志贺菌敏感株诱导耐药与marOR基因突变关系

目的对志贺菌敏感株进行诱导使其耐多药,研究其诱导耐药前后marOR基因的差异。方法用4类抗生素的次抑菌浓度对临床分离鉴定的志贺菌敏感株进行诱导耐多药试验。对志贺菌敏感株及诱导耐多药株的marOR基因进行聚合酶链反应(PCR)扩增后,测序比较其诱导耐药前后marOR基因序列的差异。结果成功获得志贺菌诱导耐多药株,命名为YD株;其最小抑菌浓度(MIC)分别为初始菌株的6～8倍;该诱导耐药株对庆大霉素、诺氟沙星、磺胺甲基异恶唑、头孢噻吩等均耐药;测序结果发现诱导耐药株marOR基因YD株有6个位点出现突变,其中5个为同义突变,1个为错义突变(1630位点A→G,赖氨酸→精氨酸)。结论 marOR基因的突变可能是志贺菌诱导耐药的调控机制之一。     

志贺菌诱导耐药相关基因序列分析

目的获取并分析志贺菌由抗生素诱导产生的耐多药相关基因序列。方法以志贺菌敏感株(Z23)和诱导株(YD)基因组DNA为模板,利用引物设计软件Primer 5.0根据已测得基因序列(Y16B3、Y16B8和Y16A11)设计引物,PCR扩增诱导耐多药相关基因并将相关基因克隆到pMD19-T载体上,测序并将结果在序列相似性搜索工具Blast上检索分析相关基因序列。结果Y16B3和Y16B8基因片段分别在诱导株中扩增出320和225 bp产物,在敏感株中未扩增出;而Y16A11基因片段在诱导株扩增出310 bp产物,在敏感株中扩增出554 bp产物,并且产物序列同源性极低。结论志贺菌在抗生素诱导下产生的耐多药株与敏感菌株比较,具有基因组差异。     

志贺菌耐多药相关基因水平转移研究

目的 验证志贺菌耐多药相关基因水平转移及对该基因的位置进行初步判定.方法 培养已筛选出的包含耐多药差异基因片段阳性克隆,提取其质粒,PCR扩增其耐多药差异基因片段、纯化、制备探针,与志贺菌敏感株Z23、耐多药大肠埃希菌E.667、转移株的基因组DNA、质粒进行斑点杂交.结果 该耐多药差异基因片段制备的探针与耐多药大肠埃希菌、敏感株、转移株的基因组DNA、质粒进行杂交后,转移株、耐多药大肠埃希菌的全基因组及质粒均有杂交信号,与Z23的全基因组、质粒均没有杂交信号.结论 此耐多药相关基因片段在液体结合实验中由耐多药大肠埃希菌水平转移给志贺菌敏感株,根据斑点杂交结果可判断其存在于耐多药大肠埃希菌和转移株的质粒中.     

志贺菌对喹诺酮类药物耐药分子机制的研究

目的 研究志贺菌对喹诺酮类药物耐药性及其耐药基因gyrA和parC的变异。方法对73株临床分离的志贺菌及标准株51573进行吡哌酸(PI)、氧氟沙星(OFL)、诺氟沙星(NOR)、环丙沙星(CIP)4种药物的药敏试验,对其DNA旋转酶gyrA基因、拓扑异构酶ⅣparC基因N末端编码区分别进行聚合酶链反应(PCR)扩增后,对grA基因进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析,对parC基因进行RFLP及单链构象多态性(SSCP)分析。结果 标准株51573对4种喹诺酮类药物均敏感;73株临床分离的志贺菌属细菌对PI、CIP、NOR、OFL的耐药率分别为79.5％、60.3％、41.1％和36.9％;67株(91.8％)菌株对喹诺酮类药物敏感性降低,其中gyrA基因突变率为91％,parC基因突变率为7.5％,6株临床敏感株及标准株51573均未检测出以上两基因突变。结论 志贺菌对喹诺酮类药物耐药严重;靶基因突变是其耐喹诺酮类药物的主要机制之一,以DNA旋转酶gyrA基因突变为主,拓扑异构酶ⅣparC基因突变次之。     

志贺菌敏感株与基因转移耐多药株蛋白组学分析

目的 对志贺菌敏感株与基因转移耐多药株全菌蛋白进行蛋白质组比较,寻找细菌耐多药相关蛋白.方法 采用接合基因转移实验对临床分离鉴定志贺菌敏感株进行基因转移耐多药试验;并对志贺菌敏感株及基因转移耐多药株全菌蛋白进行双向电泳;电泳图谱采用Image Master 2D Platinum软件分析,并对差异表达蛋白进行基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MOLDITOF-TOF)分析.结果 成功获得志贺菌基因转移耐多药株,在志贺菌敏感株与耐多药株全菌蛋白质图谱中分析别检出(946±37)和(1 013±157)个蛋白质斑点;经分析共发现43个差异表达的蛋白点,初步对其中7个差异表达蛋白进行质谱鉴定,基因转移耐多药株中发现2个新出现的耐多药相关蛋白分别为成簇插入的DNA重复序列(CRISPR)相关蛋白及Hsp60的分子伴侣蛋白(Groel-Groes-Adp7);ATP结合盒(ABC)转运蛋白、胱氨酸合成酶、预测的胞浆脂蛋白表达量上调;翻译延长因子Tu及DNA单链结合蛋白表达量下降.结论 对7个耐多药相关蛋白鉴定分析表明,供体菌中一些耐多药相关基因通过基因转移方式插入志贺菌敏感株中并大量表达,同时一些在细胞代谢中起重要作用的酶类表达量上调,ABC转运蛋白在志贺菌基因转移耐多药机制中也起重要作用.     

志贺菌敏感株与诱导耐多药株蛋白质组学分析

目的对志贺菌敏感株与诱导耐多药株全菌蛋白进行蛋白质组学比较，寻找细菌耐多药相关蛋白。方法采用4类抗生素的次抑菌浓度，对临床分离鉴定的志贺菌敏感株进行诱导耐多药试验；对志贺菌敏感株及诱导耐多药株全菌蛋白进行双向电泳；电泳图谱采用ImageMaster2DPlatinum软件分析；差异表达蛋白进行基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MOLDITOF-TOF质谱）分析。结果成功获得志贺菌诱导耐多药株，在志贺菌敏感株与耐多药株全菌蛋白质图谱中分别检测出（946±37）个和（1096±189）个蛋白质斑点；共发现48个差异表达的蛋白点，其中5个质谱鉴定为ABC转运蛋白、谷胺酰转肽酶、天冬氨酸氨甲酰基转移酶、翻译延长因子Tu、单链DNA结合蛋白；其中前3个蛋白中在耐多药株中表达量增强，后2个减弱。结论5个耐多药相关蛋白中在细胞代谢中起重要作用的酶类表达量上调；ABC转运蛋白在志贺菌诱导耐多药机制中起重要作用。     

福建省46株耐多药结核分枝杆菌katG基因突变特征研究

目的:了解福建省耐多药结核分枝杆菌临床分离株katG基因的突变特点,为建立适合我省快速检测异烟肼耐药方法提供参考。方法:对福建省9个监测点进行耐药性调查,收集菌株经菌种鉴定、药物敏感性试验。选取46株耐多药结核分枝杆菌和15株全敏感株,扩增katG高突变区域的基因片段,测序后比对分析。结果:15株全敏感株未检测氨基酸突变。46株耐多药结核分枝杆菌katG基因的突变率为80.43%,katG 315的突变率为54.35%,联合突变率为52.17%。结论:福建省耐多药结核分枝杆菌杆不同耐药谱katG基因突变率不同,最常见的点突变发生于315位,463位具有等位基因多态性。     

志贺菌属非典型1类整合子与耐多药关系

目的研究志贺菌属中非典型1类整合子的分布及其与耐多药性的关系。方法对实验室保存的90株志贺菌属进行8种抗生素药敏实验,针对非典型1类整合子的耐药基因盒区域设计引物进行聚合酶链反应(PCR)扩增和限制性片段长度多态性(RFLP)分析,对代表性菌株进行测序分析。结果 90株志贺菌属中有86株(95.6%)对≥3种抗生素耐药;有66株(73.3%)对氨苄青霉素(AMP)、四环素(TET)和氯霉素(CHL)联合耐药;非典型1类整合子分布于65株(72.2%)志贺菌属中;RFLP分析结果表明,所有酶切产物的带型均一,测序分析发现序列为blaoxa-30-aadA1;非典型1类整合子阳性菌株对AMP-TET-CHL联合耐药率(81.5%)高于阴性菌株(52.0%),经双侧χ2检验发现差异有统计学意义(P<0.05)。结论志贺菌属非典型1类整合子阳性与其对AMP-TET-CHL联合耐药有关,可能参与耐多药性的形成。     

主动外排系统acrAB在志贺菌中分布和表达

目的研究志贺菌患者分离株的多重耐药机制。方法检测志贺菌中有无主动外排系统acrAB-tolC结构基因acrAB-tolC在临床分离菌株中的分布;Northern-blots测定acrAB-tolCmRNA表达水平。结果所有志贺菌分离株染色体中均发现有acrAB-tolC基因,未发现acrAB-tolC基因缺失株;发现4株多重耐药株acrA基因实变,1株敏感野生tolC基因突变,未发现acrB基因突变株。多重耐药株acrA基因mRNA水平显著高于敏感野生株(P<0.05),acrB基因和tolC基因mRNA水平与敏感野生株差异无统计学意义(P>0.05)。结论主动外排系统acrA基因高表达导致临床分离志贺菌产生多重耐药性;acrAB-tolC的表达可能受多种耐药操纵子调控。     

耐喹诺酮类福氏志贺菌基因突变分析

目的研究福氏志贺菌DNA旋转酶gyrA基因、拓扑异构酶ⅣparC基因突变与其喹诺酮类药物耐药的关系.方法对临床收集的1株喹诺酮类药物敏感福氏志贺菌、2株喹诺酮类药物耐药程度不同的福氏志贺菌,对上述2个靶基因进行聚合酶链反应(PCR)扩增及核酸序列分析.结果首次发现临床分离喹诺酮类耐药福氏志贺菌parC基因突变,导致121,129,131,134,141,L51位5个位点氨基酸编码改变;耐药程度较高的菌株共发现gyrA、parC基因上6个突变位点,耐药程度较低的菌株发现gyrA基因1个突变位点.结论福氏志贺菌DNA旋转酶gyrA基因和拓扑异构酶ⅣparC基因突变均与其喹诺酮类药物耐药有关,靶基因突变位点数量可能与喹诺酮类药物耐药程度有关,临床耐药株靶基因突变存在多态性.     

福建省耐多药结核分枝杆菌相关耐药基因突变特征分析

目的分析福建省耐多药结核分枝杆菌耐药相关基因rpoB、katG和rpsL的突变特征,为建立快速分子药敏方法提供科学依据。方法收集监测点的痰培养分离菌株进行菌种鉴定、药物敏感性试验。选取46株耐多药结核分枝杆菌和15株全敏感株,扩增rpoB、katG和rpsL的基因片段,测序,比对分析。结果全敏感株rpoB和rpsL基因未检测到突变。耐多药菌株rpoB、katG和rpsL基因的突变率分别为91.30%,80.43%,30.43%。耐多药菌株三个基因的突变率均高于全敏感株的突变率,差异均有统计学意义(χ2值分别为46.67,4.29和11.58,P均<0.05)。katG、rpoB基因同时存在突变的耐多药菌株占80.43%,三个耐药基因均有突变的耐多药菌株占30.43%。结论福建省耐多药结核分枝杆菌的常见突变位点为rpoB531和rpoB526,katG315,rpsL43。     

耐喹诺酮类大肠埃希菌耐药机制的研究

目的探讨耐喹诺酮类大肠埃希菌的耐药机制。方法收集天津市第一中心医院2004年3月-2005年10月临床分离的大肠埃希菌,并随机选取40株作为研究对象,通过K-B药片试纸法和微量稀释法测40株目的菌株的耐药性;PCR扩增耐药株的gyrA QRDR区和parC基因,进行PCR-SSCP分析;同时,PCR扩增marOR基因,在耐药株中随机选取进行测序,检测marOR基因突变情况。结果37株对耐喹诺酮类菌株均出现了gyrA基因突变,除常见氨基酸改变外,还发现Asp87→Asn、Ala84→Pro;36株耐喹诺酮菌株发生了parC基因突变,只对萘啶酸耐药,对环丙沙星中介、氧氟沙星、加替沙星敏感的ECO24未出现parC基因突变;只对氟喹诺酮类耐药的ECO11未出现marOR区突变;存在多重耐药的ECO5 marOR区发现6处突变,且1 879 bp处的突变改变了marOR的终止密码子。结论gyrA和parC基因突变引起大肠埃希菌产生耐药,gyrA基因突变是产生对氟喹诺酮类耐药的主要原因,parC基因突变可引起菌株对氟喹诺酮类药物的高水平耐药,marOR的多位点突变在多重耐药机制中有一定的作用。     

志贺菌对喹诺酮类药物的耐药性及其耐药机制

目的调查济南地区志贺菌对喹诺酮类药物的耐药情况,并研究其耐药机制,为临床抗感染治疗提供依据,以指导临床合理用药。方法采用K-B法测定菌株对萘啶酸、环丙沙星和左氧氟沙星3种喹诺酮类药物的敏感性,PCR扩增gyrA、parC和qnr基因,选取部分PCR扩增产物进行DNA测序。结果62株志贺菌对萘啶酸、环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率分别是90.3%、29.0%和6.5%。所有菌株均扩增出了相应gyrA和parC基因产物,未检出qnr基因。耐药株均存在gyrA基因突变和parC基因突变;只对萘啶酸耐药的菌株gyrA基因存在83位氨基酸突变,而对萘啶酸和环丙沙星耐药株中则同时存在83位和87位氨基酸突变;parC基因存在80位SerIle的突变。结论该地区志贺菌对喹诺酮类药物耐药情况严重,而gyrA基因87位氨基酸突变是志贺菌对环丙沙星耐药的重要原因。     

浙江省55株耐多药结核分枝杆菌基因突变特征分析

目的了解浙江省耐多药结核分枝杆菌临床分离株rpo B、kat G、inh A启动子区基因突变特点,为建立本省快速耐多药检测方法提供参考。方法对浙江省第3次结核病耐药监测获得的MDR菌株扩增rpo B、kat G、inh A启动子区域基因测序后比对分析。结果 55株耐多药结核分枝杆菌rpo B、kat G、inh A启动子区域基因的突变率分别为94.6%、65.5%和10.9%,突变类型包括点突变和联合突变。在rpo B基因中,98.1%的突变发生在RRDR区域,最常见的点突变为S531L,占55.8%;在联合突变类型中,本文检测到新的突变类型为N568S+D516Y和较少报导的I561V+S531L。kat G基因突变中最常见的点突变为S315T,占80.6%;在295位点和327位点检测到同义突变。6株菌检测到inh A启动子区突变,主要为C15T突变,占83.3%。结论浙江省耐多药结核分枝杆菌耐药基因突变类型多态性明显,除常见突变类型外,存在一些特殊的突变类型,应进一步加强研究。     

志贺菌对喹诺酮类抗菌药物耐药性及耐药机制研究

目的检测志贺菌对喹诺酮类抗菌药物的耐药情况,探讨染色体介导DNA旋转酶和拓扑异构酶Ⅳ基因突变存在与志贺菌喹诺酮类药物耐药性的相关性。方法用琼脂稀释法对60株志贺菌进行耐药性检测;PCR法检测喹诺酮耐药决定区(QRDR)相关基因gyrA、gyrB、parC、parE,并对其中20株PCR扩增所得的阳性产物进行测序分析;分析志贺菌gyrA、gyrB、parC基因突变与喹诺酮类药物耐药性的关系。结果 60株志贺菌对萘啶酸、诺氟沙星、环丙沙星、左氧氟沙星的耐药率分别为90.0%、35.0%、28.3%和15.0%;测序结果显示gyrA、gyrB、parC基因突变率分别为85%、30%和100%,parE基因未发现突变。结论志贺菌对喹诺酮类耐药严重;靶基因突变是喹诺酮类药物耐药的主要机制之一,以DNA旋转酶GyrA基因突变为主,DNA拓扑异构酶IVparC基因突变次之。     

某院结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药基因特征

目的了解某院结核分枝杆菌(MTB)利福平耐药相关基因rpo B及异烟肼耐药相关基因kat G、inh A的突变特征,为耐药结核病的预防和治疗提供科学依据。方法收集83例结核病患者痰标本,分离培养MTB,采用BD960液体法检测利福平、异烟肼耐药性,提取菌株DNA,采用聚合酶链反应扩增rpo B、kat G、inh A全基因,对扩增产物进行测序分析。结果 83株样本中,39株对利福平耐药,51株对异烟肼耐药。耐利福平菌株rpo B基因突变率为97.44%(38/39),531位点突变率60.53%(23/38),526位点突变率23.68%(9/38),32株出现多位点联合突变。耐异烟肼菌株kat G基因突变率为98.04%(50/51),共发现16种突变类型,其中以kat G 315位点突变为主,占70.00%(35/50),1株为kat G与inh A联合突变。结论该院耐多药MTB产生耐药性与rpo B和kat G基因突变相关,检测MTB耐多药相关基因突变可为早期快速诊断耐药结核病提供参考依据。     

大肠埃希菌耐喹诺酮类药物回旋酶基因突变的研究

目的 研究导致大肠埃希菌DNA回旋酶A亚单位的基因变异耐喹诺酮类药物的机制。方法 收集3株大肠埃希菌耐药菌株及1株敏感株，用PCR方法扩增其回旋酶(gyraseA)基因，对扩增片段进行单链构象多态性分析(PCR--SSCP)及DNA序列分析。结果 PCR—SSCP发现3株耐药株其DNA单链与标准株及临床敏感株迁移率不同，3株耐药菌株存在Ser—83→Leu，Asp—87→Asn及His—184→Asn突变，Ser—83→Leu及Asp—87→Asn突变位于氟喳诺酮类药物耐药决定区，gyrA基因碱基552位点C→A碱基突变致组氨酸突变为天冬酰胺。结论 大肠埃希菌对氟喹诺酮类药物产生耐药性与gyrA基因点的突变有关。     

结核菌耐药pncA和embB基因突变与临床治疗的研究

目的 分别了解结核分枝杆菌耐吡嗪酰胺和乙胺丁醇的pncA和embB基因突变情况，研究其治疗对策。方法 通过传统药敏实验和聚合酶链反应(PCR)一单链构象多态性(SSCP)技术初步鉴定106株临床分离株的药敏和embB、pncA基因。结果 与结核菌标准株H37RV对照分析94例TB菌耐吡嗪酰胺(PZA)的pncA基因突变率为44．69％(42／94)，分析83例耐乙胺丁醇(EMB)的embB基因突变率为54．2％(45／83)，两种基因同时突变率为11．8％(11／94)，其中embB基因均在传统药敏的高耐药区域。根据上述分析建立的个体化化疗方案治疗，痰菌转阴率为65．9％(62／94)，病灶治疗有效率为69．1％(65／94)，空洞治疗有效率为56．4％(53／94)。结论 临床部分结核分枝杆菌耐EMB和PZA是由于其embB、pncA基因突变所致，临床根据传统药敏的高、低耐药浓度和基因突变的情况制定的治疗方针，对多耐药结核疗效显著。     

结核分枝杆菌利福平耐药基因突变的研究

目的评价检测rpoB基因突变在结核分枝杆菌耐利福平（I肝）耐药性测定中的应用价值。方法采用DNA序列分析法和聚合酶链反应-单链构象多态性（PER—SSCP）法对91株结核分枝杆菌临床分离株（其中药物敏感株35株，耐RFP或含耐RFP耐多药株56株）rpoB基因核心区域的突变情况进行检测。结果以结核分枝杆菌H37RV为对照，所有35株药物敏感株的rpoB基因均无突变，用DNA序列分析方法检测56株耐药株中53株发生突变，敏感性为94．6％（53／56），其中最常见的突变位点是531位丝氨酸和526位组氨酸。PER—SSCP检测56株耐RFP分离株中，52株rpoB基因SSCP图谱异常，其敏感性为92．9％（52／56）。结论DNA序列分析对判断结核分枝杆菌耐利福平非常有价值。PER—SSCP可初步筛选结核分枝杆菌RFP耐药性。     

内蒙一起F2a志贺菌痢爆发的质粒分析

目的　探讨内蒙一起菌痢爆发的特异传染源。方法　对４３ 株Ｆ２ａ志贺菌进行质粒图谱和质粒ＤＮＡ 酶切图谱分析。结果　①质粒图谱和质粒ＤＮＡ酶切图谱特征相同的菌株为引起本次菌痢爆发的优势克隆;②本次爆发偶合有部分散发病例;③经污染的食物传播是本次爆发的主要传播途径。结论　质粒分析能较为特异、敏感地揭示不同来源志贺菌间的遗传联系和差别,从而准确说明爆发或流行事件的真相