mTOR shRNA慢病毒载体的构建及包装

目的:构建mTORshRNA慢病毒表达载体,为探讨RNA干扰技术抑制T细胞mTOR基因的相关研究奠定基础.方法:设计合成针对小鼠mTOR基因的shRNA片段,与酶切后的pLKD.UBC.GFP.U6载体片段进行连接并转化DH5α,提取阳性克隆质粒,测序,转染293T细胞.通过GFP表达水平测定病毒滴度.结果:DNA测序结果及PCR鉴定证实成功构建小鼠mTOR-shRNA重组慢病毒载体,对其进行包装后测定慢病毒滴度为1.38E+ 08 TU/ml.结论:成功构建并包装小鼠mTOR-shRNA重组慢病毒表达载体.     

携eGFP及表达人gp100-TCR基因的慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建携eGFP的人gp100-TCR基因慢病毒表达载体。方法应用基因重组手段,从pGCsamgp100APB质粒上扩增出人gp100-TCR片段,将其插入到pLentiLox3.7(pLL3.7)慢病毒表达载体中,同时将其U6启动子替换为EF-1a启动子,形成慢病毒表达载体pLL3.7-gp100TCR-pEf-1a。将其与包装质粒混合,采用磷酸钙转染法转染293FT细胞,包装产生慢病毒,荧光显微镜观察GFP蛋白的表达水平。检测病毒滴度。结果 PCR、酶切及测序表明慢病毒表达载体pLL3.7-gp100TCR-pEf-1a构建成功。转染后的293FT细胞在荧光显微镜观察可见强绿色荧光,形成的慢病毒可感染293FT细胞,包装的慢病毒浓缩后滴度为4.5×106 TU/ml。结论成功构建eGFP和gp100-TCR共同表达的慢病毒表达载体,为gp100-TCR在肿瘤治疗中的功能研究提供了有效平台。     

携EGFP的人Synoviolin基因慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建携EGFP的人Synoviolin基因慢病毒表达载体。方法应用基因重组手段,SalⅠ/NotⅠ双酶切质粒pIRES2-EGFP-syno,得到含EGFP和人Synoviolin的基因片段,将其亚克隆至入门载体pENTR1A的多克隆位点内得到入门质粒pENTR1A-syno-egfp。采用LR重组酶将pENTR1A-syno-egfp和目的载体pLenti4/TO/V5-DEST进行重组反应,形成慢病毒表达载体pLenti4/TO/V5-DEST-syno-egfp。将pLenti4/TO/V5-DEST-syno-egfp与包装质粒混合,利用脂质体共转染293FT细胞,包装产生慢病毒,以293FT细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果PCR,酶切及测序结果表明慢病毒表达载体pLenti4/TO/V5-DEST-syno-egfp构建成功,转染后的293FT细胞在荧光显微镜下观察可见强绿色荧光。包装的慢病毒原液滴度为1×10~8TU/ml。结论成功构建了EGFP和Synoviolin基因共表达的慢病毒表达载体,为Synoviolin基因的功能研究提供了高效稳定的转基因技术平台。     

线粒体细胞色素C氧化酶RNAi慢病毒载体的构建

目的：通过构建携带细胞色素C氧化酶基因的RNAi慢病毒载体，获得可供转染的滴度，为下一步研究该基因缺陷在真核细胞中的影响提供物质基础。 方法： 根据线粒体细胞色素C氧化酶设计的两条互补的单链寡核苷酸退火后形成双链，插入到pENTR/U6质粒缺口末端，连接在质粒上生成含RNAi盒的pENTR/U6载体；通过重组作用将pENTR/U6载体的RNAi盒重组到pLenti6/BLOCK-iT-Dest 载体上,构建含U6启动子、靶序列和Pol Ⅲ终止子表达框的MTCOX-I shRNA表达重组体；经脂质体导入293FT细胞，包装成慢病毒，收集病毒上清并检测其滴度。Western blotting检测干扰后细胞内线粒体细胞色素C氧化酶I亚基的表达。 结果： 将目的序列成功连接到载体上，并经测序分析证实载体构建成功；成功包装成高滴度的慢病毒。Western blotting检测结果证实构建的MTCOX-I shRNA表达重组体可显著抑制线粒体细胞色素C氧化酶I亚基的表达。 结论： 成功构建了携带细胞色素C氧化酶基因的RNAi慢病毒载体。     

小鼠IL-10重组慢病毒载体的构建和病毒包装

目的:构建小鼠IL-10重组慢病毒表达载体并进行包装,为进一步研究IL-10基因修饰树突细胞在哮喘免疫耐受中的作用提供实验基础。方法:小鼠IL-10基因片段经PCR扩增后,与酶切线性化的慢病毒载体进行定向连接,获得PGC-LV-IL-10重组慢病毒并转化细菌感受态细胞。克隆菌落行PCR鉴定,对阳性的重组质粒进行测序并转入293T细胞,荧光显微镜下观察GFP表达并行Western blot鉴定。将重组质粒与慢病毒包装系统一同转染293T细胞进行病毒包装,Real-time定量PCR法检测病毒滴度。结果:DNA测序结果及Western blot鉴定证实成功构建小鼠IL-10重组慢病毒载体,对其进行包装后测定慢病毒滴度为2×108TU/ml。结论:成功构建并包装小鼠IL-10重组慢病毒表达载体。     

粒-巨噬细胞集落刺激因子与绿色荧光蛋白融合基因慢病毒载体构建

目的：构建粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)与绿色荧光蛋白（GFP）融合基因慢病毒载体。 方法： 采用RT-PCR方法获得GM-CSF全外显子片段, 使之克隆到带GFP慢病毒表达载体质粒 FUGW中，经限制性酶切、PCR扩增和测序鉴定重组载体。在脂质体介导下将慢病毒包装系统的包装结构基因pCMV.△8.9、包膜基因VSVG、目的基因FUGW-GM-CSF导入病毒包装细胞293T，荧光显微镜检测基因的表达，包装成病毒后，收集病毒上清，浓缩，鉴定。用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测转染FUGW-GM-CSF细胞上清液 GM-CSF表达水平，电子显微镜观察293T细胞中的慢病毒。 结果： 限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实RT-PCR获得的GM-CSF/PCR产物与GenBank中的数据完全吻合; GM-CSF准确克隆入FUGW的多克隆位点。慢病毒的3种质粒可高效转染入293T细胞，荧光显微镜下观察可见大量绿色荧光。转染 FUGW-GM-CSF包装细胞上清液 GM-CSF酶联反应阳性。电子显微镜下见慢病毒颗粒位于293T细胞胞浆的内质网中。 结论： 成功构建了GM-CSF与GFP融合基因慢病毒载体，为诱导DC提供了适合的稳定转染的载体。     

PEX慢病毒载体构建及其在293FT细胞中的分泌表达

目的 构建含人MMP-9信号肽-MMP-2-PEX片段的重组慢病毒,并在293FT细胞中分泌表达PEX蛋白.方法 利用RT-PCR、基因重组等技术,构建含MMP-9信号肽-MMP-2-PEX片段的重组慢病毒表达载体pBPLV-signal-PEX,在脂质体介导下与包装质粒(pLP1、pLP2)、包膜质粒(pLP/VSVG)共转染293FT细胞,包装产生慢病毒并进行滴度测定.慢病毒感染2931;3"细胞后,Western印迹法检测293FI"细胞培养上清中PEX的表达.结果 酶切和DNA测序表明慢病毒表达载pBPLV-signal-PEX构建正确,四质粒共转染293FT细胞成功获得慢病毒;慢病毒感染293FT细胞后,在细胞培养卜清中可检测到PEX蛋白的表达.结论 成功构建了含人PEX的重组慢病毒,在体外有效感染293fT细胞并持续分泌表达目的 蛋白,为进一步研究PEX在肿瘤侵袭与转移中的作用提供实验基础.     

沉默Toll样受体4基因表达的RNAi慢病毒载体的构建

背景：Toll样受体4 (toll-like receptor4,TLR4)是介导内毒素/脂多糖应答的主要受体,在由内毒素诱导的炎性反应的信号通路中发挥着重要作用。 目的：构建人TLR4基因的RNA干扰慢病毒载体,并观察其对人脐静脉内皮细胞TLR4在蛋白水平的沉默效应。 方法：利用Invitrogen在线软件设计人TLR4基因shRNA序列,合成、退火形成双链寡核苷酸后克隆到线性载体pENTRTM/H1/TO的黏性末端,并进行DNA测序。得到的阳性重组子再与慢病毒载体进行重组反应,从而获得干扰TLR4基因真核表达的慢病毒载体。在脂质体的介导下将慢病毒包装辅助复合体和TLR4基因的真核表达慢病毒载体导入293FT细胞包装病毒,测定病毒滴度,感染人脐静脉内皮细胞,检验其干扰TLR4基因表达的有效性。 结果与结论：实验成功构建TLR4基因真核表达慢病毒干扰载体并获得相应的慢病毒,病毒滴度为8.7×10⁶ U/mL。免疫印迹杂交结果表明,所获得的慢病毒感染人脐静脉内皮细胞TLR4基因在蛋白水平的表达显著降低。实验成功构建了人TLR4基因慢病毒RNA干扰表达载体,并验证了其在人脐静脉内皮细胞上的有效性。     

微小RNAmiR-26a的克隆及其慢病毒表达载体的构建

目的克隆微小RNAhsa-miR-26a并构建其慢病毒表达载体。方法将PCR扩增得到的miR-26。前体序列和pIVTHM载体经双酶切后连接产生pIVTHM-miR-26a慢病毒表达载体，双酶切后测序鉴定。筛选阳性克隆。用pIVTHM-miR-26a、psPAX2和pMD2-G3质粒共转染包装细胞293FT，包装产生慢病毒，以293FT细胞绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表达水平测定病毒滴度。结果经双酶切鉴定和测序证实，成功构建了miR-26a的慢病毒表达载体pIVTHM—miR-26a。倒置荧光显微镜下观察可见包装细胞293FT呈绿色荧光．并测得病毒滴度为5×10^5TU／ml。成功构建hsa—miR-26a的慢病毒表达载体，为深入研究miR-26a的生物学功能奠定了基础．     

胞嘧啶脱氨酶和血管内皮抑素基因慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建携带胞嘧啶脱氨酶(CD)和血管内皮抑素(ES)基因的慢病毒载体.方法 根据GenBank提供大肠杆菌源CD和ES基因序列设计、合成2个基因并构建与荧光蛋白融合的真核表达载体pEGFP-CD和pDS-RED-ES.酶切和测序鉴定后,将载体瞬时转染HEK293细胞,运用实时PCR检测CD和KS基因表达情况.把载体中基因片段EGFP-CD和DS-RED-ES通过BP/LR重组分别构建慢病毒载体,并利用293FT细胞进行慢病毒的包装.将病毒原液浓缩,并测定病毒滴度.结果 酶切、测序及PCR鉴定证实构建出慢病毒载体pLenti6.3-CD-EGFP和pLenti6.3- ES- Monomer - DsRed.感染293FT细胞后荧光显微镜下观察到GFP和DsRed的表达.浓缩慢病毒滴度分别为2.2× 108 TU/ml和6.5×107 TU/ml.结论 成功构建了CD和ES基因慢病毒载体.     

α-珠蛋白基因的RNAi慢病毒载体的构建

目的构建α-珠蛋白基因RNAi重组慢病毒载体。方法合成靶序列Oligo DNA,退火形成双链DNA,克隆到慢病毒p LKO载体,重组载体进行酶切和测序鉴定。在脂质体的介导下将ps PAX2、pMD2.G及慢病毒载体三质粒共转染293T细胞,48h后收集细胞培养上清液。采用终点稀释法测定病毒滴度。结果酶切和测序证实重组载体构建成功。病毒的滴度为3.9×106TU/ml。结论成功构建α-珠蛋白基因RNAi慢病毒载体,为采用RNAi技术治疗β-地贫的研究创造了条件。     

人端粒酶逆转录酶慢病毒载体的构建及人肝细胞的初步筛选

目的： 构建人端粒酶逆转录酶（hTERT）慢病毒表达载体,将其转染人肝细胞L02并且通过杀稻瘟筛选出阳性克隆细胞。方法：以PBABE-puro-hTERT质粒为模板PCR法获取目的基因attB1- hTERT-attB2,通过BP反应克隆至pDONR221;采用LR重组酶将pDONR221-hTERT和pLenti6/V5-DEST进行重组反应,形成pLenti6/V5-DEST- hTERT。将重组载体pLenti6/V5-DEST- hTERT与包装质粒充分混合,利用脂质体共转染293FT细胞,获得重组慢病毒颗粒。将其感染人肝细胞L02,通过杀稻瘟筛选获得阳性克隆。结果：测序发现入门载体pDONR221包含的目的基因hTERT 1547位点存在点突变(原碱基A变成G）,通过定点突变技术成功诱变并鉴定慢病毒表达载体pLenti6/V5-DEST- hTERT成功构建。重组慢病毒滴度为1×108 TU/L,获得20株稳定抗性的单克隆细胞。结论：成功构建人端粒酶逆转录酶的慢病毒表达载体,获得稳定抗性的单克隆肝细胞,为进一步建立永生化肝细胞系奠定了基础。     

靶向人STAT3基因的shRNA慢病毒载体的构建

目的:构建并鉴定靶向人转录因子STAT3基因的shRNA慢病毒载体.方法:设计合成针对人STAT3基因的shRNA序列,运用基因重组技术将其插入到含U6启动子及绿色荧光蛋白基因的慢病毒表达载体pSicoR中,构建shRNA重组质粒pSicoR-STAT3-shRNA.经双酶切及DNA测序鉴定后,利用转染试剂X-tremeGENE HP将第3代慢病毒载体共转染至HEK293细胞进行病毒包装.以阴性载体为对照,用RT-PCR和Western blot分别检测STAT3基因和蛋白表达水平.结果:双酶切及测序证实载体构建正确,在HEK293中成功包装出高滴度慢病毒颗粒,感染HEK293后STAT3基因表达和蛋白质表达水平均较对照组明显降低(P＜0.05).结论:成功构建了靶向人STAT3基因的shRNA慢病毒载体.     

重组人肝细胞生长因子在人脐带间质干细胞中高效表达

目的：构建能表达人肝细胞生长因子(hHGF) 的pWPI-hHGF载体，并将含hHGF基因的重组慢病毒载体转染人脐带间质干细胞（hUCMSCs），观察人脐带间质干细胞中hHGF的表达情况。方法：将携带目的基因hHGF的 pUC-SRα/hHGF质粒亚克隆到真核细胞表达载体pWPI载体上，构建重组质粒pWPI-hHGF。基因测序进行HGF的鉴定。用磷酸钙沉淀法，将pWPI-hHGF、pAX2、pMD2G共同转染包装细胞293T细胞，获得携带目的基因hHGF和GFP基因的重组慢病毒pWPI-hHGF。将pWPI-hHGF及阳性对照质粒pWPI-GFP分别用Lipofectamin 2000介导转染体外培养的hUCMSCs。在荧光显微镜下计数，确定阳性对照质粒的转染数，从而估计该基因的转染效率。蛋白印迹法检测HGF和GFP蛋白的表达，ELISA法检测细胞上清液hHGF含量。结果：DNA 测序显示hHGF基因成功地插入到pWPI载体中。包装细胞293T转导pWPI-HGF质粒后，转染阳性率达100％。阳性对照质粒转染人脐带间质干细胞24 h后，在荧光显微镜下观察，其转染效率达80%以上。蛋白印迹法检测靶细胞中hHGF表达呈强阳性，而对照组表达量极低，两者差异显著(P<0.01)。检测收集转染hHGF后的人间质干细胞上清液中hHGF的表达含量明显高于对照组(P<0.01)。结论：构建的在真核细胞内表达hHGF的重组质粒pWPI-hHGF转染人脐带间质干细胞，能获得hHGF基因在人脐带间质干细胞中大量、稳定的表达。     

携人PTHLH基因慢病毒表达载体的构建

目的构建携带人甲状旁腺相关激素（PTHLH）基因的慢病毒表达载体pGC-FU/PTHLH。方法酶切载体pGC-FU,根据人PTHLH基因合成特定引物,扩增目的基因片段,将其克隆到pGC-FU质粒（含EGFP基因）上,菌落PCR鉴定及测序分析重组载体,使用Lipofectamine 2000诱导转染pGC-FU、pHelper1.0和pHelper2.0载体三质粒进入293T细胞包装慢病毒,并用带PTHLH的慢病毒感染293T细胞和鼻咽癌CEN1细胞确认慢病毒包装是否成功。结果菌液PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定显示,与理论预计值阳性转化子735bp,阴性转化子198bp基本相吻合;PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,结果完全匹配,进一步鉴定载体构建成功。分别将质粒包装系统共转染293T细胞,包装产生空白对照慢病毒（pGC-FU）和过表达PTHLH的慢病毒（pGC-FU/PTHLH）;或用携带PTHLH和EGFP基因的病毒上清感染CNE1细胞,48h后,倒置荧光显微镜下观察293T和CNE1细胞,均可见绿色荧光,转染成功。结论成功构建携人PTHLH基因慢病毒表达载体,为进一步研究PTHLH基因在鼻咽癌转移中的作用及鼻咽癌发病分子机制奠定了基础。     

小鼠BTLA慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的 构建小鼠BTLA慢病毒表达载体,并对表达产物进行鉴定.方法 以pET-28a-mBTLA质粒为模板,通过PCR技术构建pMD18-T-mBTLA质粒,将小鼠BTLA基因全长编码序列克隆到慢病毒转移载体,通过脂质体转染293T细胞包装成小鼠BTLA慢病毒颗粒.PCR技术和基因测序对重组质粒进行鉴定.荧光显微镜观察重组慢病毒感染293T细胞形态学变化.RT-PCR和Western blot法鉴定BTLA在重组慢病毒感染293T细胞中的表达.50％组织培养感染剂量法(TCID5o法)检测重组慢病毒滴度.结果 成功构建的pMD18-T-mBTLA质粒和pSL6-mBTLA质粒,经双酶切电泳后均出现大小约为1 kb的条带与mBTLA编码序列的大小相符.基因测序并比对分析进一步证实mBTLA编码序列成功整合到质粒载体.病毒上清PCR扩增和293T细胞形态学观察证实Lenti-mBTLA慢病毒包装成功.TCID50法测定Lenti-mBTLA慢病毒滴度为1.3×108 pfu/mL.RT-PCR和Western blot法证实Lenti-mBTLA慢病毒能有效表达mBTLA mRNA和蛋白质.结论 成功构建了表达小鼠BTLA的慢病毒.     

SPARC基因RNAi慢病毒载体的构建及其在SKM-1细胞中的表达

目的:构建SPARC基因RNAi慢病毒载体获得稳定产毒的细胞,并观察其对人MDS细胞株SKM-1细胞的转染效率及其对SPARC基因的抑制效率。方法:针对已经筛选确定的SPARC基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的OligoDNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生GC-shSPARC慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆并进行测序鉴定。用GC-shSPARC、pHelper1.0和pHelper 2.0载体共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度,并将获得的重组慢病毒GC-shSPARC转染SKM-1细胞,通过荧光显微镜检测转染后GFP表达情况,测定转染效率;RT-PCR和Western blot分别验证转染后SKM-1细胞SPARC mRNA及蛋白的表达。结果:经测序证实,构建出了SPARC shRNA的慢病毒载体GC-sh SPARC。包装、浓缩病毒悬液的滴度为1×109TU/mL。荧光显微镜下能直接观察到转染组细胞的GFP表达,转染效率为70%,RT-PCR、Western blot技术分别检测到GC-shSPARC慢病毒转染SKM-1细胞SPARC mRNA、SPARC蛋白表达水平较空白组明显降低(P<0.05)。结论:成功构建SPARC基因RNAi慢病毒载体,其能高效干扰SKM-1细胞SPARC基因的表达。     

Hsa-mir-196b慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建Hsa-mir-196b慢病毒表达载体并对其进行鉴定。方法以正常人外周血DNA为模板,PCR扩增得到目的基因。通过HpaⅠ/XhoⅠ双酶切及其后的连接将其插入Lentilox3.7（pLL-3.7）质粒中。PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用pLL-3.7-mir-196b、pCMV-VSV-G和pCMV-dR8.91三质粒系统共感染HEK-293FT细胞,包装生产慢病毒。将所得病毒悬液梯度稀释后感染HEK293FT细胞,以检测病毒滴度,并用实时定量PCR检测慢病毒感染后Hsa-mir-196b的表达变化。结果 PCR及测序结果证明成功构建了pLL-3.7-mir-196b重组质粒。所得慢病毒上清滴度为（7.2±1.1）×107TU/ml。感染慢病毒的239FT细胞中,Hsa-mir-196b的表达量相对于未感染细胞提高了约24倍。结论成功构建Hsa-mir-196b慢病毒表达载体。     

CXCR4基因慢病毒表达载体的构建、包装及鉴定

目的构建CXCR4基因慢病毒过表达载体并对其进行包装、鉴定。方法首先设计合成引物,采用PCR法扩增目的基因CXCR4,将目的基因与酶切线性化的载体进行定向交换,成功构建重组载体慢病毒表达载体p GC-FU-CXCR4,将其产物转化大肠杆菌感受态细胞。对培养出的克隆先进行菌落PCR鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,最后将获得的病毒载体共同转染293T细胞,收集病毒颗粒,并采用Real time PCR法测定病毒滴度。结果 PCR鉴定结果显示扩增的目的基因已成功插入p GC-FU载体,Western Blot结果显示得到的片段与理论大小相符,阳性克隆测序结果与目的基因序列一致,说明重组慢病毒载体的插入序列完全正确。结论本实验成功构建了CXCR4慢病毒表达载体,并成功对慢病毒进行了包装及病毒滴度测定。     

慢病毒介导的融合基因SP-TAT-Apoptin对HepG2细胞的作用

目的:将已构建的SP-TAT-Apoptin融合基因真核表达载体包装成感染性慢病毒颗粒,并用病毒颗粒感染肝癌HepG2细胞,测定其诱导凋亡的效率。方法:通过脂质体Li-pofectamine TM2000将SP-TAT-Apoptin融合基因真核表达载体与其他包装质粒共同转导入293FT细胞,包装并收集感染性病毒颗粒,用实时定量PCR法测定病毒滴度,免疫荧光法检测重组慢病毒感染的293FT细胞中SP-TAT-Apoptin融合基因的表达,同时通过流式细胞术(FCM)测定慢病毒感染后HepG2细胞的凋亡率。结果:SP-TAT-Apoptin重组慢病毒感染293FT细胞后,用V5抗原单克隆抗体(mAb)进行免疫荧光化学检测,示SP-TAT-Apoptin融合基因可成功表达于293FT细胞;通过Anexin-VPI法检测示SP-TAT-Apoptin融合基因慢病毒感染肝癌HepG2细胞后可引起细胞凋亡,其凋亡效率明显高于单纯脂质体转染组。结论:成功包装出可表达SP-TAT-Apoptin融合基因且具感染性的慢病毒颗粒,感染HepG2肝癌细胞后可引起其凋亡,为进一步研究融合基因SP-TAT-Apoptin体内治疗效果极其在临床中的应用奠定了基础。