成功;通过SDS-PAGE检测分别在31kD和29kD处有特异性条带;Western-blot免疫印迹出现特异性阳性信号;间接ELISA检测多克隆抗体效价均大于1:40 000。结论本研究首次成功构建了结核分枝杆菌的Rv1246c和Rv1247c的原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了Rv1246c和Rv1247c蛋白,为进一步研究该组基因的分子功能奠定了良好基础。     

结核分枝杆菌MPT-64分泌蛋白在原核表达载体中的克隆,表达与鉴定

目的　对结核分枝杆菌的一种分泌蛋白MPT - 6 4基因进行克隆 ,鉴定与表达 ,为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测打下基础。方法　以结核杆菌H3 7Rv株基因组DNA为模板 ,用PCR法对基因MPT - 6 4进行扩增 ,产物与载体质粒pGEX - 4T - 1构建表达MPT - 6 4的重组质粒 ,将此重组质粒先转化到E coliDH5α内抽提质粒 ,酶切检验 ,再转化入表达宿主E coliBL2 1(DE3)PLysS菌株内 ,对转化菌株以IPTG进行诱导后 ,破菌 ,离心 ,上清进行SDS -PAGE ,通过电转移将胶中蛋白转到硝酸纤维素薄膜上后进行免疫染色 ,一抗为结核分枝杆菌菌株H37Rv羊抗阳性血清。结果　电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白 ,所表达的蛋白质相对分子质量为 5 0 0 0 0 ,抗体检测有特异带大小为 5 0kDa。结论　目的基因克隆到菌株内 ,重组结核杆菌分泌蛋白MPT - 6 4的成功表达为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测以及上述抗原、抗体的大规模制备打下基础     

结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64单克隆抗体的制备及其特异性

目的 制备结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)分泌蛋白MPT64的单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb),并分析mAb的特异性。方法 PCR扩增mpt64基因并克隆入pET28a(+)构建原核表达载体;将获得的重组菌株在IPTG作用下诱导表达MPT64蛋白,Western blot验证蛋白表达;亲和层析法纯化目的蛋白。重组MPT64蛋白免疫小鼠,取脾细胞与杂交瘤细胞SP2/0融合,筛选得到阳性杂交瘤细胞系。以该杂交瘤细胞制备小鼠腹水,中压液相色谱仪纯化腹水获得mAb。ELISA法检测获得的mAb的相对亲和力和亚类,Western blot检测mAb的特异性。结果 本研究成功构建原核表达载体pET28a(+)-mpt64并诱导表达了MPT64蛋白。亲和层析法获得纯化的重组MPT64蛋白。该重组蛋白免疫小鼠的脾细胞和SP2/0细胞融合后,经筛选获得能够稳定分泌抗MPT64 mAb的杂交瘤细胞系MPT64-A5B2。中压液相色谱仪纯化小鼠腹水中的MPT64-A5B2 mAb。该mAb的亲和力为2.813×10^-7 g/mL,属于IgG 1亚类。MPT64-A5B2 mAb能特异性识别Mtb中的MPT64蛋白。结论 本研究制备了MPT64重组蛋白,并获得了抗MPT64 mAb,为MPT64用于结核病诊断和治疗制剂的研制奠定了基础。     

结核分枝杆菌MPT64在毕赤酵母中的分泌表达

目的克隆结核分枝杆菌MPT64基因全长,构建毕赤酵母分泌型表达载体,获得表达MPT64的重组毕赤酵母工程菌。方法利用PCR技术扩增MPT64基因克隆到毕赤酵母分泌表达载体pPICZotA中;将正确的表达载体线性化后,电击导人到毕赤酵母GS115中,Zeocin^TM抗性筛选正确的重组子;SDS—PAGE及Western-blot鉴定分泌表达MPT6d的重组毕赤酵母。结果克隆获得了正确的MPT64酵母分泌表达载体,并获得了相应的重组酵母株,该重组子经甲醇诱导培养后能分泌大小约30kDa的蛋白,该蛋白能特异地与His抗体结合。结论本实验获得了酵母重组的结核杆菌MPT64蛋白,为探讨其生物学性能和临床上的应用奠定了实验基础。     

结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的　构建结核分枝杆菌早期分泌蛋白Ag85B和MPT6 4融合基因 (AM )及其原核表达质粒并进行表达。方法　采用 geneSOEing法将ag85b和mpt6 4用疏水甘氨酸接头 (Gly4Ser) 3 融合 ,经限制性内切酶切后克隆入原核表达载体pET32a中 ,进行酶切、PCR鉴定和DNA序列测定。将重组质粒转染Ecoli BL2 1,经过IPTG诱导后其表达产物进行SDS -PAGE和免疫印迹分析。结果　AM融合基因定向克隆入 pET32a中 ,双向测序验证碱基突变率为 0 11% (2 / 170 7) ,均为无意义突变。SDS -PAGE和免疫印迹分析结果均显示在约 73kDa的位置可见明显的蛋白条带。结论　成功地构建了ag85b -mpt6 4融合基因及其原核表达质粒 ,重组质粒能够在大肠杆菌在中表达。     

结核分枝杆菌MPT64蛋白的表达、纯化及初步应用

目的　获得重组MPT64蛋白,研究其免疫学特性,评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法 应用基因工程技术表达、纯化MPT64蛋白,通过Westernblotting分析其抗原性。分别以结核分枝杆菌PPD或纯化的rMPT64蛋白为抗原,通过ELISA方法及结核病一步法检测血清中抗结核抗体。结果 重组质粒pET15b MPT64测序表达除83位密码子由CCA突变为CCG外,其余密码子均与报道的相同,但其氨基酸序列无变化。它在大肠杆菌BL21 (DE3)细胞内以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的20～30%,分子量约26kDa,Westernblotting分析它与抗结核分枝杆菌多克隆抗体具有良好的免疫反应性。纯化后的rMPT64样品经SDS PAGE和光密度扫描分析表明其纯度约为80%左右,每100ml培养菌可获得10mg左右的重组蛋白。以33例正常人血清的OD值 +2S为正常界限值,PDD的特异性和敏感性分别为94% (31/33)、63.7% (21/33)、66.7%;rMPT64纯化蛋白分别为94% (31/33)、30.3(10/33);一步法分别为88% (29/33)、66.7% (22/23)。结论 pET15b MPT64大肠杆菌工程菌能以包涵体形式高效表达重组MPT64蛋白,该蛋白具有较高的抗原特异性和免疫反应性。rMPT64纯化蛋白有可能成为结核病血清学诊断的组合抗原之一。     

结核分枝杆菌MPT64抗原DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答

目的研究结核分枝杆菌MPT64抗原DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答。方法用表达MPT64的真核表达质粒pcDNA-M免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测免疫小鼠的特异性抗体滴度和抗体亚类。分离免疫小鼠的脾淋巴细胞,检测淋巴细胞增殖、IFN-γ和IL-12产生水平、流式细胞仪计CD4+细胞和CD8+细胞数、脾淋巴细胞特异性CTL杀伤效应。结果MPT64基因免疫可诱导小鼠高水平的体液免疫应答,免疫小鼠脾淋巴增殖显著,IFN-γ和IL-12含量增加,CD4+细胞和CD8+细胞百分比明显增加,CTL杀伤效应明显。结论MPT64 DNA疫苗可诱导小鼠有效的体液和细胞免疫应答,有可能作为新型TB疫苗的组分。     

结核分枝杆菌MPT64蛋白适配子的筛选与鉴定

目的 利用指数富集配体系统进化(SELEX)技术筛选能与结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64特异性结合的寡核苷酸适配子,寻找早期诊断结核病的方法.方法 体外合成随机单链DNA(ssDNA)文库,以MPT64蛋白为靶物质,采取SELEX技术进行12轮筛选,将适配子库克隆、测序后,用DNAMAN软件对其结构进行分析,经生物素-链亲和素-辣根过氧化物酶显色系统测定亲和力,并利用捕获适配子与检测适配子组成的"三明治"夹心法对获得的适配子进行初步验证.将13个非结核分枝杆菌菌株和BCG菌株作为阴性组计为0,将结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌组作为阳性组计为1,采用MedCalc软件分析受试者操作特征曲线,确定最佳阳性判定值,并构建散点图.结果 经12轮筛选后,随机挑选15个适配子与MPT64蛋白的亲和性进行分析,吸光度值为0.492～1.243,73.3％的适配子的吸光度值在1.0以上;二级结构分析显示,适配子与MPT64蛋白亲和性的基础主要是大口袋茎环结构,口袋与环之间的茎桥含有不同数量的GC碱基对;"三明治"夹心法对阴性组[非结核分枝杆菌标准菌株及卡介苗(BCG)株]和阳性组(结核分枝杆菌实验室H37Rv株及临床株、牛结核分枝杆菌标准株)共47个菌株培养上清的检测结果显示,在临界(cut-off)值为0.61时,H37Rv、牛结核分枝杆菌组为阳性,BCG株为阴性;阴性组标本的阴性检出率为85.7％,阳性组标本的阳性检出率为87.9％,表现出一定的检测价值.结论 已初步筛选到与MPT64蛋白具有高亲和性的DNA适配子.     

三种结核分枝杆菌分泌蛋白的抗体制备及其在抗原检测中的应用

目的制备结核分枝杆菌CFP10-ESAT-6、MPT64和MPT63-MPT70重组蛋白抗体，探讨其在检测结核抗原中的应用价值。方法应用重组蛋白CFP10-ESAT-6、MPT64和MPT63-MPT70免疫血清，制备包被抗体和标记抗体，建立检测3种蛋白的双抗体夹心法，并将其用于17种分枝杆菌培养上清液和341份临床血清标本的检测。结果CFP10-ESAT-6的最低检出浓度为25ng／mL，MPT64和MPT63-MPT70均为50ng／mL。CFP10-ESAT-6检测17种分枝杆菌培养上清液，只有结核分枝杆菌为阳性；而MPT64和MPT63-MPT70检测除结核分枝杆菌阳性外，还各有5种非结核分枝杆菌培养上清液为阳性结果。CFP10-ESAT6、MPT64和MPT63-MPT70检测165例临床诊断的肺结核患者血清标本阳性率分别为33．9％、41．2％和47．9％；检测112例非结核患者血清标本的假阳性率分别为1．8％、7．1％和10．7％；检测64例健康对照的假阳性率分别为0、3．1％和7．8％。结论CFP10-ESAT-6、MPT64和MPT63-MPT70重组蛋白制备的抗体检测血清标本结核抗原的阳性率均不高，但特异性较好。     

结核分枝杆菌rHpsX-MPT64融合蛋白的制备与临床应用

目的 构建结核分枝杆菌融合基因hpsX-mpt64原核表达系统,建立基于rHpsX-MPT64为包被抗原酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)并对其用于结核患者血清学诊断的敏感性和特异性进行评价。方法 PCR扩增并克隆结核分枝杆菌hpsX和mpt64基因,以连接引物PCR构建hpsX-mpt64人工融合基因,建立上述目的基因原核表达系统。采用SDS-PAGE检测目的重组蛋白rHpsX、rMPT64和rHpsX-MPT64表达情况,Ni-NTA亲和层析法提纯上述目的重组蛋白,Western Blot检测其免疫性。分别以rHpsX、rMPT64和rHpsX-MPT64为包被抗原,建立相应ELISA检测150例健康人群、73例非结核肺部疾病患者和277例活动性肺结核患者血清标本中抗体。结果 克隆的hpsX和mpt64及构建的hpsX-mpt64融合基因与GenBank中相关序列相似性为100%。rHpsX、rMPT64和rHpsX-MPT64表达量分别为细菌总蛋白的20.3%、28.5%和26.5%,其提纯物电泳后均显示单一条带。基于rHpsX、rMPT64和rHpsX-MPT64为包被抗原的ELISA对涂阳患者血清抗体检出率明显高于涂阴患者(P<0.01),检测活动性结核患者血清抗体的敏感性分别为59.2%、61.4%和74.4%,特异性分别为90.6%、83.9%和91.0%,rHpsX-MPT64为包被抗原敏感性明显高于rHpsX和rMPT64抗原(P<0.01)。结论 基于rHpsX-MPT64为包被抗原的ELISA有较高的敏感性和特异性,重组融合蛋白为抗原有助于进一步提高检测结核病血清学诊断的敏感性。