门静脉高压症患者肝外血管平滑肌细胞增生与c-myc基因表达的相关性研究

目的　研究门静脉高压症患者肝外血管平滑肌细胞增生与c mycmRNA表达的关系。方法　应用RT PCR和免疫组化法对 2 8例门静脉高压症患者的脾静脉、12例正常血管分别进行c mycmRNA和增殖细胞核抗原 (PCNA)的检测。结果　门静脉高压症患者脾静脉PCNA蛋白表达阳性指数为 (2 9 8± 4 2 ) % ;c mycmRNA在PCNA蛋白表达阳性组和阴性组分别为 (7.6 1± 1 0 4 ) %和(3 82± 0 92 ) % ,正常对照组血管中PCNA蛋白无表达、c mycmRNA表达为 (1 0 4± 0 2 1) % ,两者同时与对照组比较 ,差异有显著意义 (P <0 0 1)。结论　c myc基因是门静脉高压症患者肝外血管平滑肌细胞增殖的起动基因 ,门静脉血流动力学紊乱激活脾静脉壁平滑肌细胞中原癌基因 ,促使血管平滑肌细胞增殖、迁移和表型改变 ,导致脾静脉血管重塑 ,使血管对缩血管物质反应降低。     

门静脉高压症患者脾静脉平滑肌细胞gax mRNA的表达

目的观察门静脉高压症患者脾静脉平滑肌细胞gax mRNA的表达。方法应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组织化学法分别检测28例门脉高压症患者脾静脉和12例正常对照血管gax mRNA和PCNA蛋白的表达。结果gax mRNA在实验组和对照组中相对表达量分别为1.13±0.21和10.17±0.81(P<0.01);PCNA蛋白在实验组中的表达为(29.8±4.7)%,而正常对照组无明显表达(P<0.01)。结论门静脉高压症患者脾静脉平滑肌细胞中gax mRNA表达下降PCNA蛋白过表达,调节了脾静脉平滑肌细胞增殖、迁移和表型改变,使血管结构重建,对门静脉高压症的形成和维持可能起重要作用。     

平滑肌细胞迁移在动静脉内瘘内膜增生中的作用机制研究

目的:探讨平滑肌细胞迁移在自体动静脉内瘘(arteriovenous fistula,AVF)内膜增生中的作用及可能的调控机制。方法:标本选自因AVF狭窄或闭塞不能维持正常血液透析治疗,需再次手术的尿毒症患者,通过对AVF失功的静脉侧标本的研究,伊红染色观察血管组织形态学变化,测量各组内膜、中膜厚度;免疫组化观察血管病变中碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、胰岛素生长因子1(insulin-like growth factor,IGF-1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达;Western blot检测金属基质蛋白酶2(matrix metallopro-teinase 2,MMP2)、金属基质蛋白酶9(matrix me-talloproteinase 9,MMP9)蛋白水平。结果:AVF流出道侧静脉内膜增生明显导致血管壁增厚,且内膜中可见大量平滑肌细胞及少量炎症细胞,静脉壁中bFGF、IGF-1表达水平明显升高,增生静脉的新生内膜层MMP2、MMP9表达增加,与对照组相比,失功的AVF标本MMP2表达水平显著增加,且差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:内膜增生是AVF失功的主要原因,平滑肌细胞可通过中膜向内膜迁移并上调bFGF、IGF-1、MMP2细胞因子的表达以维持内膜的持续增生。     

丹参酮ⅡA对大鼠血管平滑肌细胞增殖的抑制作用及机制探讨

目的:观察丹参酮ⅡA(TanⅡA)对体外培养的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖与迁移的影响。方法:采用CCK8法筛选VSMC增殖的最适胎牛血清(FBS)浓度,然后将VSMC分为3组:(1)对照组:VSMC加入5%FBS培养液;(2)增殖组:VSMC加入30%FBS培养液;(3)TanⅡA干预组:110 mg/L TanⅡA+30%FBS;220 mg/L TanⅡA+30%FBS;340 mg/L TanⅡA+30%FBS,分别培养24、48、72 h后检测细胞增殖情况;伤口愈合实验观察VSMC迁移指数;免疫细胞化学法检测细胞血小板生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)的表达变化;应用Western blot法观察细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及金属基质蛋白酶2(MMP2)、金属基质蛋白酶9(MMP9)的表达情况。结果:与增殖组相比,TanⅡA干预后细胞增殖明显缓慢,其抑制作用呈时间、剂量依赖性,20 mg/L TanⅡA干预48 h对VSMC增殖的抑制作用比较显著,且无明显细胞损伤。伤口愈合实验显示TanⅡA干预后VSMC的迁移指数明显低于增殖组(P0.05);免疫细胞化学结果显示,与增殖组相比,TanⅡA干预后PDGF表达减少,差异具有统计学意义(P0.05),各组间b FGF表达差异无统计学意义;Western blot结果显示,与增殖组比较,TanⅡA干预组随药物浓度的提高,Bcl-2、MMP2、MMP9表达水平降低,Bax提高,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:20 mg/L TanⅡA对高浓度FBS诱导的VSMC增殖与迁移的抑制作用较为明显,且无明显细胞损伤,其抑制作用可能与调节Bcl-2、Bax表达,阻断PDGF、MMP2、MMP9生长因子活化有关。     

染料木黄酮对大鼠移植动脉血管平滑肌细胞的影响

目的研究染料木黄酮(Gen)对大鼠移植动脉血管平滑肌细胞的影响。方法以BN大鼠为供者,Lewis大鼠为受者,建立腹主动脉移植模型,将受者随机分为3组。实验组(n=8):受者术后腹腔注射Gen 20 mg·kg~(-1)·d~(-1)×60 d;对照1组(n=8):受者术后腹腔注射溶剂二甲基亚砜0.5 ml×60 d;对照2组(n=6):受者术后不给予任何处理。腹主动脉移植后60 d取移植血管进行组织学观察,测量血管内膜厚度;免疫组织化学染色检测血管平滑肌细胞的增殖和迁移情况;酶联免疫(ELISA)法检测血清中血管内皮生长因子(VEGF)、γ-干扰素(INF-γ)的变化。结果实验组与两个对照组比较,内膜增厚不明显且巨噬细胞浸润减少;血管平滑肌细胞增殖和迁移减少(P均<0.01);两个对照组血清中VEGF、INF-γ表达显著高于实验组(P<0.01)。结论染料木黄酮在预防和治疗移植动脉硬化的过程中,对移植动脉血管平滑肌细胞的增殖和迁移有抑制作用,其机理可能与影响VEGF等的表达有关。     

复方角菜酸酯对直肠黏膜急性损伤的治疗作用及其机制研究

目的研究复方角菜酸酯对大鼠直肠黏膜急性损伤的治疗作用及其机制。方法以3%乙酸制作240只SD大鼠直肠损伤模型,分为对照组和实验组。实验组每只经肛门置入复方角菜酸酯栓20mg,2/d,对照组不用药;之后,每组分别在30min和24、72、120h各处死30只大鼠。观察直肠黏膜损伤和病理变化情况,并通过免疫组织化学方法观察该药对CD34、血管内皮生长因子(VEGF)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、白介素8(IL-8)、金属基质蛋白酶9(MMP9)、缺氧诱导因子(HIF-1α)和增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响。结果用药后24、72、120h,实验组大鼠直肠黏膜损伤计分和充血、水肿、腺体破坏、炎症细胞浸润病理现象明显较对照组轻,修复速度较对照组快,且没有明显的瘢痕形成。损伤后24h,实验组MMP9、VEGF的表达显著降低,损伤后72、120h,6种蛋白的表达均显著低于对照组。实验组的新生血管形成明显低于对照组。结论复方角菜酸酯栓可明显减轻3%乙酸造成的直肠黏膜损伤,促进损伤愈合,且能减轻瘢痕形成;其降低MMP9、VEGF、IL-8、PCNA、iNOS、HIF-1α基因的表达,是直肠黏膜保护机制之一。     

平滑肌22α启动子/增强子靶向调控哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路对移植血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 采用血管平滑肌细胞(SM)特异性SM22α启动子/平滑肌肌球重链蛋白(SMHC)增强子,构建靶向大鼠哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)基因的干扰RNA真核表达载体,研究其对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖及移植血管新生内膜增生的影响.方法 构建大鼠特异性SM22α真核表达载体SM22α-p/e-mTOR-短发卡RNA(shRNA),建立大鼠颈静脉-动脉移植模型,在血管吻合完成后通过Pluronic F-127质粒缓释系统对血管内平滑肌增殖进行局部RNA干扰.实验分5组,每组20只SD大鼠.A组:对照组(25％ Pluronic F-127组);B组:SM22α组(SM22α-p/e-mTOR-shRNA);C组:巨细胞病毒(CMV)组(CMV-p/e-mTOR-shRNA);D组:阴性对照组(空质粒pGenesil-10);E组:阳性对照组;其中,B组和C组统称实验组.根据实验分组的不同,将含有50 μg shRNA质粒,或50 μg渥曼青霉素(wortmannin)凝胶,或单纯200μl 25％ Pluronic F-127凝胶均匀涂抹在移植静脉周围,分别于术后1、3、7、14 d获取移植血管.苏木素-伊红(HE)染色观察新生内膜厚度;免疫组织化学检测平滑肌肌动蛋白(α-SM-actin)、增殖细胞核抗原(PCNA)、磷酸化-mTOR (Ser2448),原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测细胞凋亡,评估mTOR信号通路的变化以及平滑肌细胞的增殖.结果 术后7d各组新生内膜厚度差异有统计学意义(P＜0.05);术后14 d,A组新生内膜较术后1d增厚12.4倍;B、C、D、E组分别增厚9.7、4.8、7.6、2.6倍.术后14d,各实验组和阳性对照组移植静脉α-SM-actin表达阳性面积均明显低于对照组(P＜0.05),PCNA阳性表达面积均低于对照组(P＜0.05),磷酸化-mTOR(Ser2448)阳性表达面积均低于对照组(P＜0.05);实验组、对照组、阴性对照组术后移植静脉凋亡细胞阳性面积比较差异无统计学意义(P＞0.05),阳性对照组凋亡面积明显高于其他组(P＜0.05).结论 SM22α-p/e-mTOR-shRNA可通过抑制血管平滑肌细胞mTOR信号通路而抑制血管平滑肌细胞增殖,预防或延缓移植静脉狭窄.     

盐酸芬戈莫德对大鼠颈动脉球囊损伤后1型和3型1-磷酸鞘氨醇受体表达的影响

目的探讨新型免疫抑制剂盐酸芬戈莫德对大鼠颈动脉球囊损伤后1型和3型1-磷酸鞘氨醇受体(S1P1,S1P3)表达的影响。方法 60只SD大鼠随机分为假手术组(n=15)、阴性对照组(n=15)、模型组(n=15)和药物处理组(n=15),采用球囊损伤的方法制备大鼠颈动脉球囊损伤模型,于术后3天、7天和21天取材,行HE染色观察其组织学变化,采用Real-time PCR(RT-PCR)检测大鼠血管中丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2(AKT2)的表达,Western Blot检测大鼠血管中S1P1和S1P3的表达水平。结果 HE染色显示模型组与其他组相比血管增殖明显;RT-PCR显示AKT2在药物处理组的表达低于模型组,但只在7天时差异有统计学意义(P0.05),在同一时间点模型组和药物处理组的表达量均高于假手术组和阴性对照组(P均0.05),假手术组和阴性对照组在各时间点的表达量差异均无统计学意义(P均0.05);Western Blot在球囊损伤初期S1P1和S1P3表达增加,随着时间推移特别是药物干预作用后,到21天时的表达与正常组织相比无明显差异。结论S1P1和S1P3参与了球囊损伤后平滑肌细胞的迁移与增殖,新型免疫抑制剂盐酸芬戈莫德可以抑制AKT2及S1P1和S1P3的表达,减轻球囊损伤后的再狭窄。     

靶向RNA干扰骨桥蛋白基因的慢病毒载体对血管平滑肌细胞增殖凋亡的影响

目的 构建大鼠骨桥蛋白(OPN)基因的shRNA慢病毒表达载体,并观察其对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和凋亡的影响.方法 针对OPN基因的不同部位设计3对shRNA的寡核苷酸片段,克隆到慢病毒载体PLKO.1中,构建靶向OPN基因的慢病毒载体PLKO.1-OPN-shRNA,检测并筛选最佳抑制效率的shRNA干扰载体.并将其转染大鼠血管平滑肌细胞,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测VSMCs OPN mRNA表达水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测VSMC OPN蛋白表达水平;噻唑蓝(MTT)比色法和流式细胞仪检测沉默OPN基因后对VSMC增殖和凋亡能力的影响.结果 靶向OPN慢病毒表达载体构建成功.重组慢病毒载体PLKO.1-OPN-shRNA转染后可显著抑制VSMCs的OPN mRNA及蛋白的表达水平,OPN蛋白表达明显下降,其中以PLKO.1-OPN2-shRNA最为明显,达到90％以上;转染PLKO.1-OPN2-shRNA后72 h的细胞增殖能力[吸光度(A)值=0.365 ±0.011]明显低于未处理组(A值=0.941±0.028)和阴性对照组细胞(A值=0.941±0.040,P＜0.05);而早期细胞凋亡率(20.44±2.69)％和晚期细胞凋亡率(16.79±1.01)％均明显高于未转染组和阴性对照组(P＜0.01).结论 成功构建并筛选最佳抑制效率的靶向OPN慢病毒表达载体PLKO.1-OPN2-shRNA,该载体能有效抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖,并促进细胞凋亡.     

移植损伤对移植静脉影响的实验研究

目的探讨移植静脉再狭窄的机制,明确移植损伤对移植静脉的影响。方法健康新西兰大白兔36只,随机选取一侧将股静脉翻转后移植于同侧股动脉缺损(静-动组),另一侧将同等长度股静脉截取后行原位缝合(静-静组),另取正常股静脉作为对照组(取自静-动组移植前静脉的一部分)。均于术后4周取移植静脉段,行HE染色、弹力纤维的维多利亚蓝染色观察移植静脉管壁组织学变化;增殖细胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)免疫组织化学染色观察管壁细胞增殖情况;电镜观察管壁细胞超微结构改变。结果静-静组血管壁中膜平滑肌细胞增殖,但内膜(3.50±0.41μm)、中膜(12.23±1.59μm)厚度无明显变化;静-动组内膜、中膜细胞均增殖,内膜(25.60±3.21μm)、中膜(21.30±2.47μm)厚度较对照组、静-静组均增加,差异有统计学意义(P<0.01)。对照组未见PCNA阳性细胞,静-静组内膜(5.9%±1.3%)、中膜(23.4%±3.4%)PCNA阳性细胞百分比均小于静-动组内膜(16.4%±1.9%)、中膜(36.5%±3.7%),差异有统计学意义(P<0.01)。静-静组透射电镜下可见内皮细胞扁平,游离端有绒毛样突起,细胞排列紧密,中膜平滑肌细胞增殖;静-动组透射电镜下可见内皮细胞增殖明显,增殖的内皮细胞形态不规则,细胞间隙增宽,内膜中可见大量平滑肌细胞,基底膜不完整,中膜平滑肌细胞明显增殖;对照组内皮细胞形态及排列与静-静组相似,只是中膜平滑肌细胞未见增殖。结论静脉移植后可导致血管管壁细胞增殖,如合并血流动力学变化则会发生更严重的细胞增殖和迁移,导致管腔狭窄;减少移植损伤,改善移植静脉的微循环,成为预防移植静脉再狭窄的理论基础之一;静-静移植的动物模型,有助于探寻静脉移植后再狭窄的机制。