EBV立即早期基因-BRLF1和BZLF1的研究进展

BRLF1和BZLF1是EBV基因组中位置相邻的两个立即早期基因。它们的蛋白表达产物Rta和Zta作为反式激活因子，可以调节EBV早期／晚期基因的表达，还可能参与病毒基因组的复制。它们与EBV感染由潜伏周期向裂解周期的转换密切相关。不同的细胞环境可能对它们的转录产生影响。Rta和Zta都包含CTL识别的表位，可能在病毒裂解周期的早期成为免疫系统识别的位点。对它们的研究还为某些EBV相关肿瘤的筛查和治疗提供了线索。这两个基因对EBV再激活的作用倍受关注。本文主要对BRLF1和BZLF1的基因结构和功能做一综述。Epstein-Barr病毒（EBV）是疱疹病毒科γ亚科成员，世界人口的90％感染此病毒。EBV可引起传染性单核细胞增多症，与Burkitt’S淋巴瘤、鼻咽癌的发生密切相关。EBV有潜伏周期和裂解周期两种状态。EBV进入细胞后，通常很快进入潜伏期，病毒基因组环化成游离体（episome）并以此形式持续存在于细胞内。但病毒在少数感染细胞中可以进入增殖期，并产生病毒颗粒。研究表明，BZLF1和BRLF1两个基因在病毒由潜伏周期向裂解周期转变的过程中起重要作用。     

EBV即刻早期基因BZLF1腺病毒表达载体的构建及初步应用

目的 构建EBV即刻早期基因BZLF1的重组腺病毒表达载体，探讨其表达诱导潜伏状态EBV进入裂解期增殖的作用。方法采用AdEasy系统构建携带BZLFl的重组腺病毒载体padBz，脂质体法转染人胚肾293细胞，包装产生重组腺病毒vAd-BZ。vAd-BZ感染EBV阳性细胞NEC后，采用RT-PCR、Westemblot、流式细胞术和MTT等方法检测目的基因表达，以及目的基因表达对EBV阳性细胞的影响。结果 PCR、序列测定以及限制性酶切证实BZLFI基因正确插入穿梭质粒，并与病毒骨架质粒pAdEasy-1重组，重组腺病毒表达载体构建成功。经293细胞包装获得具有稳定感染性的重组腺病毒vAd-BZ，感染重组腺病毒的NEC靶细胞可以检测到BZLF1基因的表达，进而诱导EBV从潜伏期进入裂解期。结论 重组腺病毒vAd-BZ可有效感染EBV阳性细胞NEC，诱导潜伏状态的EBV活化．讲而特异件杀伤EBV阳件肿瘤细胞。     

TLR激动剂抑制IL-27诱导的THP-1细胞HLA-DR的表达

目的研究白介素27(IL-27)对THP-1单核细胞系Ⅱ类转录活化子(classⅡtransactivator,CⅡTA)和Ⅱ类主要组织相容性复合物(major histocom patibility complex classⅡ,MHCⅡ)分子的表达的影响及Toll样受体(Toll-likereceptor,TLR)激动剂LPS和Pam3CSK4的干预作用。方法RT-PCR检测CⅡTAⅠ、Ⅲ和Ⅳ以及人白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)-DRA和干扰素调节因子-1(interferon regulatory factor-1,IRF-1)mRNA的表达。半定量PCR检测HLA-DRA、DRB、DPA、DPB、DQA、DQB、IRF-1、CⅡTA mRNA的表达。流式细胞术检测细胞表面HLA-DR的表达。结果IL-27刺激24h后可分别上调THP-1细胞CⅡTAⅢ、CⅡTAⅣ和IRF-1mRNA表达水平。IL-27刺激24h和48h可升高MHCⅡ类分子mRNA的表达,并能诱导HLA-DR在28%和53%的THP-1细胞表面表达。在THP-1细胞和PMA诱导的THP-1巨噬细胞,LPS和Pam3CSK4均可抑制IL-27诱导的CⅡTA和HLA-DR的表达。结论IL-27可上调THP-1细胞CⅡTA和MHCⅡ类分子的表达,这种作用可被LPS和Pam3CSK4抑制。     

青蒿琥酯通过抑制ERK1/2蛋白活化负性调控HSC-T6细胞cyclin D1的表达和AP-1活性

目的: 通过观察青蒿琥酯(artesunate,Art)对肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)细胞外信号调节蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)、激活蛋白1(activator protein 1,AP-1)和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的影响,探讨Art抗肝纤维化的分子机制。方法: 用血小板源性生长因子BB(platelet-derived growth factor BB, PDGF-BB)诱导HSC-T6细胞的增殖。实验分为对照组、PDGF-BB组、PDGF-BB+Art组(Art终浓度6.25 mg/L、25 mg/L、50 mg/L)和PDGF-BB+ERK抑制剂PD98059组。ELISA法测定细胞上清液中Ⅰ型胶原的含量,RT-PCR检测各组ERK1/2和cyclin D1 mRNA水平变化,Western blotting法检测各组p-ERK1/2和cyclin D1蛋白表达水平,凝胶电泳迁移率实验(EMSA)检测AP-1的活性。结果: (1)PDGF-BB 可明显促进HSC-T6细胞的增殖,PDGF-BB+Art各剂量组和PDGF-BB+PD98059均可抑制HSC-T6细胞上清液中Ⅰ型胶原的含量(P<0.05,P<0.01)。(2)PDGF-BB+Art组(50 mg/L)ERK1/2 mRNA的表达低于PDGF-BB组(P<0.05),其中PDGF-BB+PD98059组ERK1/2 mRNA的表达最低(P<0.01);PDGF-BB+Art组(25 mg/L、50 mg/L)和PDGF-BB+PD98059组cyclin D1 mRNA的表达明显低于PDGF-BB组(P<0.05,P<0.01)。(3)p-ERK1/2、cyclin D1蛋白表达水平在PDGF-BB组最高,而PDGF-BB+Art各剂量组和PDGF-BB+PD98059组降低(P<0.05,P<0.01)。(4)Art可使AP-1与DNA结合活性下降。结论: Art可抑制HSC-T6细胞增殖,其机制可能与其抑制ERK1/2蛋白活化从而降低AP-1的活性和下调cyclin D1的表达有关。     

生物钟蛋白CRY1抑制Ang Ⅱ诱导的小鼠主动脉平滑肌细胞表型蛋白标志物变化

目的 探讨生物钟(circadian clock)相关蛋白隐花色素1(CRY1)在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的小鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)表型转化中的作用。方法 将VSMCs分为对照(control)组和实验组,用不同浓度AngⅡ处理VSMCs不同时间,RT-PCR和Western blot检测收缩型标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、合成型标志物骨桥蛋白(OPN)及CRY1 mRNA和蛋白的表达;分别构建CRY1的干扰RNA(siCRY1)、YAP1的干扰RNA(siYAP1)进行基因沉默,构建CRY1的过表达质粒(pcDNA-CRY1)进行过表达,RT-PCR、Western blot双重验证各基因组mRNA和蛋白的表达;将VSMCs分为4组,对照组、AngⅡ组、AngⅡ+siCRY1组、AngⅡ+pcDNA-CRY1组,将siCRY1、siYAP1、pcDNA-CRY1转染至经AngⅡ处理VSMCs中,RT-PCR和Western blot检测α-SMA、OPN、CRY1、YAP1 mRNA和蛋白的表达及CCK-8法检测细胞增殖情况。结果 不同浓度AngⅡ刺激VS...     

人C1q分子对Raji,U937细胞产生IL—1活性的抑制调节

为探讨Ｃ１ｑ与免疫细胞产生的ＩＬ－１活性的关系，采用Ｒａｊｉ，Ｕ９３７及对照ＭｏｌＴ４三株培养细胞与Ｃ１ｑ共同孵育２０ｈ后收集细胞上清、以＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入法检测ＩＬ－１活性，结果显示Ｃ１ｑ能明显抑制Ｒａｊｉ及Ｕ９３７细胞ＩＬ－１活性，对ＭｏｌＴ４细胞无此作用，Ｆ（ａｇ‘）２ａｎｉｔＣ１ｑ可阻断此抑制作用。     

CIITA M1-RNA抑制HeLa细胞表面MHC Ⅱ类抗原的表达

探讨MHC Ⅱ类转录激活因子(CIITA)的M1-RNA对细胞表面MHC Ⅱ类分子表达的抑制.M1-RNA是核糖核酸酶P的催化活性单位,设计并克隆针对CIITA第452、629位点的M1-RNA(分别为M1-452-GS、M1-629-GS)及其相应的CIITA靶基因,分别插入pUC19、pGEM-7zf( )载体,进行细胞外切割活性筛选.将细胞外切割作用明显的M1-629-GS亚克隆入psNAV载体(psNAV-M1-629-GS,pA629)并稳定转染HeLa细胞株,流式细胞术检测经典的MHC Ⅱ类抗原(HLA-DR、-DP、-DQ)的表达,RT-PCR检测CIITA的mRNA水平.在重组人γ干扰素诱导下,pA629阳性HeLa细胞株表面HLA-DR、-DP抗原表达分别降低了83.03%及89.91%;同时CIITA的mRNA含量明显减少(P＜0.05).CIITA的M1-RNA抑制了自身mRNA含量,从而阻止其调控的MHC Ⅱ类分子的表达,为移植物抗宿主病的研究提供了一种新方法.     

人C_1q分子对Raji、U_（937）细胞产生IL－1活性的抑制调节

为探讨Ｃ_１ｑ与免疫细胞产生的ＩＬ－１活性的关系，采用Ｒａｊｉ、Ｕ_（９３７）及对照ＭｏｌＴ_４三株培养细胞与Ｃ_１ｑ共同孵育２０ｈ后收集细胞上清，以３~Ｈ－ＴｄＲ掺入法检测ＩＬ－１活性，结果显示Ｃ_１ｑ能明显抑制Ｒａｊｉ及Ｕ_（９３７）细胞ＩＬ－１活性，对ＭｏｌＴ_４细胞无此作用，Ｆ（ａｂ＇）_２ａｎｔｉＣ_１ｑ可阻断此抑制作用；初步探讨其作用机制，推测可能Ｃ_１ｑ通过Ｃ_１ｑ受体刺激该细胞产生ＩＬ－１ＩＮＨ而抑制ＩＬ－１活性。     

miR-93-5p靶向MICA基因促进宫颈癌细胞活力并上调NK细胞Th1细胞因子表达

为研究miR-93-5p、主要组织相容性复合体Ⅰ类相关基因A(MHC classⅠchain-related gene A, MICA)对宫颈癌细胞增殖及NK细胞Th1细胞因子分泌的影响及机制,采用qRT-PCR法检测人正常宫颈细胞Ect1/E67、人宫颈癌细胞HeLa中miR-93-5p的表达;在miR-93-5p mimics组(转染miR-93-5p mimics)、miR-NC组(转染miR-NC)、pcDNA 3.1-MICA组(转染pcDNA 3.1-MICA)和pcDNA 3.1组(转染pcDNA 3.1)中用脂质体转染HeLa细胞,并与NK细胞共培养;MTT法检测各组细胞增殖率;ELISA检测各组细胞中Th1细胞因子IFN-γ、TNF-α含量;Western blotting检测各组细胞中MICA蛋白的表达量。结果显示,与Ect1/E67细胞相比,HeLa细胞中miR-93-5p的表达水平显著升高(P0.05),且miR-93-5p靶向MICA;抑制miR-93-5p、过表达MICA均可显著下调HeLa细胞的增殖率,上调IFN-γ、TNF-α表达。由此,miR-93-5p可促进宫颈癌细胞增殖,抑制NK细胞杀伤能力,或可为宫颈癌的靶向治疗提供新靶点。     

脱氧核酶抑制鼻咽癌细胞EBV-LMP1的表达

目的 探讨l 0- 23脱氧核酶(1 0-23DR z)对鼻咽癌生长的抑制作用。 方法 设计合成针对EBV-LMP1的l0-23DRz,并对其进行硫代磷酸化修饰,同时针对该位点设计突变型DR z和反义寡核苷酸,经脂质体转染C666-1细胞中观察其对LMP1基因表达的抑制效应;建立裸鼠皮下鼻咽癌移植瘤,瘤体内注射脱氧核酶及其类似物,观察其对LMP1基因及肿瘤生长的抑制效应。 结果 有效转染后,脱氧核酶在细胞内抑制LMP1基因表达;成功建立裸鼠移植瘤模型后,脱氧核酶能高效抑制LMP1基因表达,并能抑制肿瘤生长,其作用较突变型脱氧核酶和反义寡核苷酸强（P<0.05）。 结论 脱氧核酶在鼻咽癌细胞中及移植瘤模型中都能高效抑制LMP1的表达,可能成为一种高度特异性的、高效的基因治疗剂。     

Clq诱导Raji和U937细胞产生IL－1ra

Ｃｌｑ刺激Ｒａｊｉ和Ｕ９３７细胞２４ｈ，其上清中含ＩＬ－１抑制活性。抗人ｒＩＬ－１ｒａ抗血清能识别上清中一个约２２～２４ＫＤ的蛋白分子，并可中和其ＩＬ－１抑制活性，证实上清中的活性成份是ＩＬ－１ｒａ。Ｃｌｑ以特异、剂量依赖及可饱和的方式诱导这些细胞产生ＩＬ－１ｒａ，表明是Ｃｌｑ／ＣｌｑＲ系统介导了ＩＬ－１ｒａ的产生。资料提示：Ｃｌｑ／ＣｌｑＲ系统在炎症、免疫应答及细胞因子网络的调节中起重要作用。     

B7-1 mAb对B系淋巴瘤Raji细胞的生长抑制和凋亡诱导作用

为了研究B7 1分子功能性mAb (6H2 )对表达B7 1分子的B系淋巴瘤Raji细胞的生物效应。分别运用免疫荧光标记和流式细胞仪技术 (FACS )、台盼蓝拒染试验、MTT试验和RT PCR半定量分析 ,分析 6H2对Raji细胞的生长抑制和凋亡诱导作用。结果显示 ,6H2能抑制天然表达B7 1分子的人B系淋巴瘤Raji细胞的生长 ,产生细胞周期G2 /M的阻滞 ,上调细胞表面CD18和CD95 (Fas )的表达 ,且能使Raji细胞中Bax的相对转录表达显著增加 ,从而诱导Raji细胞的凋亡。 6H2为功能性抗人B7 1分子特异性mAb ,具有抑制Raji细胞生长和凋亡诱导作用 ,在B系淋巴瘤研究和生物治疗中具有应用价值。     

大黄素通过上调Smad4蛋白表达抑制胰腺癌细胞

目的以Jab1为作用靶点探讨大黄素抗胰腺癌作用及可能的机制。方法 293T细胞随机分为对照组(不处理)、大黄素组(20μmol/L大黄素处理)、Jab1组(转染HA-Jab1质粒),用免疫印迹实验(Western blot)法测定胰腺癌PANC-1和As PC-1细胞系中Jab1与Smad4的蛋白表达。用免疫共沉淀(IP)测定大黄素组及Jab1对β-Tr CP1与Smad4结合的影响。采用Western blot法检测对照组及大黄素干预组PANC-1和As PC-1细胞系中Smad4蛋白表达。结果胰腺癌PANC-1细胞和As PC-1细胞中Jab1呈高表达,Smad4呈低表达,Jab1与Smad4呈负相关关系(P0.01)。293T细胞中Jab1能促使β-Tr CP1与Smad4结合,促进Smad4蛋白降解;而大黄素通过抑制β-Tr CP1与Smad4结合,增加Smad4的表达水平(均P0.05)。结论与Jab1的作用相反,大黄素可能通过抑制泛素化酶途径,抑制Smad4的降解,从而起到抗肿瘤作用。     

Tau蛋白过度磷酸化诱导Aβ生成抑制THP-1细胞ABCA1的表达

目的：探讨过度磷酸化Tau蛋白在动脉粥样硬化发生中的作用及其可能机制。方法：体外培养人单核细胞系THP-1,经佛波酯诱导分化为巨噬细胞,建立人盐洗血小板与THP-1（人单核细胞）源性巨噬细胞共孵育生成泡沫细胞的体外模型。免疫细胞化学法检测过磷酸化Tau蛋白和β淀粉样蛋白的生成。用岗田酸（OA）诱导其Tau蛋白过磷酸化,Western blot观察Tau蛋白T231和S396两个位点磷酸化程度及β淀粉样蛋白水平,RT-PCR法检测三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）mRNA表达水平。结果：OA引起Tau蛋白剂量依赖的过度磷酸化,并增加β淀粉样蛋白的生成,同时下调ABCA1 mRNA水平的表达（P〈0．05）。结论：Tau蛋白过度磷酸化诱导β淀粉样蛋白的生成并下调ABCA1 mRNA水平的表达,可能是动脉粥样硬化斑块形成和发展的机制之一。     

凋亡抑制蛋白c-IAP1和Caspase-3在喉癌中表达的研究

喉癌是耳鼻咽喉外科常见的肿瘤之一,其逐年增加的发病率和死亡率严重威胁着患者的健康,其中以鳞状细胞癌（约90%）为主,其次是腺癌。凋亡抑制蛋白c-IAP1和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的表达与喉癌的发展变化关系密切。本文将凋亡抑制蛋白c-IAP1和Caspase-3在喉癌中的表达作用进行了系统综述。     

下调赖氨酰氧化酶样蛋白1(LOXL1)表达抑制乳腺癌细胞的增殖与迁移

目的 探究赖氨酰氧化酶样蛋白1(LOXL1)基因对乳腺癌细胞的增殖及迁移能力的影响。方法 利用基因表达谱交互分析(GEPIA)与Kaplan-Meier分析确定乳腺癌组织LOXL1的表达以及与乳腺癌患者预后的关系。通过慢病毒稳定转染技术,稳定敲低MDA-MB-231细胞和MCF7细胞的LOXL1。采用集落形成实验、 CCK-8法、 5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(EdU)染色实验检测敲低LOXL1对乳腺癌细胞增殖能力的影响,划痕实验以及Transwell^TM实验检测敲低LOXL1对乳腺癌细胞迁移能力的影响。结果 与正常组织相比,LOXL1在乳腺癌组织高表达,且与不良预后相关;敲低MDA-MB-231、 MCF7乳腺癌细胞LOXL1后,细胞增殖和迁移能力明显降低。结论 敲低LOXL1降低乳腺癌细胞的增殖及迁移能力。     

肝癌及肝硬化组织中ICAM-1和ToPoⅡ的表达

目的　探讨细胞间黏附分子 1(ICAM 1)和拓扑异构酶Ⅱ (TopoⅡ )作为判断肝硬化及肝癌发展程度及预后指标的可能性。方法　应用免疫组化S P法对 32例肝细胞癌和癌旁组织、2 6例肝硬化和 10例正常肝组织标本进行ICAM 1和TopoⅡ标记。结果　ICAM 1和TopoⅡ表达率分别为肝癌 84 3%、6 2 5 % (2 7/32 ,2 0 /32 ) ;癌旁组织为 6 8 7%、4 6 8% (2 2 /32 ,15 /32 ) ;肝硬化为 6 5 3% ,38 4 % (17/2 6 ,10 /2 6 )。 10例正常肝组织无表达及弱表达 ,阳性率与组织学分类相关 ,肝癌组织中I CAM 1和TopoⅡ含量明显高于癌旁及肝硬化组织 (P <0 0 1) ,而癌旁及肝硬化组织中表达差异无显著性 (P >0 0 5 )。 结论肝组织中ICAM 1和TopoⅡ的过度表达在一定程度上可以反应肝癌、肝硬化发展及细胞增殖活性 ,有可能作为判断预后的指标之一。     

烟碱抑制RAW264.7细胞表达和释放HMGB1的机制

目的:探讨烟碱抑制RAW264.7细胞HMGB1表达和释放的机制。方法:(1)RAW264.7细胞在6孔板分组培养:仅加培养液为对照组(C);加LPS250μg/L为LPS组(LPS);在LPS基础上加烟碱1μmol/L和10μmol/L分别为烟碱1组(N1)和烟碱2组(N2)。培养24h后,RT-PCR检测各组细胞HMGB1 mRNA表达水平;Western blotting检测上清液和胞浆、胞核HMGB1含量。(2)用鼠α7nAChR基因反义和正义链RNA转染培养细胞后,再加含LPS250μg/L和10μmol/L烟碱于培养液分别作为反义链组(antisense RNA)和正义链组(senseRNA);以上述C组和LPS组为对照,2h后Western blotting检测上清液HMGB1量。结果:(1)C组细胞HMGB1 mRNA呈低水平表达(1659.20±121.05);细胞HMGB1 mRNA表达水平在N1和N2组及LPS组间差异无显著(P0.05)。(2)LPS组上清液的HMGB1量较高(445.34±28.52);N1和N2组上清液的HMGB1量显著低于LPS组(P0.05)。(3)C组胞核HMGB1量较高(335.46±12.24);而LPS组胞核HMGB1量明显低于对照组(P0.05);N1组和N2组胞核HMGB1显著高于LPS组(P0.05)。(4)AntisenseRNA组与LPS组比,培养液中HMGB1量无显著差异(P0.05);senseRNA组与LPS组比,HMGB1含量明显减少(P0.05)。结论:烟碱对RAW264.7细胞释放HMGB1有明显抑制作用;其主要机制可能是通过与α7nAChR特异结合而影响HMGB1的核转位。     

非小细胞肺癌中窖蛋白1基因的蛋白表达和甲基化及其意义

目的 检测窖蛋白1(Car-1)在非小细胞肺癌(NSCLC)中的蛋白表达以及启动子的甲基化状况,探讨Cav-1基因在NSCLC中的作用及其临床意义.方法 应用免疫组织化学(sP法)和量子点Qd600染色检测123例NSCLC组织、17例良性病变肺组织中Cav一1蛋白表达和亚细胞定位.亚硫酸氢钠处理DNA,甲基化特异性PCR(MSP)检测Cav-1基因启动子区域的甲基化水平.结果 Cav-1蛋白在肺支气管黏膜上皮细胞、肺泡上皮细胞、毛细血管内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞的胞质和胞膜高表达.癌旁组织(对照)组和肺癌组中Cav-1蛋白的阳性率分别为17/17、43.1%(53/123),两组间差异有统计学意义(P=0.001);Cav-1蛋白在NSCLC不同的组织学类型(P=0.552)和分化程度(P=0.160)中差异均无统计学意义.Cav-1蛋白阳性率与NSCLC的TNM分期(P=0.001)以及淋巴结转移(P=0.001)均相关.在40例Cav-1蛋白表达为阴性的肺癌组织和12例癌旁肺组织,MSP法均未检测到Cav-1因启动子区域的甲基化.结论 Cav-1蛋白失表达的机制可能与启动子区是否甲基化无关.Cav-1蛋白高表达预示NSCLC恶化进展和高侵袭性.     

可溶性Klotho蛋白抑制THP-1源性泡沫细胞形成

目的:探讨可溶性Klotho(KL)蛋白对THP-1源性泡沫细胞形成的影响。方法:THP-1单核细胞与160 nmol/L佛波酯孵育48 h后,诱导分化为THP-1源性巨噬细胞,给予THP-1源性巨噬细胞不同浓度(25、50、100和200μg/L)的可溶性KL蛋白预处理后,再由氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导其转变为泡沫细胞。油红O染色观察细胞内脂滴形成情况,通过液体闪烁计数法测定THP-1源性泡沫细胞内胆固醇流出情况,酶荧光法检测细胞内游离胆固醇及胆固醇酯的含量,并分别用Western blot法及RT-qPCR法检测酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1(ACAT1)和ATP结合盒转运体A1(ABCA1)的蛋白及mRNA表达。结果:可溶性KL蛋白能增加THP-1源性巨噬细胞内胆固醇流出,抑制THP-1源性泡沫细胞形成,且可溶性KL蛋白呈一定浓度依赖性地抑制ox-LDL诱导的泡沫细胞形成过程中ACAT1表达的上调和ABCA1表达的下调(P<0.05)。结论:可溶性KL蛋白能够抑制THP-1源性泡沫细胞形成,其机制可能与靶向调控细胞内ACAT1和ABCA1的表达有关。