化疗诱导Egr-1启动子调控的GM-CSF基因表达对荷瘤小鼠造血损伤的作用

背景与目的: 电离辐射可以通过产生活性氧激活Egr-1启动子高度保守序列CArG,Egr-EG为构建的上游含Egr-1调控序列CArG元件,启动TNF或GM-CSF的pCIneo表达载体,该机制可用于辐射所致的造血损伤或治疗肿瘤.化疗药物通常是通过产生活性氧和DNA损伤导致肿瘤细胞死亡,我们假设化疗药物可以产生活性氧.因此,化疗可以诱导Egr-1启动子调控下游造血因子基因表达,这种化疗诱导基因疗法针对化疗所致的造血损伤具有恰当的治疗效果.本文旨在探讨化疗诱导Egr-1启动子调控的造血因子基因表达对化疗后造血恢复的作用.方法: 将构建的携带有早期生长因子(Egr-1)启动子的GM-CSFcDNA和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)cDNA双顺反子真核表达载体导入基质细胞HFCL后,输入荷瘤(黑色素瘤)小鼠体内,对其实施5-FU化疗,观察外周血象动态改变、人基质细胞植入检测、外源基因eGFP、GM-CSFmRNA、蛋白表达以及对CFU-GM的增殖作用的检测.结果: 实验组与对照组相比外周血白细胞下降幅度明显减轻,恢复加快,而各组问CFU-GM差异无显著性.肿瘤抑制率与化疗相关,而与外源基因表达无关:5-FU处理后72 h实验组小鼠骨髓可见绿色荧光阳性的基质细胞,RT-PCR和Western印迹显示GM-CSF mRNA和GM-CSF蛋白表达增强.结论: 5-FU诱导的Egr-1启动子造血因子基因疗法对化疗后造血损伤具有促进造血恢复作用.     

mSDF-1γ/GM-CS融合蛋白的制备及其对辐射小鼠造血损伤恢复的促进

目的: 利用毕赤酵母表达系统表达mSDF-1γ/GM-CSF融合蛋白,研究该融合蛋白对辐射小鼠的促造血增殖作用和免疫增强作用.方法:化学合成mSDF-1γ/GM-CS基因,构建携带该基因的表达载体,转化酵母后分泌表达重组融合蛋白,离子交换柱纯化,SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定.60Co γ射线照射制备小鼠辐射模型,以融合蛋白皮下注射进行治疗,观察辐射小鼠骨髓造血细胞的增殖活性及免疫细胞的趋化活性.结果:成功构建表达载体pPIC9K- SDF1-rh-GM-CSF1,转化毕赤酵母菌株GS115后表达融合蛋白mSDF-1γ/GM-CS,其相对分子质量为32 000,含量为78 ng/ml.融合蛋白治疗后,辐射小鼠骨髓单个核细胞增殖活性、GM-CFU形成能力明显提高(均P<0.01)、骨髓细胞凋亡率非常明显地降低(P<0.05或P<0.01),小鼠外周血CD3+CD4+T细胞数显著高于辐射组和GM-CSF治疗组(均P<0.05).结论: mSDF-1γ/GM-CSF融合蛋白具有促进造血和免疫细胞增殖的双重活性,有望在抗肿瘤免疫和造血调控中开发成为有应用前景的新型细胞因子.     

寡核苷酸Dbait乏氧放射双表达对人宫颈癌细胞的乏氧放射增敏效应

基因-放疗是将放射敏感性调控序列与治疗基因和药物相耦联,在肿瘤放疗同时诱导目的基因和药物在肿瘤内高效表达,从而提高肿瘤放射敏感性,它是近年来肿瘤放疗新策略^\[1\]。早期生长反应-1(early growth response-1,Egr-1)启动子在电离辐射诱导下能增强下游基因表达,并可提高放疗效果;乏氧反应元件(hypoxia response elements,HRE)在乏氧条件下可增强下游基因表达水平。笔者利用HRE和Egr-1构建乏氧放射双敏感嵌合性启动子HRE/Egr-1诱导寡核苷酸药物Dbait表达,并观察该重组质粒在乏氧条件下对人宫颈癌Hela细胞的乏氧放射增敏效应。     

地西他滨对造血系统肿瘤细胞热休克蛋白22表达的影响

 目的　探讨地西他滨（Aza-C）对造血系统肿瘤细胞热休克蛋白22（HSP22）表达的影响及可能的机制。方法　半定量反转录聚合酶链反应（PCR）法检测HSP22在造血系统肿瘤细胞系以及造血系统肿瘤患者骨髓单个核细胞中的表达水平；去甲基化药物Aza-C（2 μmol／L）诱导上述细胞HSP22的表达；甲基化特异PCR法检测造血系统肿瘤细胞系、造血系统肿瘤患者和健康供者的骨髓单个核细胞中HSP22基因启动子甲基化状态。结果　在检测的13个造血系统肿瘤细胞系、20例不同类型的造血系统肿瘤患者以及10名健康供者骨髓单个核细胞中均未发现HSP22基因的表达；Aza-C能诱导造血系统肿瘤细胞系及造血系统肿瘤患者骨髓单个核细胞中的HSP22表达；Aza-C处理过的造血系统肿瘤细胞系中HSP22基因启动子处于部分去甲基化状态，健康供者及造血系统肿瘤患者骨髓单个核细胞HSP22基因启动子处于高甲基化状态。结论　Aza-C通过使HSP22基因启动子去甲基化诱导造血系统肿瘤细胞HSP22的表达。     

人类骨髓成纤维样基质细胞对多发性骨髓瘤细胞迁移和归巢特性的影响

 目的　观察人类骨髓成纤维样细胞系HFCL对多发性骨髓瘤细胞RPMI8226增殖、迁移和归巢的影响。方法　采用体外细胞培养,建立RPMI8226细胞和HFCL细胞共培养体系,锥虫蓝拒染法测定生长曲线;流式细胞术（FCM）检测细胞周期和黏附分子CD49d的变化;RT-PCR检测CXCR4基因的表达情况。结果　HFCL细胞抑制 RPMI8226细胞生长,且与HFCL细胞直接接触组的抑制作用大于非直接接触组（Transwell）组。RPMI8226细胞与HFCL细胞共培养后,直接接触组G1期细胞增高,S期细胞减少;HFCL细胞下调RPMI8226细胞的CXCR4和CD49d的表达,单独培养组明显高于直接培养组;Transwell组无明显变化。结论　人类骨髓成纤维样细胞HFCL能抑制多发性骨髓瘤细胞RPMI8226的增殖,抑制CXCR4和CD49d的表达,影响骨髓瘤细胞的迁移和归巢。     

肿瘤端粒酶靶向腺病毒载体的表达活性

目的　构建针对端粒酶阳性肿瘤的特异性腺病毒载体 ,研究其介导目的基因在肿瘤细胞内的定向表达能力。方法　将端粒酶逆转录酶 (hTERT )启动子克隆入质粒 pDC3 12的多克隆位点构成外源基因表达盒 ,在基因表达盒上下游分别插入 1个绝缘子序列 ,构建针对端粒酶阳性肿瘤的特异性腺病毒载体pSG TPE ;采用Luciferase报告基因进行hTERT启动子的活性分析 ;以pSG TPE携带绿色荧光蛋白 (EGFP)报告基因 ,重组腺病毒AdTPE EGFP ,观察其介导EGFP在肿瘤细胞内的定向表达能力 ,并与CMV启动子控制的腺病毒AdCMV EGFP作对照。结果　hTERT启动子在正常细胞内几乎没有活性 ,而在肿瘤细胞内的活性与SV 40启动子相近。腺病毒AdTPE EGFP能介导EGFP在肿瘤细胞内定向而稳定表达 ,在正常细胞内不表达 ,而对照腺病毒AdCMV EGFP在肿瘤和正常细胞内均表达EGFP。结论　靶向端粒酶阳性肿瘤的腺病毒载体 pSG TPE ,不但提高了对基因表达调控的特异性 ,而且降低了对正常细胞毒性作用。绝缘子的应用隔断了外源基因表达盒和病毒基因表达调控序列之间的互相干扰 ,进一步提高目的基因的表达效率。该载体对肿瘤的靶向基因治疗具有重要的应用价值。     

长链非编码RNA GATA6-AS1通过调控GATA6抑制胃癌5-氟尿嘧啶耐药细胞SGC7901/5-FU的增殖、凋亡及转移

目的：研究长链非编码RNA(long non-coding RNA,Lnc RNA)GATA6反义RNA1(GATA6 antisense RNA 1,GATA6-AS1）调控GATA6表达对胃癌（gastric cancer,GC)5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）耐药细胞SGC7901/5-FU增殖、凋亡及转移的影响,并探讨可能的作用机制。方法：以亲本SGC7901细胞和SGC7901/5-FU细胞作为对照组,采用Lipofectamine 2000将空载体pc DNA3.1、重组载体pc DNA3.1-GATA6-AS1、sh NC和sh GATA6-AS1分别转入SGC7901/5-F U细胞,使GATA6-AS1过表达或沉默表达。采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞中GATA6-AS1和GATA6 m RNA的表达情况。各组细胞经5-F U处理后,分别采用CCK-8法检测细胞增殖的能力,细胞划痕愈合实验检测细胞的迁移能力,Transwell实验检测细胞的侵袭能力,FCM法检测细胞的凋亡能力。随后采用蛋白质印迹法检测各组细胞中Bax、Bcl-2、Caspas...     

第五届全国肿瘤生物治疗会议述评

Egr-1(early growth response-1)系-具有辐射诱导特性的转录因子.其调控序列被证实可通过与肿瘤杀伤基因相连接的方法而赋予后者以辐射诱导特性,因而被用于肿瘤的基因-放射治疗研究.为此,我们用PCR方法从BALB/c小鼠基因组DNA扩增出445bp长Egr-1基因调控序列,序列分析证实,除-392位一个碱基(A→G)相差外,其余均与文献报道一致,包括6个对辐射诱导特性起关键作用的CC(A T)_6GG结构域-将克隆的Egr-1基因调控序列连入pCL3荧光素酶报告质粒,转染小鼠恶性黑色素瘤细胞(B16),转染细胞用~(60)Coγ-线进行2.5、5.0和10.0Gy不同剂量照射后,检测细胞裂解液中荧光素酶活性.与未照射细胞比较.照射后细胞荧光素酶活性明显提高,以2.5Gy剂量最为显著.提高约138%,表明Egr-1基因调控序列具有辐射后诱导下游基因表达的功能.     

不同截短型癌基因AEG-1启动子活性分析

目的:分析不同截短型癌基因AEG-1启动子活性,证实与E6/E7表达相关的转录调控因子对AEG-1启动子活性的影响。方法:以宫颈癌HeLa细胞基因组DNA为模版,扩增AEG-1启动子全长序列（-2710/-491）,并应用本实验室改造的启动子活性研究专用绿色荧光蛋白报告载体构建pGL3-basic-EGFP/AEG-1质粒,通过转染HeLa细胞及血管内皮细胞ECV304检测启动子活性。同时,根据AEG-1启动子序列上与E6/E7作用相关的转录调控因子结合位点位置,设计不同截短型AEG-1启动子序列引物,应用pGL3-basic-EGFP载体构建不同截短型AEG-1启动子载体,并分别转染细胞检测启动子活性。结果:AEG-1启动子全长序列pGL3-basic-EGFP/AEG-1载体转染HeLa细胞可见明显绿色荧光蛋白表达,而在血管内皮细胞ECV304中表达为痕量。包含不同转录调控因子C-Myc、SP1、NF-κB、E2F结合位点的不同截短型AEG-1启动子载体在肿瘤细胞中有活性但存在差异。结论:AEG-1启动子为肿瘤特异性启动子,含有与E6/E7表达相关的转录调控因子NF-κB、E2F结合位点的启动子序列为影响AEG-1基因启动子活性的关键区域。     

重组诱导性质粒Egr1-XPO4 的构建及其与5-FU 联合对肝癌细胞SKHep1的协同抑制作用

目的：构建重组诱导性质粒Egr1-XPO4,探讨其与5-FU联合对肝癌细胞SK-Hep1 的协同抑制作用。方法: 将XPO4基因插入带诱导性启动子Egr1 的质粒载体中,构建Egr1-XPO4 重组质粒。将Egr1-XPO4 质粒转染肝癌细胞SK-Hep1 并经化疗药物5-FU诱导,采用Western blotting 检测转染细胞中XPO4 蛋白表达水平,CCK法检测转染诱导后SK-Hep1 细胞的增殖水平,Annexin V-FITC/PI 流式细胞仪检测SK-Hep1 细胞凋亡情况。动物实验观察Egr1-XPO4 质粒联合5-FU对裸鼠移植瘤的治疗效果。结果: 成功构建携XPO4 基因和启动子Egr1 的重组诱导性质粒Egr1-XPO4,重组质粒转染SK-Hep1 细胞并经5-FU诱导后,细胞中XPO4 蛋白表达量明显增加,且与5-FU的质量浓度明显依赖。Egr1-XPO4 转染联合5-FU诱导对SK-Hep1 细胞增殖抑制明显强于单纯转染或5-FU诱导（P<0.05）,同时导致SK-Hep1 细胞的早期凋亡率显著高于单纯转染或诱导（P<0.05）。以Egr1-XPO4 质粒联合5-FU 治疗后,裸鼠肝癌移植瘤的体积明显小于Egr1-XPO4 或5-FU 单独治疗（P<0.05)。结论: 重组诱导性质粒Egr1-XPO4联合5-FU对肝癌细胞SK-Hep1 产生协同抑制作用。