表达反义细胞周期蛋白cyclinD1载体对胰腺癌细胞生长和凋亡的 …

观察反义细胞周期蛋白ｃｙｃｌｉｎＤ１对胰腺癌细胞的生长影响。方法采用Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ和Ｎｏｒｔｈｅｒｍｂｌｏｔ方法检测了５株人胰腺癌细胞中ｃｙｃｌｉｎＤ１的扩增及表达情况。     

肿瘤坏死因子α与反义寡脱氧核苷酸联合作用对人胰腺癌细胞生长的影响

目的探讨肿瘤坏死因子α（ＴＮＦα）与反义寡脱氧核苷酸的联合应用对胰腺癌细胞生长的影响。方法用ＴＮＦα和硫代正磷酸修饰的反义寡脱氧核苷酸对本室自建的胰腺癌细胞系（ＰＣ－２）进行处理，并与单独用药和未用药组进行对比。用细胞计数和噻唑蓝（ＭＴＴ）法分析细胞生长速度和增殖率，用ＲＴ－ＰＣＲ－ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔ检测药物对靶基因表达的影响，并对细胞的凋亡状况进行原位检测。结果联合用药组较单独用药组使细胞生长速度减慢的作用明显加强；针对Ｋｉ－ｒａｓ和ｃ－ｍｙｃ帽区的反义硫代正磷酸修饰的寡脱氧核苷酸（简称反义Ｋｉ－ｒａｓ和反义ｃ－ｍｙｃ）可以明显抑制内源性靶基因Ｋｉ－ｒａｓ和ｃ－ｍｙｃ的表达；ＴＮＦα与反义Ｋｉ－ｒａｓ、反义ｃ－ｍｙｃ联合应用凋亡细胞发生率为８．０％和８．４％，高于其分别单独应用的５．２％、４．８％和５．４％。结论ＴＮＦα与反义寡脱氧核苷酸的联合应用对细胞生长的影响大于单独作用。     

Polo-like激酶1反义RNA对肺癌细胞A549生长的实验研究

目的:探讨Polo-like激酶1(Plk1)基因表达下调对肺癌细胞周期分布及其生长的影响。方法:培养肺腺癌细胞株A549,构建表达Plk1反义RNA的质粒pcDNA3-Plk1,通过脂质体介导转染A549细胞,采用RT-PCR和Western blotting的方法检测Plk1基因的表达,细胞计数、BrdU脉冲标记检测细胞增殖,流式细胞仪分析细胞周期变化和凋亡,MTT法检测长春瑞宾(NVB)对各组细胞的生长抑制率。结果:A549细胞转染pcDNA3-Plk1后24h,Plk1mRNA及蛋白表达均下降;细胞变圆、漂浮、增殖减慢;S期细胞百分数(BrdU标记指数)显著低于对照组(P<0.05);转染后48hA549细胞出现G2/M期阻滞(P<0.05)并发生凋亡;等浓度化疗药物诺维本对转染pcDNA3-Plk1细胞的抑制率明显高于各对照组(P<0.05),转染pcDNA3与未转染的对照细胞差异无显著(P>0.05)。结论:pcDNA3-Plk1的转染能下调Plk1基因的表达,抑制A549细胞增殖,诱导凋亡,并能增加A549细胞对化疗药物的敏感性。     

修饰的反义寡脱氧核苷酸对胰腺癌细胞生长和靶基因表达的抑…

观察修饰过的反义寡脱氧核苷酸对人胰腺癌细胞生长和靶基因表达的抑制作用。     

表达反义Ki－ras的逆转录病毒载体对人胰腺癌细胞恶性表型的影响

用重组逆转录病毒载体构建能表达反义Ｋｉ－ｒａｓ癌基因ＲＮＡ的重组体，经磷酸钙沉淀法导入病毒包装细胞ＰＡ３１７中。ＲＮＡ杂交分析表明，转化包装细胞系中有重组病毒载体的表达。利用转化包装细胞分泌的病毒上清液感染人胰腺癌细胞系ＰＣ－２细胞，经Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ筛选得到稳定的转化细胞系。ＲＮＡ杂交证实转化的胰腺癌细胞中有病毒高度表达，靶基因表达明显减弱。反义Ｋｉ－ｒａｓＲＮＡ使人胰腺癌细胞生长速率下降约６５％。￣３Ｈ胸腺嘧啶掺入、软琼脂集落形成能力以及裸鼠致瘤能力等均显著下降。这一结果表明，反义Ｋｉ－ｒａｓ逆转录病毒载体能有效地抑制靶基因的表达，使胰腺癌细胞恶性表型部分逆转。     

反义PKCα对CNE-2Z细胞周期的影响

目的:观察蛋白激酶Cα亚型(PKCα)的反义寡核苷酸对鼻咽癌CNE-2Z细胞生长、细胞周期和cyclinE表达的影响。方法:脂质体法转染反义PKCα,MTT法测细胞生长,流式细胞仪检测细胞周期,免疫细胞化学及点印迹法检测cyclinE表达。结果:①随着反义PKCα的浓度增加,细胞生长指数逐渐降低(P＜0.01)。②反义PKCα使细胞G₁期百分比增高(P＜0.05)。③反义PKCα使细胞cyclinE的表达减弱,扫描定量反义PKCα组为对照组的66.5％±18.4％(P＜0.05)。结论:反义PKCα可通过抑制cyclinE表达、阻滞细胞于G₁期从而抑制CNE-2Z的生长。     

反义人端粒酶RNA对胃癌细胞生长的抑制效应

目的 探讨反义人端粒酶ＲＮＡ（ｈＴＲ）对胃癌细胞的生长抑制作用。方法 将反义ｈＴＲ真核表达载体经脂质体介导转染入胃癌细胞系ＳＧＣ７９０１,体外培养及接种裸鼠观察其基因转染细胞的细胞周期、超微结构变化、生长速率及致瘤性。结果 反义ｈＴＲ在潮霉素筛选的阳性克隆中稳定表达,正义ｈＴＲ表达下调,并出现凋亡改变。基因转染细胞体外传代培养的生长速率大多减慢,在裸鼠皮下的致瘤性明显降低。荷瘤鼠存活时间延长。结论     

Polo-like激酶l反义RNA对肺癌细胞A549生长的实验研究

目的： 探讨Polo-like激酶1（Plk1）基因表达下调对肺癌细胞周期分布及其生长的影响。方法： 培养肺腺癌细胞株A549，构建表达Plk1反义RNA的质粒pcDNA3-Plk1，通过脂质体介导转染A549细胞，采用RT-PCR和Western blotting的方法检测Plk1基因的表达，细胞计数、BrdU脉冲标记检测细胞增殖，流式细胞仪分析细胞周期变化和凋亡，MTT法检测长春瑞宾（NVB）对各组细胞的生长抑制率。结果： A549细胞转染pcDNA3-Plk1后24 h，Plk1 mRNA及蛋白表达均下降；细胞变圆、漂浮、增殖减慢；S期细胞百分数（BrdU标记指数）显著低于对照组（P<0.05）；转染后48 h A549细胞出现G₂/M期阻滞（P<0.05）并发生凋亡；等浓度化疗药物诺维本对转染pcDNA3-Plk1细胞的抑制率明显高于各对照组（P<0.05），转染pcDNA3与未转染的对照细胞差异无显著（P>0.05）。结论： pcDNA3-Plk1的转染能下调Plk1基因的表达，抑制A549细胞增殖，诱导凋亡，并能增加A549细胞对化疗药物的敏感性。     

人脑胶质母细胞瘤细胞系SHG-44中血管生成因子和细胞周期调控因子的表达

目的探讨人脑胶质母细胞瘤细胞系ＳＨＧ４４长期传代后的某些生物学特性和免疫表型特征。方法采用免疫组织化学和原位杂交技术对ＳＨＧ４４细胞增殖活性、中间丝蛋白共存、肿瘤蛋白、血管生成因子和细胞周期调控相关蛋白表达水平进行检测。结果传代１３０～１５０代的ＳＨＧ４４细胞呈胶质纤维酸性蛋白弱阳性而波形蛋白强阳性;Ｋｉ６７、增殖细胞核抗原平均标记指数分别为８３．５％±１０．２％、７０．０％±１８．７％。ｐ２１ｒａｓ、ｃｅｒｂＢ２、表皮生长因子及其受体、碱性成纤维细胞生长因子及其受体ＦＧＦＲ均显过度表达。血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）及ＶＥＧＦｍＲＮＡ的表达情况亦相似。该细胞还具有诱导型一氧化氮合酶表达和ｐ１６、ｐ５３、周期素依赖性激酶４、ｃｙｃｌｉｎＤ１蛋白积聚（平均标记指数分别为４３．１％±１１．２％、２０．７％±６．６％、３３．１％±１１．４％和２９．８％±４．７％）。结论ＳＨＧ４４细胞存在上述生长因子、肿瘤蛋白表达异常和细胞周期的失控,使ＳＨＧ４４细胞生长旺盛,增殖活性高,并且血管生成能力强,具有很高的恶性表型。     

三种反义c-myc RNA对肿瘤细胞凋亡的影响

c-myc是癌基因家族中最重要的成员之一，其编码产物属核蛋白类。c-Myc作为转录因子，在细胞周期调控、细胞增殖、分化、凋亡及肿瘤发生、转移等生理病理过程中发挥重要作用。近期研究还发现，c-myc与增生性心血管疾病的发生、发展密切相关。鉴于c-myc是一个在结构、功能和基因调节上都极具特色的转录因子编码基因，     

表达反义c-myc RNA的重组逆转录病毒载体对人胰腺癌细胞恶性表型的逆转作用

为研究表达反义c－mycRxA的逆转录病毒载体抑制靶基因的表达和翻译，使胰腺癌细胞恶性表型逆转的机理，利用PXTI逆转录病毒载体构建了一个能表达反义c－mycRNA的质粒，经病毒包装细胞PA317包装后，使之成为具有感染力的重组病毒。用该病毒感染人胰腺癌细胞系PC－2细胞，经G418筛选得到稳定的转化细胞系。Northernblot杂交证实包装细胞PA317及转化的PC－2细胞中均有病毒的高表达，体外合成的单链RNA探针杂交结果表明转化PC－2细胞中有高表达的反义c－mycRNA，而内源性c－mycRNA的表达明显受抑；Westernblot分析发现c－myc癌基因产物P62蛋白的表达显著下降。反义c－mycRNA使人胰腺癌细胞生长速率、~3H-胸腺嘧啶掺入、软琼脂集落形成能力以及探鼠致瘤能力等均明显下降。实验结果表明：表达反义c－mycRNA的逆转录病毒载体能有效地抑制靶基因的表达和翻译，使胰腺癌细胞恶性表型部分逆转。     

人胰腺混合性导管-内分泌癌细胞系的建立

目的 建立胰腺混合性导管－内分泌癌细胞系。方法 从一轩性患者胰头切除的肿瘤组织取材,切割为细小的组织块接种于裸鼠皮下,经过裸鼠的两次过渡后,再取第二裸鼠皮下的肿瘤组织,切割为非常小的组织块,用含有１０％胎牛血清的培养基接种至培养瓶进行体外培养。结果 该细胞系目前已传至５５代。这一细胞系同时具有内、外分泌胰腺癌的形态特征,并得到了免疫组化标记和组织化学染色的证实。电镜下,部分细胞内含有神经分泌颗粒。     

同源无启动子DNA片段抑制人胰腺癌细胞株整合基因的表达

目的观察仅转染无启动子绿色荧光蛋白（GFP）的cDNA全长片段能否使整合有GFP基因的胰腺癌细胞内GFP表达降低。方法用pEGFP—C1质粒转染人胰腺癌细胞株PANC-1,G418筛选及流式细胞术分选建立GFP蛋白高表达的稳定细胞株。用PCR方法从pEGFP—C1扩增出GFP基因全长cDNA并将其克隆至无启动子的复制型质粒PUC19,得到重组质粒即PUC—GFP。实验分为4组：空白对照组、空质粒组（PUC组）、GFP重组质粒干扰组（PUC—GFP组）、GFP小RNA干扰组（siGFP组）。分别用稳定表达GFP和未经处理PANC-1细胞进行实验。用Western印迹、流式细胞术与倒置荧光显微镜检测重组质粒对细胞内稳定表达的GFP的影响及对GFP阴性细胞pEGFPC1质粒瞬时转染后绿色荧光表达强度的影响。结果PUC—GFP可使稳定细胞株内的GFP表达下降,并且呈剂量依赖性。PUC—GFP组绿色荧光强度减弱程度和空白对照及空质粒组差异有统计学意义（P〈0．05）和siGFP组差异无统计学意义（P〉0．05）。转染后第4天GFP表达降低并可持续至第6天,第4天后PUC—GFP组和siGFP组对GFP的抑制差异无统计学意义（P〉0．05）。PUC—GFP与pEGFP—C1共转染GFP阴性PANC-1细胞株可使pEGPC1的瞬时转染效率降低。这两种情况下,荧光降低程度均和转染PUC—GFP的量呈正相关。结论仅转染无启动子的某个特定基因的全长cDNA能使哺乳细胞内相应同源性基因的表达降低。DNA干扰可用于哺乳动物细胞。     

四环素调控表达的反义bcl-2对人神经母细胞瘤细胞系SK-N-MC生长和凋亡的作用

目的 研究由四环素调控的反义bcl-2的表达对人神经母细胞瘤细胞系SK－N－MC细胞的生长和凋亡的作用并初步探讨其相关机制。方法 非定向克隆构建携带反义bcl-2 cDNA片段的由四环素调控表达的真核细胞表达载体PUCCOMB1^CMV/Asbcl-2;应用脂质体Lipofectamine^TM介导转染SK－N－MC细胞,同时以空载体转染细胞作为对照。MTT法研究细胞的生长和增殖状况,提取DNA梯带和应用流式细胞术检测凋亡细胞。逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）研究细胞凋亡中bcl-xL/bcl-xS基因在mRNA水平上表达的变化。Western杂交检测bcl-2及其上下游相关基因caspase-3、PARP的变化。结果 转染反义bcl-2的细胞生长增殖缓慢,在去血清培养的相同的时间内其凋亡细胞数也明显多于对照组细胞,提前出现DNA梯带。在细胞的凋亡过程中检测到非活性caspase-3酶原蛋白减少并检测到bcl-2、PARP蛋白的降解产物条带。但bcl-xL/bcl-xS基因在mRNA水平上表达无明显变化。结论 反义bcl-2 mRNA可抑制SK－N－MC细胞的生长和增殖,促进去血清培养所诱导的SK－N－MC细胞的凋亡。大细胞凋亡过程中caspase-3被激活,bcl-2和PARP蛋白被裂解,但bcl-xL/bcl-xS在反义bcl-2 mRNA诱导的SK－N－MC细胞的凋亡过程中无变化。     

细胞周期蛋白E对乳腺癌细胞MCF-7生长及周期相关基因的影响

观察细胞周期蛋白（ｃｙｃｌｉｎ）Ｅ的表达对乳腺癌细胞ＭＣＦ－７生长及其他周期相关基因的影响。方法构建正义和反义ｃｙｃｌｉｎ Ｅ ｃＤＮＡ真核表达载体,并采用ｌｉｐｏｆｅｃｔ ＡＭＩＮＥ转染,将其导入ＭＣＦ－７细胞,获得稳定表达正义及反义ｃｙｃｌｉｎＥ的细胞系,经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测有外源性片片段的插入及表达,并作细胞生长曲线、四甲偶氮唑盐（ＭＴＴ）法和流式细胞计数分析;用     

不同药物敏感基因对人胰腺癌细胞PC-2的杀伤作用

目的比较单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶（ＨＳＶＴＫ）／丙氧鸟苷（ＧＣＶ）和胞嘧啶脱氨基酶（ＣＤ）／５氟胞嘧啶（５ＦＣ）两系统对人胰腺癌ＰＣ２细胞的杀伤作用。方法构建表达ＨＳＶＴＫ和ＣＤ基因的重组逆转录病毒载体,将其直接导入胰腺癌细胞;噻唑蓝法检测转化细胞对前体药物的敏感度及５０％细胞受抑制时的药物浓度,即ＩＣ５０值,并对旁观者效应进行观察比较。结果ＨＳＶＴＫ基因转化细胞ＩＣ５０值为（１０６±０１２）μｍｏｌ／Ｌ,比未转化细胞下降５５８倍;ＣＤ基因转化细胞ＩＣ５０值为（３３００±０９５）μｍｏｌ／Ｌ,比未转化细胞下降２５８倍;混合细胞中含１０％的转化细胞时,ＨＳＶＴＫ／ＧＣＶ系统的生长抑制率为３９％,ＣＤ／５ＦＣ系统为５０３％。结论两系统对胰腺癌细胞ＰＣ２均有很好的杀伤和抑制细胞生长作用,ＨＳＶＴＫ／ＧＣＶ系统的治疗指数较高,但其旁观者效应弱于ＣＤ／５ＦＣ系统     

应用光谱染色体核型分析技术研究胰腺癌细胞系P2染色体核型

目的 探讨胰腺癌的细胞遗传学特征.方法 采用光谱核型分析技术对中国人胰腺癌细胞系P2的染色体核型进行分析,并选择EGFR/CEP 7双色荧光原位杂交(FISH)探针,对比分析10例胰腺癌和10例慢性胰腺炎石蜡标本的EGFR基因拷贝数,验证光谱核型分析结果.结果 P2细胞系为亚三倍体核型,共发现26种染色体异常,其中重复出现的染色体异常改变为染色体4、9、18、19、22、Y、10p、15p、8p、6q和12p缺失,染色体7和12q增加,以及染色体结构畸变der(9;15)(q10;q10)、der(10)(3;10)(?;q26)和der(12)(8;12)(?;p13).EGFR-FISH阳性为4/10.结论 胰腺癌细胞系的染色体重排非常复杂,进一步扩大样本量进行相关分析,包括了解胰腺癌的EGFR-FISH阳性率非常有必要.     

阿司匹林对胰腺癌细胞周期的影响及其机制

目的： 观察阿司匹林及其催化产物前列腺素E2（PGE2）对胰腺肿瘤细胞周期及细胞周期相关蛋白p21Wafl/cipl、p27Kipl/pic2表达的影响，探讨阿司匹林抗胰腺癌的作用机制。 方法： 以阿司匹林和PGE2处理胰腺癌细胞后，分别采用MTT检测细胞活力、ELISA检测细胞内PGE2浓度、流式细胞仪检测细胞周期变化、Western blotting检测细胞周期相关蛋白p21Wafl/cipl和p27Kipl/pic2的表达水平。 结果： 阿司匹林可抑制胰腺癌细胞生长并呈剂量依赖性减少细胞内PGE2的生成；阿司匹林可诱导细胞周期相关蛋白p21Wafl/cipl和p27Kipl/pic2表达升高并引起细胞阻滞在G0/G1期。但外源性PGE2并不能拮抗阿司匹林对细胞活力、细胞周期及细胞周期相关蛋白的影响。 结论： 阿司匹林抑制胰腺癌细胞的生长可能并非完全通过环氧合酶途径；诱导p21Wafl/cipl和p27Kipl/pic2表达的升高、进而诱导细胞周期的阻滞可能是其作用机制之一。