依巴斯汀通过抑制AKT/mTOR通路诱导人黑素瘤细胞自噬

目的：研究依巴斯汀对人黑素瘤细胞自噬的影响及机制。方法：体外培养人黑素瘤细胞A375和M14,采用CCK-8增殖实验检测细胞活力,并计算IC50;利用mCherry-EGFP-LC3B双荧光指示系统检测自噬流;采用Western blot验证自噬相关蛋白LC3,Beclin1及信号通路蛋白的表达。结果：依巴斯汀可显著抑制人黑素瘤细胞的活力;依巴斯汀明显诱导人黑素瘤细胞中自噬小体和自噬溶酶体的产生;依巴斯汀显著上调人黑素瘤细胞中LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值以及Beclin1的表达,同时抑制AKT/mTOR信号通路的活化,降低p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR。结论：依巴斯汀通过抑制AKT/mTOR通路诱导人黑素瘤细胞自噬的发生。     

依维莫司对顺铂产生抗人皮肤鳞状细胞癌COLO-16细胞效应的增效作用研究

目的 探讨依维莫司是否增加顺铂对人皮肤鳞状细胞癌COLO-16细胞的杀伤效应.方法 分别用50、100、200 nmol/L的依维莫司和25 μmol/L顺铂处理人皮肤鳞状细胞癌系COLO-16细胞12、24h,用AO标记自噬体囊泡并结合溶酶体酶抑制剂分析自噬和自噬流水平.Western印迹分析自噬标记性分子LC3-Ⅰ→LC3-Ⅱ转化、Caspase 3和PARP剪切;LDH释放实验分析细胞死亡;Annexin V-EGFP染色分析细胞凋亡.结果 50、100、200 nmol/L的依维莫司处理COLO-16细胞后,12 h LC3-I→LC3-Ⅱ转换值分别为3.52±0.21、4.03±0.39、5.05±0.22,两两之间比较,差异无统计学意义(P＞0.05),与未用药物处理的对照组(2.07±0.05)比较,差异有统计学意义(P＜0.05).24 hLC3-I→LC3-Ⅱ转换值分别为3.38±0.26、3.29±0.06、6.57±0.16,两两之间比较,差异无统计学意义(P＞0.05),与对照组(2.61％±0.16％)比较,差异有统计学意义(P＜0.05).50、100、200 nmol/L的依维莫司联合E64d、pepstatin处理COLO-16细胞12h后,LC3-Ⅱ与β肌动蛋白的比值分别为1.26±0.40、1.16±0.34、1.21±0.39,与E64d、pepstatin单独处理细胞组(1.19±0.27)比较,差异无统计学意义(P＞0.05).100 nmol/L依维莫司联合E64d、pepstatin自噬体囊泡表达阳性率2.06±0.61,与E64d、pepstatin单独处理细胞组(1.68±0.62)比较,差异无统计学意义(P＞0.05).依维莫司与顺铂联合处理24 h细胞死亡率42.58％±0.93％,高于顺铂单独处理的细胞(死亡率18.20％±1.46％),差异有统计学意义.依维莫司联合顺铂处理与顺铂单独处理细胞相比,Caspase 3和PARP剪切、Annexin V标记细胞数以及LC3-Ⅱ形成均无统计学差异(P＞0.05).结论 依维莫司增强顺铂诱导COLO-1细胞死亡,这种效应不依赖于凋亡和自噬调控.     

窄谱中波紫外线对体外培养人黑素细胞自噬水平的影响

目的 观察窄谱中波紫外线（NB?UVB）照射对黑素细胞自噬水平的影响,探讨NB?UVB治疗白癜风的可能机制。方法 体外培养正常人黑素细胞给予单次0（对照组）、50、100和200 mJ/cm2 NB?UVB照射,照射后24 h收集细胞,单丹酰戊二胺染色法（MDC）检测细胞自噬体变化,免疫印迹法检测自噬信号磷酸化磷酸腺苷蛋白激酶（p?AMPK）、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p?mTOR）、微管相关蛋白轻链3Ⅱ/Ⅰ（LC3Ⅱ/Ⅰ）及P62表达变化,透射电镜观察自噬体与黑素小体超微结构变化。免疫印迹结果采用单因素方差分析进行比较,黑素小体、自噬体与自噬溶酶体数量采用Kruskal?Wallis H检验进行统计分析。结果 MDC染色显示,对照组、50、100和200 mJ/cm2 NB?UVB组自噬体染色阳性率分别为（21.83 ± 3.50）、（23.66 ± 4.12）、（38.08 ± 4.10）、（40.23 ± 1.45）%,100、200 mJ/cm2组显著高于对照组和50 mJ/cm2 NB?UVB组（均P < 0.05）。免疫印迹法显示,与对照组相比,100、200 mJ/cm2组p?AMPK、LC3Ⅱ/Ⅰ表达均显著上调（均P < 0.05）,而p?mTOR及P62表达均显著下降（均P < 0.05）。透射电镜结果显示,与对照组自噬体与自噬溶酶体数量（1.88 ± 1.18）相比,100、200 mJ/cm2组（5.12 ± 1.13、5.25 ± 1.04）均显著增多（P < 0.05）。50、100、200 mJ/cm2组黑素小体数量（39.12 ± 9.42、57.38 ± 7.11、59.75 ± 15.15）均较对照组（18.50 ± 4.18）显著增多（均P < 0.05）。结论 NB?UVB照射不仅可以促进黑素小体生成,还可以激活黑素细胞的自噬信号通路,促进自噬体及自噬溶酶体的形成,推测其为白癜风的治疗机制之一。     

MEK/ERK通路阻断剂对黑素瘤细胞增殖的影响

目的研究MEK/ERK通路阻断剂U0126对黑素瘤细胞A375增殖的影响,并探讨其作用机制。方法噻唑蓝法(MTT)测定U0126和传统抗癌药物达卡巴嗪(DTIC)分别及联合作用时对黑素瘤细胞A375的增殖抑制作用;流式细胞术检测不同药物处理组的细胞周期及凋亡情况;Western blot检测U0126处理后细胞p-ERK1/2的表达。结果药物作用24h时U0126单一用药组对细胞的增殖抑制率高于DTIC单一用药组(P<0.01);联合应用U0126和DTIC对细胞的增殖抑制率明显高于DTIC用药组(P<0.01);U0126组与对照组相比,G1期细胞比例数提高了21.83%(P<0.01),凋亡率提高了13.96%(P<0.01),联合用药组与对照组相比G1期比例增加了26.64%(P<0.01),凋亡率亦明显提高了25.20%(P<0.01);不同浓度U0126处理细胞后,细胞的p-ERK1/2均明显降低(P<0.01)。结论 MEK/ERK通路阻断剂U0126可显著抑制黑素瘤细胞的增殖,其机制可能与降低p-ERK1/2的表达从而参与细胞周期调控有关;联合U0126用药有望成为治疗黑素瘤新的有效途径。     

氧化苦参碱对皮肤鳞状细胞癌Colo-16细胞株凋亡及自噬影响的研究

目的:探讨氧化苦参碱对皮肤鳞状细胞癌(c SCC)Colo-16细胞株凋亡及自噬的影响。方法:用不同浓度的氧化苦参碱处理Colo-16细胞株24 h后,用流式细胞仪测定不同浓度氧化苦参碱组Colo-16细胞株凋亡率,用免疫印迹(western blot)法测定不同浓度组细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ的表达及LC3-Ⅰ→LC3-Ⅱ转化率。同时用western blot法检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)、m TOR调节相关蛋白(Raptor)及其m TORser2448、ser2481位点磷酸化产物和Raptor ser792位点磷酸化产物的表达。结果:1.000 g/L、2.000 g/L、4.000 g/L氧化苦参碱浓度组凋亡率明显高于阴性对照组,差异有统计学意义(F=355.12,P0.05),不同浓度组之间凋亡率差异也有统计学意义(P0.05)。western blot法发现,阴性对照组、溶剂对照组及氧化苦参碱分别为0.025 g/L、0.050 g/L、0.100 g/L、0.500 g/L、1.000 g/L、2.000 g/L各组之间LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ的表达及LC3-Ⅰ→LC3-Ⅱ转化率比较,差异无统计学意义(F值分别为0.86,0.63,0.33,P0.05),各组别之间m TOR、Raptor蛋白及其m TORser2448、ser2481位点磷酸化产物和Raptor ser792位点磷酸化产物的表达,差异均无统计学意义(F值分别为1.33、1.42、1.12、0.95及0.47,P0.05)。结论:氧化苦参碱可上调Colo-16细胞株的凋亡,且与其浓度正相关。氧化苦参碱对细胞自噬的水平无影响,对自噬相关调控蛋白的表达也无影响。因此,氧化苦参碱可能通过上调Colo-16细胞株的凋亡而非自噬来实现其抗肿瘤效应。     

白念珠菌菌丝调控小鼠巨噬细胞自噬关键分子微管相关蛋白1轻链3的实验研究

【摘要】 目的 探讨白念珠菌菌丝对小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM）自噬流的影响。方法 白念珠菌菌丝分别体外诱导BMDM细胞0.5、4、12 h,以不加菌丝处理的0 h组作为对照,Western印迹法检测各时间点自噬关键蛋白微管相关蛋白1轻链3（LC3）-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转换及磷酸化雷帕霉素机制性靶蛋白（p-mTOR）的表达。白念珠菌菌丝分别联合4种溶酶体阻断剂,包括半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64d + 胃蛋白酶抑制剂pepstatin、巴弗洛霉素-A1（BAF-A1）、氯化铵及氯喹,体外诱导小鼠BMDM细胞4、12 h,观察白念珠菌菌丝对BMDM细胞基础自噬流的影响。统计分析采用非配对t检验、析因设计的方差分析及LSD-t检验。结果 白念珠菌菌丝体外处理小鼠BMDM 0.5、4和12 h后,与0 h组（0.983 ± 0.030）相比,LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转换均增加（1.254 ± 0.118、1.629 ± 0.391、1.598 ± 0.379）,差异有统计学意义（t值分别为3.875、2.856、2.804,均P < 0.05）,但各组p-mTOR的蛋白表达无明显差异。白念珠菌菌丝联合E-64d + pepstatin体外处理BMDM细胞4和12 h后,LC3-Ⅱ的蓄积水平较E-64d + pepstatin单独处理组明显增高,差异均有统计学意义（t值分别3.691、6.648,均P < 0.05）。与相应溶酶体阻断剂组相比,白念珠菌菌丝联合BAF-A1、氯化铵或氯喹4和12 h后,LC3-Ⅱ的蓄积水平均显著升高（均P < 0.05）。结论 白念珠菌菌丝体外诱导可增加小鼠BMDM细胞基础自噬流中LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转换。     

黑色素瘤缺乏因子2在宫颈癌组织中的表达及其通过调节自噬对宫颈癌组织转移的影响

目的探讨黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)在宫颈癌组织中的表达及机制。方法选取2017年3月至2018年5月在山东省立第三医院行宫颈癌切除术的26例患者的宫颈癌组织及癌旁组织作为研究对象,采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)和免疫组化法检测宫颈癌及其癌旁组织中AIM2表达;采用RT-PCR和Western blot检测人宫颈癌细胞株Hela和正常宫颈细胞株Ect1/E6E7中AIM2 mRNA和蛋白表达;Hela细胞转染AIM2 si-RNA (si-AIM2组)和阴性对照(si-NC组),设空白对照组和3-MA干扰组(si-AIM2+3-MA组)。Western blot检测细胞中AIM2、 LC3、Beclin1和p62的蛋白表达,CCK-8法检测细胞增殖,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭。结果与癌旁组织比较,宫颈癌组织中AIM2的mRNA表达和IHC评分升高(P0.001);与Ect1/E6E7组比较,Hela组中AIM2的mRNA和蛋白表达升高(P0.001);与si-NC组比较,si-AIM2组细胞中LC3Ⅱ/LCⅠ和Beclin1蛋白表达升高(P0.001),细胞在24h、48h和72h增殖能力(P0.05)以及细胞迁移数和侵袭数(P0.001)降低,AIM2和p62蛋白表达降低(P0.001);与si-AIM2组比较,si-AIM2+3-MA组中LC3Ⅱ/LCⅠ和Beclin1蛋白表达降低(P0.001),细胞在24h、48h和72h增殖能力(P0.05)以及细胞迁移和侵袭数(P0.001)升高,p62蛋白表达升高(P0.001)。结论敲低AIM2通过诱导细胞自噬抑制宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭。     

Nrf2信号通路调控自噬对UVA诱导人真皮成纤维细胞凋亡的作用

目的 探讨Nrf2信号通路介导的细胞自噬在UVA诱导人皮肤成纤维细胞凋亡过程中的作用。方法 体外培养正常人皮肤成纤维细胞，分为对照组、UVA组、自噬诱导剂雷帕霉素(rapamycin, RAPA)组、自噬抑制3-甲基嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)组、核因子E2相关因子2(Nrf2)抑制剂(ML385)组及干涉(siRNA)组；各实验组经8 J/cm²的UVA照射；采用流式细胞术检测成纤维细胞凋亡；CCK-8检测细胞活性变化；Western blot检测细胞自噬及凋亡关键分子、p62及Nrf2蛋白表达水平。结果 经8 J/cm²的UVA照射后成纤维细胞凋亡比例增加、胞内自噬水平显著升高；自噬抑制剂3-MA处理后可显著促进UVA照射引起的成纤维细胞凋亡；而自噬促进剂RAPA处理细胞后，细胞凋亡率较UVA组相比显著降低(P<0.01);与对照组相比，UVA照射后胞核Nrf2表达显著增高；ML385阻断Nrf2入核及使用siRNA干涉Nrf2表达后，自噬关键蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ降低(P<0.01),p62表达显著减少(P&...     

H2O2对人皮肤成纤维细胞衰老标记蛋白30及自噬相关蛋白LC3Ⅱ表达的影响北大核心CSCD

目的 探讨H2O2对人皮肤成纤维细胞（NHSF）衰老标记蛋白30（SMP30）以及细胞自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3Ⅱ型（LC3Ⅱ）的影响。方法 用150 μmol/L H2O2处理2 ~ 4代NHSF 2 h,构建细胞衰老模型作为H2O2组,而未处理的NHSF作为对照组。细胞衰老β半乳糖苷酶（SA？β？gal）染色法检测衰老细胞比例,间接免疫荧光检测自噬相关蛋白LC3的表达,反转录PCR（RT？PCR）检测SMP30 mRNA的表达,Western印迹法检测SMP30和LC3蛋白的表达。结果 H2O2组NHSF的SA？β？gal染色阳性率（41.70% ± 2.95%）显著高于对照组（3.03% ± 0.25%,t = 22.59,P 〈 0.05）。间接免疫荧光结果显示,H2O2组NHSF LC3阳性率（12.60% ± 1.57%）明显低于对照组（23.67% ± 3.04%,t = 5.61,P 〈 0.05）。Western印迹显示,H2O2组LC3Ⅰ/GAPDH比值（0.40 ± 0.02）与对照组（0.41 ± 0.04）比较差异无统计学意义（P 〉 0.05）,而H2O2组LC3Ⅱ/GAPDH比值（0.20 ± 0.02）明显低于对照组（0.80 ± 0.03,t = 29.69,P 〈 0.05）,且H2O2组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值（0.51 ± 0.03）亦明显低于对照组（1.98 ± 0.23,t = 10.967,P 〈 0.05）。H2O2组SMP30 mRNA和蛋白水平（与GAPDH mRNA和蛋白的比值分别为0.16 ± 0.01和0.27 ± 0.02）明显低于对照组（分别为0.35 ± 0.01和0.63 ± 0.02）,均P 〈 0.05。结论 H2O2可降低NHSF中SMP30及LC3Ⅱ的表达水平,加速NHSF衰老。     

核因子Ⅰ-C对血小板源性生长因子调节皮肤成纤维细胞转化生长因子β信号通路的抑制作用

目的:探讨核因子(NF)Ⅰ对血小板源性生长因子(PDGF)增强皮肤成纤维细胞转化生长因子β(TGF-β)信号通路的影响作用。方法:构建NFⅠ-C基因慢病毒载体并且确定慢病毒转染成纤维细胞最佳条件,采用Western印迹法测定PDGF对经NFⅠ-C基因病毒转染后成纤维细胞的TGF-β1及其受体Ⅱ(TβRⅡ)蛋白表达的影响作用。结果:(1)NFⅠ-C慢病毒载体转染皮肤成纤维细胞的最佳转染值为50;(2)皮肤成纤维细胞经NFⅠ-C慢病毒转染后NFⅠ-C蛋白的表达较非病毒转染细胞显著升高(P0.05);(3)正常皮肤成纤维细胞与PDGF共同培养48 h后TGF-β1和TβRⅡ蛋白表达较空白对照显著升高(P0.05);(4)皮肤成纤维细胞经NFⅠ-C慢病毒转染后与PDGF共同培养后48 h后TGF-β1和TβRⅡ蛋白表达均较正常对照皮肤成纤维细胞和空病毒转染皮肤成纤维细胞显著降低(P0.05)。结论:血小板源性生长因子可增强皮肤成纤维细胞TGF-β1和TGF-β受体Ⅱ的表达,而NFⅠ-C表达增加可抑制PDGF增强TβRⅡ表达的作用。     

雷帕霉素对人角质形成细胞系HaCaT细胞自噬诱导效应及其分子机制的初步研究

目的:初步探讨雷帕霉素在不同浓度和不同孵育时间下,对人角质形成细胞系HaCaT细胞自噬的诱导效应及其分子机制。方法:不同浓度雷帕霉素处理HaCaT细胞4 h或12 h后,利用四甲基偶氮唑盐(MTT)方法检测雷帕霉素对细胞活力的影响,并提取蛋白进行蛋白印迹实验,检测LC3-Ⅱ表达水平,作为自噬的检测方法;通过透射电镜分析自噬体形成,确认雷帕霉素对自噬的诱导效果。检测自噬调控上游关键元件哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)蛋白表达及其se~(2481)和ser~(2448)磷酸化产物水平,分析mTOR活性;并分析自噬调控下游的另一关键基因Atg7的表达,初步分析雷帕霉素诱导HaCaT细胞的分子机制。结果:不同浓度雷帕霉素处理4 h,对HaCaT细胞的活力没有显著的影响。高剂量雷帕霉素(80 nmol/L和100 nmol/L)在处理12 h后对HaCaT细胞的活力产生毒性效应。20 nmol/L和50 nmol/L雷帕霉素孵育4 h诱导HaCaT细胞LC3-Ⅱ表达上调,而20 nmol/L和50 nmol/L雷帕霉素孵育12 h仍具有诱导效应。相较于其他浓度,在50 nmol/L雷帕霉素孵育诱导的LC3-Ⅱ表达上调效应最为显著,并且在药物孵育4h时超微结构水平诱导产生胞质内大量自噬体形成。1~50nmol/L浓度的雷帕霉素孵育4 h或12 h均可诱导HaCaT细胞mTOR ser~(2481)和mTOR ser~(2448)磷酸化产物水平降低:然而Atg7表达不能观测到显著的差异。结论:50 nmol/L雷帕霉素孵育4 h具有显著的诱导HaCaT细胞自噬效应。HaCaT细胞mTOR分子对雷帕霉素处理敏感,可被其诱导产生蛋白活化抑制效应。这种mTOR信号抑制可能参与了雷帕霉素对HaCaT细胞的自噬诱导效应,但Atg7没有参与这种调控效应。     

丹参酮ⅡA体外促进黑素瘤A375细胞自噬及信号通路的实验研究

目的：探讨丹参酮ⅡA体外对黑素瘤细胞A375细胞自噬的影响及其信号通路研究。方法0.5、1、2、4 mg/L丹参酮ⅡA作用黑素瘤A375细胞24、48、72 h后,噻唑蓝（MTT）比色法检测A375细胞的增殖活性。1、2、4 mg/L丹参酮ⅡA作用黑素瘤A375细胞48 h,采用流式细胞仪检测细胞自噬小体的数量,Western印迹检测自噬相关蛋白Beclin?1和微管相关蛋白1轻链3（LC3）?Ⅱ蛋白及磷酸肌醇3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、p70S6激酶1（p70S6K1）蛋白的表达水平。结果 MTT分析显示,0.5、1、2和4 mg/L丹参酮ⅡA分别作用黑素瘤A375细胞24、48、72 h,均能抑制A375细胞的增殖能力,且抑制作用呈剂量和时间依赖性（F=2564.12、1235.25,均P<0.05）。流式细胞仪显示,1、2和4 mg/L丹参酮ⅡA作用A375细胞48 h后,细胞内自噬小体比例分别为6.91%±0.35%、13.11%±0.73%、25.51%±0.83%,均明显高于对照组（0.41%±0.02%）,各组间差异有统计学意义（均P<0.05）。Western印迹显示,1、2和4 mg/L丹参酮ⅡA作用A375细胞48 h后,细胞自噬相关蛋白Beclin?1和LC3?Ⅱ表达水平随丹参酮ⅡA浓度增加而升高,各丹参酮ⅡA组间差异有统计学意义,且高于对照组（均P<0.05）。而PI3K?Akt?mTOR?p70S6K1信号通路中PI3K、p?Akt、p?mTOR和p?p70S6K1蛋白表达随丹参酮ⅡA浓度增加而下降,各丹参酮ⅡA组间差异有统计学意义,且低于对照组（均P<0.05）。结论丹参酮ⅡA可通过抑制P13K?Akt?mTOR?p70S6K1信号通路,促进黑素瘤细胞发生自噬。     

西罗莫司和饥饿处理对人A431细胞自噬水平的影响

目的 探讨经典自噬诱导剂西罗莫司和饥饿处理对人皮肤鳞状细胞癌细胞系A431自噬水平的影响。方法 分别将A431细胞和人宫颈癌细胞系HeLa分为对照组（单纯DMEM培养基处理）、二甲基亚砜（DMSO）组、20 nmol/L西罗莫司组、80 nmol/L西罗莫司组、平衡盐溶液（EBSS）组。作用4 h后,Western印迹检测A431细胞和HeLa细胞自噬微管相关蛋白轻链3A/3B（LC3A/B）、重组人γ?氨基丁酸受体相关蛋白（GABARAP）的表达水平。吖啶橙染色分析细胞自噬体表达水平。结果 Western印迹检测显示,对照组与DMSO组A431细胞中LC3A/B?Ⅱ与LC3 A/B?Ⅰ比值差异无统计学意义（P > 0.05）;20 nmol/L西罗莫司组、80 nmol/L西罗莫司组、EBSS组LC3 A/B?Ⅱ与LC3 A/B?Ⅰ比值较对照组均明显升高,差异均有统计学意义（P < 0.05）。HeLa细胞Western印迹检测结果与A431细胞类似。双变量相关性分析显示,HeLa细胞中LC3A/B?Ⅰ与GABARAP表达呈正相关（r = 0.869,95% CI：0.807 ~ 0.999,P = 0.051）,LC3A/B?Ⅱ与GABARAP表达呈负相关（r = -0.742,95% CI：-0.982 ~ 0.406,P = 0.042）;A431细胞中LC3A/B?Ⅰ与GABARAP表达亦呈正相关（r = 0.837,95% CI：-0.173 ~ 0.989,P = 0.037）,LC3A/B?Ⅱ与GABARAP表达呈负相关（r = -0.684,95% CI：-0.977 ~ 0.500,P = 0.047）。吖啶橙染色显示,A431细胞自噬阳性细胞比例在西罗莫司组（23.750% ± 0.260%）与EBSS组（32.450% ± 0.488%）同样高于对照组（15.987% ± 0.242%,均P < 0.05）;HeLa细胞自噬阳性细胞比例在西罗莫司组（33.307% ± 0.715%）和EBSS组（66.097% ± 1.141%）高于对照组（14.117% ± 0.295%,均P < 0.05）。结论 经典自噬诱导剂西罗莫司和饥饿能够上调A431细胞的自噬水平, GABARAP蛋白可能与LC3A/B高度相关。     

喜树碱对HaCaT细胞自噬的影响

目的 探讨喜树碱对HaCaT细胞自噬的影响.方法 将HaCaT细胞分为对照组和实验组,对照组用0.1％二甲基亚砜处理,实验组分别用5、10、25、50、100、200 nmol/L浓度的喜树碱处理.不同浓度喜树碱作用于HaCaT细胞24、48 h,用CCK8法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测药物作用24 h后细胞凋亡情况,免疫印迹法检测自噬相关微管相关蛋白1轻链3(LC3)、p62的变化;选取10 nmol/L喜树碱作用于HaCaT细胞24 h,间接免疫荧光法检测细胞自噬蛋白LC3的变化.结果 5、10 nmol/L喜树碱对HaCaT细胞增殖、凋亡无显著影响,50、100、200 nmol/L喜树碱作用HaCaT细胞24 h,增殖抑制率分别为(31.23±1.00)％,(54.21±8.10)％,(66.75±10.70)％;25、50、100、200 nmol/L喜树碱作用HaCaT细胞48 h,增殖抑制率分别为(25.81±5.99)％、(44.35±5.32)％、(65.81±8.28)％、(73.23±9.59)％,与同时段对照组相比,差异有统计学意义(均P＜0.001).50、100、200 nmol/L喜树碱作用HaCaT细胞24 h,凋亡率分别为(14.46±2.38)％、(19.15±1.59)％、(29.88±1.37)％,与对照组(3.80±0.13)％比较,差异有统计学意义(均P＜ 0.001).5、10 nmol/L喜树碱处理HaCaT细胞24 h后,LC3Ⅱ表达上调,p62蛋白表达下调.间接免疫荧光显示10 nmol/L喜树碱作用HaCaT细胞24h后,实验组与对照组自噬体阳性细胞百分率分别为(36.67±4.55)％、(6.23±0.92)％,两组差异有统计学意义(t=6.546,P=0.003).结论 5、10 nmol/L喜树碱可诱导HaCaT细胞发生自噬,但对细胞增殖、凋亡无影响.50、100、200 nmol/L喜树碱抑制HaCaT细胞增殖,促使细胞发生凋亡,自噬水平降低.     

丹参酮ⅡA对雷帕霉素诱导自噬M2巨噬细胞共培养的皮肤黑素瘤A375细胞EMT的影响

目的 通过建立肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)自噬水平改变对与之共培养的A375细胞的体系,进一步明确TAMs自噬在调控A375细胞上皮间质转化(EMT)及迁移侵袭过程中的作用。方法 用PMA和IL-4相继作用于人单核细胞THP-1 72 h诱导其成M2型,流式细胞术及免疫荧光检测鉴定M2表面CD68、CD204、CD206等标志性分子表达情况,鉴定TAMs极化效率。用自噬调节剂雷帕霉素干预TAMs(M2) 24 h,去除自噬调节药物的干预48 h后,通过蛋白免疫印迹方法以及免疫荧光检测各组细胞LC3-Ⅱ和Beclin-1表达,确定药物干预后的TAMs自噬水平。将雷帕霉素干预后的TAMs与人黑素瘤A375细胞进行非接触共培养,48 h后加入不同浓度TanⅡA 1 mg/L(低浓度)组、4 mg/L(高浓度)组,继续培养48 h后,Western blot检测A375细胞EMT相关因子的表达,并通过transwell检测A375细胞的侵袭和迁移能力。结果 人单核细胞THP-1经PMA和IL-4先后作用共72 h后,细胞状态由半悬浮变为贴壁,经流式细胞术、免疫荧光检测发现M2表面CD68、CD...     

自噬在富氢液减轻UVB致皮肤成纤维细胞损伤中的作用

目的探讨自噬对富氢液减轻UVB照射导致的人皮肤成纤维细胞氧化损伤的调控作用。方法取健康男童包皮环切术后包皮,进行人真皮成纤维细胞的原代培养,将细胞分组:正常对照组(Con组);氢气对照组(Con+H_2);UVB照射组(UV组);UVB照射+富氢培养液组(UV+H_2组);UVB照射+富氢培养液+自噬抑制剂3-MA组(UV+H_2+3-MA组),各组培养6h、12h和24h,电镜观察自噬体和LC3的表达变化,根据上述结果,各组在UVB照射后培养6h后,进行相MTT、LDH、ROS、MDA和自噬蛋白Beclin-1、ATG5和P62的检测。结果与Con组和Con+H_2组比较,UV组MTT值和P62表达减少(P0.05),自噬体、LDH、ROS、MDA、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1和ATG5表达增加(P0.05);与UV组比较,UV+H_2组自噬体、MTT、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1和ATG5表达增加(P0.05),LDH、ROS、MDA和P62表达减少(P0.05);与UV+H_2组比较,UV+H_2+3-MA组自噬体、MTT、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1和ATG5表达减少(P0.05),LDH、ROS、MDA和P62表达增加(P0.05)。结论富氢液通过激活自噬途径减轻UVB照射导致的人皮肤成纤维细胞损伤。     

紫檀芪对人乳头瘤病毒16整合感染宫颈上皮细胞系生长、凋亡和自噬的影响

【摘要】 目的 探讨紫檀芪对人乳头瘤病毒16（HPV16）整合感染宫颈上皮细胞（H8细胞）生长、凋亡和自噬的影响。方法 紫檀芪与H8细胞共培养24 h和48 h,使用CCK8法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测H8细胞凋亡和细胞周期,荧光显微镜观察MDC染色后细胞自噬形态学改变,Western印迹检测各组细胞周期相关蛋白（cyclinD1）、凋亡相关蛋白（caspase3、caspase9）、自噬相关蛋白（Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、ATG5、P62）、HPV致癌基因蛋白（E6、E7蛋白）的表达。采用单因素方差分析、重复测量方差分析和LSD-t检验分析组间差异。结果 对照组（0）、25、50、75、100 μmol/L紫檀芪作用H8细胞48 h后,各组细胞相对生长率（100.00% ± 1.56%、99.02% ± 4.97%、93.59% ± 2.01%、81.28% ± 4.90%、69.17% ± 7.56%）差异有统计学有意义（F = 77.22,P < 0.05）,随着浓度增加生长率渐降低,各紫檀芪组与对照组比较,均P < 0.05。紫檀芪作用H8细胞24 h后,各组细胞G1 期、G2期、S期细胞比例差异均有统计学意义（F = 7 845.00、51.14、266.50,均P < 0.05）,各紫檀芪组G1期、G2期细胞比例均高于对照组,S期细胞比例均低于对照组（均P < 0.05）。紫檀芪作用48 h后,0 ~ 100 μmol/L组细胞凋亡率分别为11.58% ± 0.50%、14.66% ± 0.22%、13.50% ± 0.49%、14.56% ± 0.19%、15.30% ± 0.76%,各紫檀芪组均高于对照组（均P < 0.05）。紫檀芪作用24 h后细胞MDC染色显示,对照组中仅有少量H8细胞检测到高亮点状荧光,各紫檀芪组高亮点状荧光的自噬小体较对照组增多。Western印迹显示,紫檀芪作用24 h、48 h后各组细胞cyclinD1、caspase3、caspase9、Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、ATG5、P62、E6、E7蛋白相对表达水平差异均有统计学意义（均P < 0.05）。与对照组比较,紫檀芪处理后cyclinD1表达降低,caspase3、caspase9表达升高,Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、ATG5、P62升高,E6、E7表达降低（个别浓度组与对照组比较P > 0.05,多数组间比较P < 0.05）。结论 紫檀芪可抑制H8细胞增殖,促进其凋亡和自噬,抑制E6、E7致癌基因的表达。     

定量检测绿色荧光蛋白-轻链蛋白3转基因小鼠角质形成细胞自噬水平

目的 探索一种高通量定量检测细胞自噬小体数量的方法。方法 将绿色荧光蛋白?轻链蛋白3（GFP?LC3）转基因小鼠的角质形成细胞分为对照组（不接受照射或饥饿处理）、饥饿组（给予饥饿处理）、20 J/cm2长波紫外线（UVA）照射组和40 J/cm2 UVA照射组。处理后6 h,将细胞固定后在共聚焦显微镜下采集图片。用ImageJ软件编辑宏指令对细胞内GFP?LC3绿色荧光点及细胞进行自动计数,并比较不同组间自噬水平。结果 利用ImageJ软件编辑的宏指令可以成功识别并计数荧光图片中的自噬小体。在测试计算机上分析一张420万像素的图片仅需不到0.6 s。饥饿组、20 J/cm2 UVA照射组和40 J/cm2 UVA照射组平均自噬小体数量高于对照组,未加胃抑素A时各组间比较,F = 5.01,P < 0.05;加入胃抑素A时各组间比较,F = 20.05,P < 0.05。该方法可以成功区分饥饿组、UVA照射组和对照组的自噬水平差异。结论 成功为自噬研究提供了一种新的高通量定量检测方法,该方法能够快速准确地检测细胞自噬荧光点。     

α硫辛酸对人皮肤成纤维细胞自噬的影响

目的：评价α硫辛酸对人皮肤成纤维细胞自噬水平的影响。方法人皮肤成纤维细胞与终浓度分别为0、0.05、0.10、0.15、0.20和0.50 mmol/L 的α硫辛酸孵育4、12和24 h 后,采用噻唑蓝法检测细胞增殖活性,单丹酰戊二胺（MDC）染色法检测细胞自噬水平,Western 印迹法检测微管相关蛋白1轻链3-B（LC3-B）表达。结果孵育4 h 和12 h 时,0、0.05、0.10、0.15、0.20和0.50 mmol/L α硫辛酸组间人皮肤成纤维细胞增殖活性（A490值）差异均无统计学意义（F 值分别为2.85、1.34,均 P >0.05）;孵育24 h 时,各组间差异有统计学意义（F =10.41,P <0.01）。MDC 法检测显示,孵育4 h 和12 h 时,0、0.05、0.10、0.15、0.20和0.50 mmol/L α硫辛酸组间自噬体阳性细胞百分率差异均无统计学意义（F 值分别为0.11、0.10,均 P >0.05）;孵育24 h 时,各组间差异有统计学意义（F =8.03,P <0.05）。Western 印迹法检测显示,孵育4 h 和12 h 时,0、0.05、0.10、0.15、0.20和0.50 mmol/L α硫辛酸组间细胞 LC3-Ⅰ向 LC3-Ⅱ转化（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）水平差异均无统计学意义（F 值分别为3.38、2.13,均 P >0.05）,但孵育24 h 时各组间差异有统计学意义（F =37.49,P <0.01）。结论α硫辛酸可能抑制人皮肤成纤维细胞基础自噬。     

血清饥饿处理对人角质形成细胞系HaCaT细胞自噬的调控效应研究北大核心CSCD

目的研究血清饥饿处理对人角质形成细胞系HaCaT细胞自噬的调控效应,初步分析其分子机制。方法采用血清饥饿处理体外培养的HaCaT细胞诱导自噬,分析血清饥饿对细胞形态和细胞活力（MTr法）的影响。透射电镜观察自噬体囊泡形成,使用Western印迹法进行自噬标志性分子LC3-I-Lc3Ⅱ转化分析和自噬关键基因Atg7的表达以及MDC染色标记自噬体囊泡。对mTOR的蛋白表达及其ser2448和ser2481位点磷酸化产物水平进行分析。结果血清饥饿HaCaT细胞活力上升,电镜观察和MDC染色发现,血清饥饿处理的HaCaT细胞中有自噬体囊泡形成。Western印迹显示,血清饥饿细胞LC3-I—LC3Ⅱ转化（LC3-Ⅱ,LC3-I比率为3．5084-0．415）较正常培养的细胞（0．538±0．038）显著上调（两组比较,t=13．32,P〈0．01）;自噬关键基因Atg7表达上调（对照细胞和血清饥饿细胞Atg7／GAPDH分别为0．021±0．006和0．048-4-0．011,t=7．27,P〈0．05）。血清饥饿处理的细胞中,roTOR的ser2448位点、ser2481位点磷酸化产物水平显著降低（对照细胞和血清饥饿细胞间的磷酸化mTORser2448／mTOR比率分别为0．762±0．108和0．394±0．048,t=7．58,P〈0．05;磷酸化mTORser248I／mTOR的比率分别为0．263±0．039和0．111±0．020,t=13．77,P〈0．01）。结论血清饥饿处理可以诱导HaCaT细胞发生自噬,并且导致细胞活力上升。这种自噬的诱导可能与自噬调控关键元件mTOR蛋白活化抑制相关。