石蜡切片厚度对流式细胞仪检测细胞周期分析的影响

目的 探讨石蜡包埋组织制备单细胞悬液过程中，切片厚度对流式细胞仪检测结果的影响。方法 以小型猪的肠系膜淋巴结为实验对象，将淋巴结分别制成新鲜组织单细胞悬液和石蜡组织块；石蜡组织块切割成不同厚度的薄片，再制成单细胞悬液；流式细胞仪分别检测其DNA含量；采用MultiCycle for Windows分析软件分析它们之间的差异。结果 新鲜组织的G0／G1期、S期、G2／M期细胞所占比例、G0／G1峰的CV值及Debris值与石蜡组织之间存在差异；而不同厚度石蜡切片组织间制备的样本所测结果亦不相同。结论 不同厚度石蜡切片组织制备的细胞悬液，对流式细胞仪检测细胞周期分析的结果有影响；以采用60μm厚的切片组织制备细胞悬液为最佳。     

流式细胞术检测小鼠主动脉组织中炎性反应细胞浸润的方法研究

目的 应用剪碎和混合酶消化法,建立一种有效的用于流式细胞术分析的小鼠血管组织单细胞悬液,用于检测血管紧张素Ⅱ刺激引起的血管组织中炎性细胞的浸润。方法 采用皮下微量泵持续泵入血管紧张素Ⅱ(1 000 ng·kg^-1·min^-1),于灌注3 d后将小鼠麻醉后立即处死,取出胸主动脉和腹主动脉,迅速剪碎,用混合酶消化小鼠血管组织,制备单细胞悬液,用于流式细胞技术检测。结果 每只小鼠血管组织分离细胞数可达5×10⁵个/mL;光镜下单细胞悬液细胞完整透明,分散排列,状态良好;流式细胞术检测显示血管紧张素Ⅱ处理后明显增加了血管组织中中性粒细胞、T淋巴细胞和巨噬细胞的数量。结论 应用剪碎和混合酶联合消化法制备小鼠血管组织单细胞悬液简便可行,为血管炎性细胞浸润的研究提供了有效的组织单细胞悬液制备方法。     

胰腺组织单细胞悬液制备方法的比较研究

目的:寻找更好的胰腺组织单细胞悬液制备方法。方法:以大鼠冷缺血胰腺组织作为标本,分别采用剪碎和研磨法制备胰腺组织悬液。经台盼蓝染色测细胞存活率,并进行流式细胞术分析。结果:剪碎法细胞形态较完整、存活率高;两种方法细胞凋亡水平(APO)、CV值有显著性差异(P<0.01)。结论:胰腺组织单细胞悬液制备剪碎法优于研磨法。     

肾组织单细胞悬液制备方法的比较研究

目的　寻找更好的肾组织单细胞悬液制备方法。方法　以肾缺血再灌注大鼠肾为标本 ,分别采用剪碎法和研磨法制备肾组织悬液。经台盼蓝染色测细胞存活率 ,并进行流式细胞术 (FCM )分析。结果　剪碎法细胞形态完整、存活率高 ;2种方法细胞凋亡水平 (APO)、CV(coefficiencyofvariation)值有显著性差异 (P <0 .0 1)。结论剪碎法制备肾组织单细胞悬液优于研磨法     

一种高效的小鼠肺单细胞悬液制备方法的研究

目的:应用胶原酶Ⅴ酶消化法建立一种高效的小鼠肺单细胞悬液制备方法。方法:小鼠处死后取出肺脏,将其剪碎,应用胶原酶Ⅴ(175 U.ml-1)消化,37℃孵育1 h,随后进行细胞计数、活细胞百分率和流式细胞仪检测。结果:(1)光镜下见胶原酶Ⅴ消化所得小鼠肺细胞多种多样,大小不一,细胞形态完整,分散度好;(2)30 mg小鼠肺组织可提取细胞数量为(1～3)×106个,肺单细胞悬液中活细胞百分率均在95%以上;(3)流式细胞术检测可见大量的肺细胞。结论:应用胶原酶Ⅴ酶消化法制备小鼠肺单细胞悬液高效、简便,为肺细胞生物学及肺部疾病发病机制研究提供了有效的肺单细胞制备方法。     

流式细胞术检测结肠癌细胞表面sialyl-LewisA/X的样品制备方法探讨

目的 探讨不同样品制备方法 对结肠癌细胞表面sialyl LewisA/X抗原的影响.方法 应用EDTA、胰酶、细胞刮、胰酶-EDTA、胰酶联用细胞刮刀组制备培养入结肠癌细胞单细胞悬液.采用流式细胞仪检测入结肠癌细胞表面sialyl LewisA/X的嘉达和细胞数.结果 单用EDTA或细胞刮制备的细胞悬液中细胞产量低,胰酶或胰酶联用细胞刮刀组制备的细胞悬液中细胞产量高.胰酶组细胞表面sialyl LewisA/X的荧光强度明显降低.EDTA组、细胞刮组、胰酶联合细胞刮组间sialyl LewisA/X的荧光强度表达差异无统计学意义.结论 胰酶联用细胞刮法是贴壁培养细胞制备单细胞悬液的一种好方法.     

研磨法和组织分离器制备乳腺癌腋窝淋巴结单细胞悬液的比较

目的比较研磨法和Gentle MACS组织分离器制备乳腺癌患者腋窝淋巴结单细胞悬液在活细胞率、丝状物及细胞团块方面的优缺点,为淋巴组织细胞培养和流式分析找到一种更为可靠的方法。方法分别用研磨法和Gentle MACS组织分离器制备单细胞悬液,台盼兰染色后计数活细胞、死细胞、细胞团块和丝状物,并比较两种方法的优缺。结果两种方法制备的腋窝淋巴组织单细胞悬液在细胞存活率方面有显著性差异(P<0.05)。在丝状物和细胞团块方面,组织分离器法丝状物和细胞团块数量更少(P<0.05)。结论制备淋巴组织单细胞悬液,组织分离器法较研磨法更为优异。     

流式细胞术脱石蜡技术在泌尿系统肿瘤研究中的应用

流式细胞仪(Flow Cytometer)是一种现代生物学与计算机技术结合的产物,它能快速、大量、准确地分析许多肿瘤参数。肿瘤细胞DNA含量即细胞倍性的分析,正是这一系列肿瘤研究中重要的部分。现有研究资料表明,DNA非整倍体肿瘤较同期DNA含量正常(二倍体)肿瘤更易发生浸润和复发。因此,DNA含量的分析是研究肿瘤产生、发展、预后和疗效的重要指标,目前,流式细胞仪只能对单细胞悬液进行检查,常采用新鲜肿瘤组织制备悬液,故在许多研究中受到限制。近年来,采用流式细胞术脱石蜡技术,为肿瘤回顾性研究开辟了新领域。     

石蜡包埋大肠癌肿瘤浸润淋巴细胞FCM单细胞悬液样本的制备

探讨石蜡标本中大肠癌肿瘤浸润淋巴细胞亚群单细胞悬液样本的制备方法。石蜡标本经切片、脱蜡、水化、消化、过滤、收集细胞等步骤制成单细胞悬液,滴加单克隆抗体,通过流式细胞仪检测,最后进行淋巴细胞亚群细胞分型获取及读数。     

恶性胸腹水细胞FCM—DNA定量分析在临床诊断中的应用

目的：用流式细胞仪对胸腹腔积液患者同一次胸腹水细胞进行DNA含量测定,并与胸腹水脱落细胞学检查进行对比分析。方法：取10∧6/ml细胞悬液,离心弃上清,加入荧光染料碘化丙啶液,用美国B-D公司的FACS Calibur型流式细胞仪进行测定,用FMu-5型微型玻片离心沉淀法脱落细胞学检查。结果：流式细胞仪检测40例恶性胸腹水细胞DNA非二倍体出现率为90%（36/40）,脱落细胞学的检出率为87.5%（35/40）。结论：两种方法联合应用检出率为92.5%（37/40）,显著提高良恶性胸腹水的判断率。     

小儿哮喘花剥苔产生的免疫机制研究

目的:从免疫学角度探讨哮喘患儿花剥苔形成的机制.方法:采用免疫组化方法检测舌苔脱落上皮细胞中角蛋白13及bcl-2蛋白的含量.应用流式细胞术检测外周血CD4 及细胞趋化因子受体3(cell chemokine receptor-3, CCR-3)的表达量.采用放射免疫法检测血清中皮质醇的含量.结果:哮喘花剥苔组患儿外周血CD4 和CCR-3水平明显高于哮喘非花剥苔组及正常组(P＜0.05);哮喘花剥苔组、非哮喘花剥苔组血清中皮质醇含量低于其余各组(P＜0.05).哮喘花剥苔、非花剥苔组血清IgE水平明显高于其余各组(P＜0.05).哮喘花剥苔组、非哮喘花剥苔组舌苔上皮脱落细胞中角蛋白13的含量明显低于哮喘非花剥苔组、非哮喘非花剥苔组和正常对照组(P＜0.05).哮喘花剥苔组患儿舌苔上皮脱落细胞中bcl-2蛋白含量与其余各组比较无统计学差异.结论:花剥苔的形成与免疫反应密切相关,血清皮质醇水平降低、CD4 及CCR-3增多,可能促进了花剥苔的形成.同时,舌上皮细胞角化障碍及舌上皮细胞凋亡亦可能促进花剥苔的形成.     

大鼠体内彗星试验方法的建立与应用研究

目的 建立大鼠肝细胞和外周血淋巴细胞的体内彗星试验方法,并应用该方法对遗传毒性阳性物甲磺酸乙酯（EMS）和环磷酰胺（CPA）进行检测。方法 选择SD雄性大鼠为实验动物,分别给予不同剂量EMS和CPA。给药结束后,采集外周血样本和摘取动物左侧肝叶组织样本,铺制成单细胞凝胶玻片。玻片经裂解、解旋、电泳、中和、脱水等步骤后,得到可观察的实验标本。染色标本,并在40×荧光显微镜下观察拍照,使用专业分析软件对单细胞电泳图像进行分析和测定。结果 成功建立了基于大鼠肝细胞和外周血淋巴细胞的体内彗星试验方法。经该方法检测,EMS结果为阳性,CPA结果为阴性,EMS适合作为本方法的阳性对照。结论 成功建立大鼠体内彗星试验方法,并可应用于遗传毒性检测。     

AC133和EpCAM在人肺腺癌中的表达及双阳性细胞的分选

目的:通过双重免疫荧光染色法检测人肺腺癌组织标本中AC133以及上皮细胞黏附分子(EpCAM)的表达,并以流式细胞术分选AC133+EpCAM+细胞,为后续人肺腺癌干细胞研究提供实验基础。方法:取人肺腺癌组织标本,冰冻切片,进行双重免疫荧光染色,通过激光共聚焦显微镜检测腺癌组织内AC133和EpCAM的表达。以胶原酶和分散酶将新鲜肺腺癌组织标本制为单细胞悬液,滤除其中的胶原并去除红细胞后,以AC133和EpCAM共同标记单细胞,上流式细胞仪进行分选。结果:在人肺腺癌标本中具有AC133和EpCAM的表达;通过流式细胞术可分选到AC133和EpCAM共表达细胞。结论:验证了人肺腺癌组织中AC133和EpCAM的表达情况;通过流式细胞术分选获得AC133和EpCAM双标记阳性细胞,可为人肺腺癌干细胞的后续研究提供实验基础。     

不同组合 CD3、CD28抗体对 CIK 细胞诱导培养的探索研究

目的：探索利用CD3、CD28抗体对人外周血单个核细胞(PBMC)体外激活转化增强作用，采用不同包被方法及抗体浓度，以期获得一种更有效的包被方法。方法利用人外周血单个核细胞分离技术、体外细胞培养技术及流式细胞术(FMC)，以 CD3抗体固相包被、CD28抗体不同浓度固相包被或悬浮加入，计算经12 d 培养获得成熟 CIK 细胞的数量，测定不同包被方法刺激培养后的细胞表型的变化。结果培养后 C 组中 CD4+细胞百分比明显低于 A 组，差异有统计学意义(P <0.05)。C 组中CD8+细胞所占比例高于 A、B 组(P <0.05)。C 组的 T4/T8比值与 A、B 组差异有统计学意义(P <0.05)。B 组 NK 细胞含量与C 组差异有统计学意义(P <0.05)。CD25+细胞在 C 组中所占比例低于 A 组(P <0.01)。结论CD3抗体固相包被及 CD28抗体悬浮加入组合对人外周血细胞的刺激增强作用强于 CD3抗体固相包被 CD28+抗体固相包被组合。     

不同生长期大鼠血液及心、脑和肾脏组织中内皮祖细胞数量的变化

目的：观察不同生长阶段大鼠循环血及主要脏器包括心、脑和肾脏组织中内皮祖细胞(EPCs) 数量的变化,阐明大鼠体内EPCs数目的变化与生长发育阶段的关系。方法：将选定大鼠分为0.5、2、8及18月龄4组,每组选雄性大鼠各10只,2%戊巴比妥纳麻醉后腹主动脉取血（EDTA-K2抗凝）,同时取同部位定量上述各组织制备成单细胞悬液,以CD34-FITC和CD133-PE双染标记后用流式细胞仪检测血液及组织悬液中EPCs数目;另取各组大鼠心、脑和肾组织的相同部位制备成组织芯片,免疫组织化学法检测组织中CD34染色阳性的EPCs。结果：2月龄和8月龄大鼠血液及心、脑和肾组织EPCs数量和免疫组织化学染色表达明显高于0.5月龄组(P<0.05）;2月龄与8月龄组比较差异无统计学意义（P>0.05）;18月龄组与2月和8月龄组比较则明显减少(P<0.05）;0.5月龄组与18月龄组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论：随着大鼠的生长发育,循环血液及心、脑和肾主要脏器中EPCs数量呈规律性变化,大鼠体内EPCs数目的变化可能与生长发育阶段有密切的关系。     

人乳牙牙髓干细胞的体外培养和鉴定

目的 从健康儿童滞留的乳牙牙髓组织中分离出乳牙牙髓干细胞(SHED),体外培养观察,研究其生物学特性.方法 用酶消化法培养SHED,观察细胞形态、克隆形成能力,以免疫组化和流式细胞技术检测多种抗原表达情况及细胞周期,并进行体外分化实验,诱导SHED形成脂肪组织及矿化结节.结果 以酶消化法分离培养所得的细胞多形性明显,克隆形成效率为16~18/103细胞,其中富含有表达STRO-1表型的细胞.在一定条件下,所培养细胞具有定向分化能力.结论 以酶消化法分离培养获得的细胞中,包含自我更新能力强、有一定分化能力的干细胞,即SHED.     

宫颈癌患者外周血和宫颈组织中髓源性抑制细胞的检测及意义

［摘要］目的: 检测髓源性抑制细胞(myeloid derived suppressor cells,MDSC)在宫颈癌患者外周血和癌组织中的比例及亚群分布,初步探讨其临床意义。方法: 采用流式细胞术分别检测17例宫颈癌患者治疗前和20例健康者外周血、17例宫颈癌组织和15例正常宫颈组织细胞悬液中MDSC比例及其亚群分布,并分析其与鳞状细胞癌抗原的相关性。结果： 与健康者相比,宫颈癌患者外周血中MDSC比例明显增高(P＜0.01),以CD15+粒细胞样亚群为主。与正常宫颈组织细胞悬液相比,癌组织细胞悬液CD45+细胞的比例明显增加(P＜0.05),但细胞中未见CD33+表面标志的表达。宫颈癌患者外周血MDSC比例与鳞状细胞癌抗原值呈正相关(r=0.715 4,P＜0.05)。结论： 外周血中粒细胞样的MDSC可能与宫颈癌的发生发展密切相关。