肝癌衍生生长因子-2在大鼠脊髓损伤后的表达及其意义

目的:探讨肝癌衍生生长因子(HDGF)-2在大鼠脊髓损伤后的表达及其意义。方法:取成年SD大鼠120只,随机分成正常对照组和脊髓损伤组。采用改良Allen’s法建立脊髓损伤动物模型,分别于损伤后1、21、45d分别采集受损伤的脊髓标本。应用免疫组织化学染色技术观察HDGF-2在正常脊髓、受损伤后不同时间点的脊髓组织中的表达情况。结果:(1)HDGF-2在大鼠正常脊髓和受损伤脊髓前角神经元和胶质细胞的细胞核中均有表达。(2)脊髓神经细胞核内HDGF-2染色评分,在正常组为50±9,脊髓损伤组为132±30,两组间HDGF-2表达比较具有显著性差异(P0.01)。(3)HDGF-2表达评分在术后1、21、45 d分别为141±62,107±33和92±18,脊髓损伤不同时间点HDGF-2表达评分比较具有显著性差异(P0.01)。结论:脊髓损伤后HDGF-2表达升高,提示其参与脊髓损伤和修复的病理过程。     

大鼠脊髓发育及损伤后NIDD mRNA表达的实验研究

目的：探讨在大鼠发育过程中及急性脊髓损伤后脊髓组织中NIDD （nNOS-interacting DHHC domain-containing protein with dendritic mRNA）mRNA的表达变化及意义。方法：采用改良Allen＇s打击法，咬除T8-10椎板后，造成大鼠脊髓损伤模型，致伤量为10×10g·cm；借助实时荧光定量PCR、原位杂交与免疫荧光结合的方法，定量、定位研究发育过程中及脊髓损伤后早期大鼠脊髓组织中NIDD mRNA与nNOS mRNA表达的时间和空间分布特征。结果：大鼠发育过程中，胚胎16d的大鼠脊髓中可见NIDD mRNA的高表达，在生后1d，与nNOS共表达于尚未分化成熟的前角，在白质也见NIDD的阳性信号。成年后呈低表达；nNOS mRNA于生后1～3d出现表达高峰；脊髓损伤后NIDD mRNA表达明显增多，在8h到达高峰，分布于脊髓前角、中间带、中央管周围及后角nNOS阳性的神经元，7d恢复至正常水平；nNOS mRNA在损伤后8h达到高峰，1d降低至正常水平。而且，在脊髓损伤后NIDD mRNA与nNOS mRNA二者表达呈正相关。结论：胎鼠脊髓中，NIDD高表达于nNOS阳性细胞，提示其在脊髓组织的发育成熟过程中的作用可能与nNOS相关。脊髓损伤后脊髓组织中NIDD与nNOS表达增多，提示在脊髓损伤的病理过程中，NIDD可能通过调节nNOS的细胞亚定位及活性而发挥一定的生物学作用。     

脊髓横断损伤后再生基因蛋白的表达

目的探讨再生基因蛋白(Reg-2)在脊髓横断损伤后表达的时序变化及其可能的意义。方法SD雌性大鼠45只,实验分为脊髓损伤组(30只)、假手术组(15只)。脊髓损伤组大鼠麻醉后于T9、T10脊髓节段之间用手术刀完全切断脊髓,建立大鼠脊髓横断损伤模型;假手术组大鼠只打开推板,不损伤脊髓,为阴性对照。分别于脊髓损伤后1h、1d、3d、7d1、4d用多聚甲醛灌注后,以T10节段为中心取出长约2cm的脊髓,制作冠状切面及横断切面冷冻切片。分别通过免疫组织化学、免疫荧光和Western blotting法检测Reg-2的表达水平及部位,并与胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、少突胶质细胞系转录因子2(Olig2)以及神经肽Y(NPY)、降钙素基因相关肽(CGRP)、神经性生长蛋白-43(GAP-43)等神经细胞特异性标记物做双重标记。结果脊髓损伤组中,表达Reg-2的阳性细胞随着时间的推移,先增加后减少,脊髓损伤后的1周内维持在较高水平,其中第3d后角神经元的Reg-2表达最高,第7d前角神经元Reg-2的表达最高。结论Reg-2可能参与了脊髓损伤后早期的神经再生和重建进程。     

大鼠脊髓全横断损伤后Wnt信号基因的表达

目的探讨大鼠脊髓全横断损伤后,Wnt信号基因在不同时相脊髓表达的变化及意义。方法成年健康Wistar大鼠30只,随机分为假手术组(sham组)和脊髓损伤组(SCI组),SCI组分为术后1d、3d、7d、14d、21d组,每组5只。SCI组大鼠T11脊髓段做全横断损伤,sham组仅行椎板切除术,术后大鼠进行BBB运动功能评分。采用半定量RT-PCR方法检测脊髓损伤组织中Wnt信号基因的表达。结果SCI组所有动物在术后均表现为双后肢瘫痪,BBB运动功能评分明显低于sham组。SCI组在脊髓横断术后1d、3d、7d Wnt3a表达均较sham组明显增加;尾侧端Wnt3a较同时相头侧端的表达多,且在21d又出现明显的升高。在sham组和SCI组均未检测到神经基因蛋白1(Ngn1)的表达。发状分裂相关增强子1(Hes1)的表达在SCI后第1d较sham组有明显的下降,第3d出现升高,之后逐渐下降。结论Wnt信号可能参与了脊髓损伤后修复再生的过程。     

RNA-Seq筛选脊髓损伤后的差异基因及部分基因功能分析

目的应用RNA-Seq技术分析脊髓损伤后不同阶段基因表达差异情况。方法使用IH脊髓打击仪制备脊髓损伤模型,SD大鼠48只随机分成两组,假手术组和实验组,实验组分别于损伤后1d、4d和7d取材。运用RNA-Seq技术筛选脊髓损伤后不同时间点的差异表达基因,对差异基因进行表达模式分析,功能注释,通路分析等,筛选出血红素氧化酶1(Hmox1)等感兴趣基因进行mRNA和蛋白水平的验证及功能分析。结果 RNA-Seq结果表明,与假手术组相比,脊髓损伤后1d、4d和7d发生显著变化的基因分别有944、1362和1421个。上述差异基因在损伤后不同时间点的变化趋势大致可分为8种形式。Real-time PCR结果显示,Hmox1、尿激酶型纤溶酶原激活剂(Plau)、纤溶酶原激活物抑制剂(Serpine1)和中性粒细胞胞质因子(Ncf2)的表达变化与RNA-Seq测序结果基本一致。Western blotting结果显示,脊髓损伤后Hmox1的蛋白表达变化趋势与核酸水平一致;免疫组织化学结果显示,损伤之后Hmox1主要表达于脊髓组织的神经元中。结论 RNA-Seq技术能高效分析脊髓损伤后的差异基因,从大量差异基因中筛选出感兴趣基因的验证和功能分析为阐述脊髓损伤的分子机制提供了部分资料。     

BYHWD对脊髓损伤大鼠脊髓组织Bcl-2和Bax表达的影响

目的:观察补阳还五汤(buyanghuanwu decoction,BYHWD)对脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)模型大鼠脊髓神经细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及其mRNA表达的影响,初步探讨BYHWD抑制脊髓神经细胞凋亡的作用机制。方法:Wistar大鼠40只,随机分为四组:正常对照组、SCI模型组、BYHWD组和甲基强的松龙(MP)注射组,每组10只大鼠;后三组动物先建立SCI损伤模型,然后分别给予BYHWD组和MP组BYHWD和MP治疗。四组动物分别于术后1、7、14、21 d和28 d对大鼠后肢神经功能的恢复情况进行BBB(Basso-Beattie-Bresnahan)功能评分。第28 d处死各组大鼠,采用Real-time PCR法检测脊髓组织Bcl-2和Bax mRNA的表达情况,Western Blot法检测脊髓组织Bcl-2和Bax蛋白的表达情况。结果:大鼠麻醉清醒后,SCI组大鼠损伤平面以下完全瘫痪。BBB评分结果显示:术后第7 d~28 d,与正常对照组相比,SCI组BBB评分明显降低(P0.05);与SCI组相比,BYHWD处理组和MP处理组大鼠BBB评分明显增高(P0.05),但BYHWD处理组和MP处理组大鼠相比,BBB评分无明显差异(P0.05)。Real-time PCR和Western Blot结果显示:与正常对照组相比,SCI组Bax蛋白及mRNA的表达明显升高(P0.05),而Bcl-2蛋白及mRNA的表达则明显有所降低(P0.05)。与SCI组相比,BYHWD处理组和MP处理组大鼠脊髓组织Bax蛋白及mRNA表达明显降低(P0.05),而Bcl-2蛋白及mRNA表达则明显有所升高(P0.05)。但BYHWD处理组和MP处理组大鼠脊髓组织Bcl-2、Bax蛋白及mRNA表达之间无明显差异(P0.05)。结论:BYHWD可以改善SCI大鼠后肢的运动功能,通过下调Bax的表达,上调Bcl-2的表达,从而抑制SCI大鼠脊髓神经细胞的凋亡,发挥其保护作用。     

水通道蛋白-4在实验性脊髓损伤大鼠的表达

为了观察大鼠脊髓损伤后水通道蛋白4(AQP 4)的表达和对后肢功能的影响,本实验建立Allen脊髓损伤动物模型,于术后1、3、7、14和21d分别对大鼠进行了BBB评分检查后肢功能,处死动物后应用免疫组织化学技术检测脊髓组织内AQP 4的表达,用图像分析仪对脊髓损伤后神经组织的AQP 4的变化进行了定量分析。结果表明:脊髓损伤后第1d,在脊髓损伤组受损伤脊髓灰质和白质中均可见到AQP 4的表达明显增加;第3d时均达到高峰。在第7、14、和21d,AQP 4的表达与对照组均有显著性差异(P<0. 01)。本研究结果提示:脊髓损伤后大鼠脊髓组织中AQP 4的表达显著增加。     

成年大鼠脊髓损伤后血-脊髓屏障通透性变化

为了观察脊髓挤压伤后血-脊髓屏障(BSCB)的通透性变化,本研究选用体重180~200g成年雄性SD大鼠39只,随机分为对照组(n=3)和脊髓损伤组(n=6)。后者又分为伤后0、8、24、72h以及1周、2周等6组,每组6只,再分为A组、B组,每组各3只。脊髓损伤组A组的组织切片行H.E.染色,显微镜下观察脊髓损伤后的形态学变化。对照组和B组动物股静脉注射30g/L伊文思蓝,30min后,以温生理盐水及4%多聚甲醛灌注动物,取出脊髓,行冰冻切片,荧光显微镜下观察。结果观察到,脊髓挤压伤术后72h内,损伤区周围均可见伊文思蓝染色,至1周后损伤区周围未见伊文思蓝染色。本研究结果提示,脊髓损伤72h内可能为有效给药时间窗,1周后给药,药物对脊髓损伤的治疗作用将难以达到治疗目的。     

大鼠Desert Hedgehog基因的克隆和表达

目的克隆大鼠Desert Hedgehog（DHH）基因,构建其真核表达载体并转染TP67细胞;同时制备DHHcRNA正义及反义探针用于检测其在细胞中的表达。方法提取SD大鼠睾丸总RNA,RT-PCR法扩增DHHcDNA片段,连接于pGEM—TEasy载体,经测序后构建真核表达载体pLXSN／DHH并转染PT67细胞;重组质粒经限制性内切酶NotⅠ和NcoⅠ酶切、回收后,进行转录标记反应,原位杂交检测DHH在嘶7细胞中的表达。结果RT-PCR扩增得到1220bp的片段;成功构建了真核表达载体pLXSN／DHH;制备DHH正义及反义探针浓度分别为150mg／L和80mg／L;DHH在PT67细胞中有表达。结论克隆的DHH基因与大鼠Sertoli细胞的DHH基因相同,成功标记了特异、敏感的DHHcRNA探针,转染的DHH基因能够在PT67细胞中表达。     

减压对大鼠脊髓压迫性损伤后脱髓鞘病变和BDNF表达的影响

目的观察脑源性神经生长因子(BDNF)对脊髓压迫性损伤(CSCI)后有髓神经纤维脱髓鞘病变的影响,为阐明BDNF对神经纤维脱髓鞘病变修复提供实验基础。方法将大鼠均分成4组:正常组、假手术组、压迫组和减压组。用自行设计的压迫器制作大鼠脊髓压迫模型。压迫组作脊髓压迫12 h,减压组作脊髓压迫1 h,假手术组仅作脊髓显露,不作压迫。用锇酸染色观察CSCI后1、3和7 d有髓神经纤维变化情况;Western blot和免疫荧光双标检测BDNF和髓鞘碱性蛋白(MBP)的表达。结果压迫组和减压组都出现脱髓鞘病变,并随着时间的延长,髓鞘逐渐水肿、变性、MBP崩解。BDNF表达量在CSCI后随时间延长也逐渐降低(P0.05),但与压迫组相比较,减压组脱髓鞘病变较轻且MBP和BDNF降低幅度小而缓慢(P0.05)。结论 CSCI后尽早减压可减轻脱髓鞘的发生,且可能与BDNF的表达有关。     

胚胎脊髓移植对大鼠脊髓全横断后功能修复及NOS表达的影响

目的　探讨胚胎脊髓移植对脊髓全横断大鼠脊髓功能修复及NOS表达的影响。方法　在脊髓全横断处移植胚胎脊髓 6 0d后 ,应用NADPH d组织化学方法检侧脊髓内一氧化氮合酶神经元的分布及形态变化 ,并做图像分析。用BBB评分法观察大鼠后肢运动功能的恢复。结果　胚胎大鼠脊髓移植后可以使全横断脊髓前角内NOS表达增加 ,与损伤对照组比较有显著性差异 (P <0 .0 1) ;大鼠后肢的自主运动功能恢复好于损伤对照组。结论　胚胎脊髓移植对成年大鼠损伤脊髓功能恢复有促进作用 ,NO可能参与修复作用。     

大鼠脊髓损伤及继发损伤时脊髓诱发电位与运动诱发电位的变化

本文采用改良Ａｌｌｅｎ’ｓ法，分别以５０ｇ／ｃｍ和１００ｇ／ｃｍ打击大鼠Ｔ１３～Ｌ１脊髓，造成不同程度的脊髓损伤，分别观察伤后２４小时内的ＳｐＥＰ和ＣＭＥＰ的变化，以了解不同程度损伤对ＳｐＥＰ和ＣＭＥＰ的影响及ＳｐＥＰ、ＣＭＥＰ的变化与脊髓继发性损伤发展过程的关系。结果表明：①两种不同程度的脊髓损伤均可造成大鼠脊髓ＳｐＥＰ，ＣＭＥＰ的明显变化，尤以ＳｐＥＰ变化明显。损伤越重，电位改变越明显．②在脊髓损伤后１～２４小时内，伤后１０分钟ＳｐＥＰ，ＣＭＥＰ波幅却有明显降低，４～８小时进一步降低。两次降低有明显差异。ＳｐＥＰ峰潜伏时延长，以４～８小时显著。表明原发损伤后在受损部位存在继发性损伤，提示阻止继发损伤的时间应早于伤后４小时，并尽可能提前。     

中药髓复康对脑脊髓损伤大鼠血液流变性的实验研究

目的:观察中药髓复康(SFK)对实验性脑脊髓损伤大鼠血液流变性的影响。方法:雄性SD大鼠80只,通过脑缺血再灌注和脊髓半横断损伤实验,观察SFK对于脑水肿和脊髓损伤后血液流变性和基因表达谱的影响。结果:①脑缺血再灌注损伤后,大鼠全脑含水量明显增加,SFK干预后仅轻微增加;②脑脊髓损伤后血液由低凝转为高凝,SFK干预后使高凝转为低凝;③基因芯片检测发现,脊髓损伤后出现众多的差异表达基因,SFK干预可以调节某些基因表达的,如上调脂皮素、载脂蛋白CI-II、半胱氨酸蛋白酶和纤溶酶原,下调弹性蛋白酶和血管内皮粘附分子。结论:SFK能纠正脑脊髓损伤早期的血液流变性和基因表达异常。     

巢蛋白在胚胎及新生大鼠脊髓的表达

目的　检测不同发育时期巢蛋白 (nestin)在脊髓神经干细胞的表达水平 ,探讨脊髓神经干细胞的发育规律 ,为分离、富集和增殖均质的神经干细胞以及后期的研究工作如神经干细胞定向分化及移植治疗等研究提供实验依据。方法　将Wistar大鼠按胎龄及日龄分组 ,剥离脊髓 ,制成单细胞悬液 ,经间接荧光法标记nestin抗原 ,用流式细胞仪检测和分析。结果　从E13到P7整个发育过程中都有nestin抗原的表达 ,呈升高趋势 ,其中P1期表达水平最高。出生后表达下降 ,趋近于 90d(同型对照 )表达水平。结论　巢蛋白在脊髓的表达出现于胚胎早期 ,表达水平随胎龄轻微波动 ,呈升高趋势 ,P1达到高峰 ,出生后表达下降 ,趋于成鼠的微量表达     

Therapeutic Effect of Curcumin and Methylprednisolone in the Rat Spinal Cord Injury

In addition to imperiling an individual's daily life, spinal cord injury (SCI), a catastrophic medical damage, can permanently impair an individual's body function. Methylprednisolone (MP), a medically accepted therapeutic drug for SCI, is highly controversial for the lack of consensus on its true therapeutic effect. In recent years, curcumin has served as a potential and novel therapeutic drug in SCI. Our study was intended to investigate the precise effect of MP and curcumin in SCI. We examined the function of MP and curcumin in a SCI model rat, both in vivo and in vitro, and found that there was a momentous improvement in Basso‐Beattie‐Bresnahan scores in the MP‐treated group when compared with Cur‐treated group within 14 days. Results obtained from the histological, immunohistochemistry and ultrastructural examinations evidenced the curative effect of MP was better than curcumin before Day 14. Nonetheless, there was a significant variation in the treatment effect between the MP‐treated and Cur‐treated groups after 14 days. The curcumin's effectiveness was more obvious than MP after 14 days following SCI. As such, we surmise that curcumin has a better therapeutic potential than MP with a prolong treatment time in the wake of SCI. Anat Rec, 301:686–696, 2018. © 2017 Wiley Periodicals, Inc.     

Real-Time PCR检测Vimentin基因在脊髓钝挫伤大鼠中的表达

目的使用Real-Time PCR检测脊髓钝挫伤后不同时间点Vimentin基因表达变化。方法 SD成年雌性大鼠,随机分为假手术组、脊髓挫伤6h组,脊髓挫伤5d,组脊髓挫伤14d组。大鼠于术后6h、5d及14d取损伤脊髓进行Real-Time PCR,对Vimentin基因表达进行定量分析。结果 Real-Time PCR发现假手术组Vimentin表达较少,脊髓钝挫伤后6hVimentin表达较假手术组增加,具有显著性(P0.01),Vimentin表达达到高峰后逐渐下降,脊髓钝挫伤5d及14d时Vimentin表达较6h组显著降低(P0.01),14d时接近正常水平。结论脊髓钝挫伤后大鼠Vimentin基因表达水平于损伤早期显著上升,之后下降逐渐恢复致正常水平,Vimentin的在脊髓损伤后基因的表达变化为脊髓损伤机制研究提供理论依据。     

The Effects of Age on the Morphometry of the Cervical Spinal Cord and Spinal Column in Adult Rats: An MRI‐Based Study

Rat models are commonly used to investigate the pathophysiological pathways and treatment outcomes after spinal cord injury (SCI). The high incidence of fall‐induced SCI in older adults has created a need for aging models of SCI in rats to investigate potential age‐related differences in SCI severity and outcomes. The aims of this study were to determine the influences of age and vertebral level on the geometries of the cervical spinal cord and spinal column in a rat model. Three young (3 months) and three aged (12 months) Fischer 344 rats were imaged in a high field (7 T) small‐animal magnetic resonance imaging system. All spinal cord geometry variables (including depth, width, and axial cross‐sectional area) and one spinal canal variable (depth) were significantly larger in the aged specimens by an average of 8.1%. There were main effects of vertebral level on all spinal cord variables and four spinal canal variables with values generally larger at C4 as compared to C6 (average increases ranged from 5.7% to 12.9% in spinal cord measures and 5.4% to 6.8% in spinal canal measures). High inter‐rater reliability between two measurers was observed with a mean intraclass correlation of 0.921 and percent difference of 0.9% across all variables measured. This study clearly demonstrates that cervical spinal cord geometry changes between the ages of 3 and 12 months in Fischer 344 rats. This information can aid in the planning and interpretation of studies that use a rat model to investigate the influence of age on cervical SCI. Anat Rec, 297:1885–1895, 2014. © 2014 Wiley Periodicals, Inc.     

神经生长因子mRNA在大鼠脊髓和脊神经节的表达——原位杂交研究

我们以 SD大鼠坐骨神经为材料 ,在 NGF- c DNA文库建立的基础上 ,人工合成神经生长因子引物 ,并用 PCR地高辛标记法标记 NGF探针 ,采用原位分子杂交组织化学方法 ( ISHH) ,观察 NGF- m RNA神经生长基因表达细胞在大鼠腰段脊髓和脊神经节内的分布。结果发现在大鼠坐骨神经损伤模型腰段脊髓横切面的前角、侧角及腰背根神经节均有 NGF基因的表达细胞 ,蓝色反应物弥散性分布于胞浆内 ,呈细小颗粒状或长柱状。损伤侧要强于未损伤侧 ,并对其杂交信号进行定量分析 ,结果显示在大鼠坐骨神经损伤模型术后第 5天、第 10天及第 15天 ,脊髓前角运动神经元 ,侧角交感神经元、背根节感觉神经元内的杂交信号增强 ,表明损伤的早、中期 NGF- m RNA表达量增加。讨论了神经再生的理化因素     

缺氧－复氧损伤对大鼠脊髓组织牛磺酸转运的影响

本工作在大鼠离体脊髓缺氧－复氧损伤模型上，观察了脊髓组织牛磺酸转运的特征，结果发现：缺氧４５ｍｉｎ后复氧孵育１５ｍｉｎ，脊髓组织出现明显的牛磺酸转运的障碍，表现为Ｖ＿（ｍａｘ）明显降低（为正常组的７１％，Ｐ＜０．０１），Ｋｍ值无明显改变，推测缺氧。复氧可能通过影响能量代谢而导致脊髓组织牛磺酸转运的障碍。     

Morphofunctional Basis for Recovery of Locomotor Movements in Rats with Completely Crossed Spinal Cord

Treadmill training of spinalized rats creates conditions for early appearance of rhythmic locomotor movements of the hind limbs. Recovery of the movements was paralleled by an appropriate structural organization of neurons in the anterior horns of the distal compartment of the spinal cord.