柯萨奇病毒B3诱导大鼠心肌成纤维细胞骨桥蛋白及I型胶原的表达情况

目的检测柯萨奇病毒B3（CVB3）对大鼠心肌成纤维细胞骨桥蛋白（OPN）及I型胶原表达的影响,探讨OPN在病毒性心肌炎的可能发病机制。方法用重复感染率（MOI）为0．5PFU／cell的CVB3感染体外培养的大鼠心肌成纤维细胞,细胞分对照组（12h）、病毒组（感染后12h、1d,2d及3d）。用RT·PCR及WesternBlot、免疫组化检测OPN及I型胶原表达,并将OPN表达与I型胶原表达进行直线相关分析。结果（1）RT-PCR测得对照组12h、病毒组12h、1d、2d及3d5组OPN／13-actin吸光度比值分别为：0．38±0．06、0．56±0．06、0．72±0．05、0．98±0．06、0．86±0．02;WesternBlot测得上述5组的OPN／13-actin灰度值分别为：0．26±0．03、0．36±0．03、0．52±0．04、0．76±0．05、0．62±0．02;感染后12h,OPN表达即增高,于2d达到高峰,3d呈下降趋势,OPN／13-actin吸光度比值、灰度值比较差异均有统计学意义（F值分别为74．965、53．004,P均〈0．05）;（2）RT-PCR测得心肌成纤维细胞对照组12h、病毒组12h、1d、2d、3dI型胶原／13-actin吸光度比值分别为：1．12±0．03、1．184-0．01、r．22±0．02、1．33±0．02、1．28±0．03,感染后12hI型胶原表达即增高,于2d达到高峰,3d呈下降趋势,差异有统计学意义（F=38．241,P〈0．05）;（3）OPN表达与I型胶原有正相关关系（r=0．948,P〈0．001）。结论CVB3可诱导心肌成纤维细胞I型胶原及OPN表达,OPN表达与I型胶原表达呈正相关,提示OPN可能促进心肌成纤维细胞I型胶原表达,参与病毒性心肌炎心肌纤维化的发病机制。     

应用成纤维细胞胶原网格体外三维培养模型观察重组核心蛋白多糖固相态时对转化生长因子β1刺激正常皮肤成纤维细胞的应答

目的:模拟体内核心蛋白多糖和转化生长因子β1接触方式,研究核心蛋白多糖在固相抑制转化生长因子β1刺激正常皮肤成纤维细胞的作用。方法:实验于2005-01/09在广州市创伤研究所完成。①实验成纤维细胞的组织来源:取材于广州市红十字会医院,患者自愿,正常皮肤为包皮。取新鲜包皮,修除表皮和皮下组织,加入含体积分数0.02的胎牛血清的DMEM培养,实验用第4～8代细胞。②采用醋酸法从鼠尾腱中提取I型胶原,使用浓度为2g/L,网格胶原终浓度为1g/L,成纤维细胞密度为1×109L-1。将胶原细胞混悬液按2mL/皿均匀加入直径35mm的培养皿内,37℃培养10min,混悬液便形成凝胶即成纤维细胞胶原网格,再加入相应的培养液。分为4组:对照组、核心蛋白多糖组、转化生长因子β1组、转化生长因子β1 核心蛋白多糖组。③观察成纤维细胞胶原网格的收缩,Westernblot法检测成纤维细胞胶原网格中成纤维细胞纤溶酶原激活物抑制物-1、α-平滑肌肌动蛋白的表达,反转录-聚合酶链反应检测其mRNA表达。结果:①成纤维细胞胶原网格收缩的变化:对照组成纤维细胞胶原网格培养12h,收缩到起始面积的(81.2±4.9)%,12～24h收缩加剧,在24h收缩到起始面积的(47.4±4.7)%,以后收缩减慢,在48h收缩到起始面积的(37.3±3.6)%,72h收缩到起始面积的(29.6±3.6)%,96h收缩到起始面积的(28.7±2.8)%,以后不再收缩;核心蛋白多糖组成纤维细胞胶原网格收缩到起始面积的百分比在12,24,48,72,96h均高于对照组(P<0.05);转化生长因子β1组成纤维细胞胶原网格收缩到起始面积的百分比在各时相点均低于对照组(P<0.01);转化生长因子β1 核心蛋白多糖组成纤维细胞胶原网格收缩到起始面积的百分比在各时相点均高于转化生长因子β1组(P<0.05),与对照组比较无显著差异(P>0.05)。②成纤维细胞胶原网格中细胞表达纤溶酶原激活物抑制物-1、α-平滑肌肌动蛋白的变化:核心蛋白多糖组纤溶酶原激活物抑制物-1、α-平滑肌肌动蛋白蛋白表达(1391.61±126.27,525.97±60.10),与对照组(1474.52±133.84,569.41±62.55)比较无显著差异(P>0.05),转化生长因子β1组纤溶酶原激活物抑制物-1、α-平滑肌肌动蛋白蛋白表达(2909.77±264.04,2725.46±150.54)显著高于对照组(P<0.01),转化生长因子β1 核心蛋白多糖组纤溶酶原激活物抑制物-1、α-平滑肌肌动蛋白蛋白表达(1775.25±161.09,926.34±51.16)显著低于转化生长因子β1组(P<0.05),且与对照组比较无显著差异(P>0.05)。③成纤维细胞胶原网格中细胞表达纤溶酶原激活物抑制物-1、α-平滑肌肌动蛋白mRNA的变化:核心蛋白多糖组纤溶酶原激活物抑制物-1、α-平滑肌肌动蛋白mRNA表达(0.19±0.05,0.07±0.02),与对照组(0.21±0.06,0.08±0.03)比较无显著差异(P>0.05),转化生长因子β1组纤溶酶原激活物抑制物-1、α-平滑肌肌动蛋白mRNA表达(0.86±0.15,0.36±0.10)显著高于对照组(P<0.01),转化生长因子β1 核心蛋白多糖组纤溶酶原激活物抑制物-1、α-平滑肌肌动蛋白mRNA表达(0.34±0.09,0.13±0.04)显著低于转化生长因子β1组(P<0.05),且与对照组比较无显著差异(P>0.05)。结论:重组核心蛋白多糖融入胶原凝胶,能显著抑制转化生长因子β1刺激正常皮肤成纤维细胞的作用,表明在体内核心蛋白多糖具有拮抗转化生长因子β1的作用。     

白细胞介素-1β对小鼠气道成纤维细胞前列腺素E_2表达的影响

目的 研究白细胞介素-1β(IL-1β)对小鼠气道成纤维细胞前列腺素E_2(PGE_2)表达的影响,以探讨其在吸入性损伤修复中的作用.方法 分离雄性昆明种小鼠的气道成纤维细胞并进行体外培养,分别收集不同浓度的IL-1β作用后不同时间点IL-1β的培养上清液及细胞;采用酶联免疫吸附试验法和West-ern blot技术测定PGE_2水平,环氧化酶-2(COX-2)、膜相关前列腺素E_2合成酶1(mPGES1)蛋白表达.结果 ①经IL-1β 1.0μg/L处理后不同时间点气道成纤维细胞培养上清液PGE_2水平在8 h[(148.2±28.3)ng/L]、16 h[(267.6±45.4)ng/L]、24 h[(210.5±38.6)ng/L]、48 h[(198.7±36.5)ng/L]均高于各对照组[分别为(57.8±15.3)、(58.2±15.7)、(57.9±15.8)、(58.1±16.1)ng/L],差异均有统计学意义(P均<0.01),其中16 h时间点水平最高;气道成纤维细胞COX-2表达在8 h[(0.478±0.029)COX-2/β-actin、16 h(0.672±0.047)COX-2/β-actin、24 h(0.617±0.036)COX-2/β-actin、48 h(0.593±0.034)COX-2/β-actin]均高于对照组[(0.309±0.019)COX-2/β-actin、(0.311±0.019)COX-2/β-actin、(0.309±0.019)COX-2/β-ac-tin、(0.310±0.018)COX-2/β-actin],差异有统计学意义(P均<0.01),其中16 h时间点表述水平最高;气道成纤维细胞mPGES1的表达在8 h(0.300±0.018)mPGES1/β-actin、16 h(0.549±0.034)mPGES1/β-actin、24h(0.497±0.030)mPGES1/β-actin、48 h(0.443±0.026)mPGES1/β-actin均高于各对照组[(0.199±0.012)、(0.201±0.013)、(0.200±0.013)和(0.200±0.022)mPGES1/β-actin],差异有统计学意义(P均<0.01),其中16 h时间点表达水平最高.②不同浓度IL-1β处理气道成纤维细胞后,气道成纤维细胞培养上清液PGE_2水平在IL-1β 0.1 μg/L组[(242.9±22.3)ng/L]、1.0μg/L组[(267.6±45.4)ng/L和10.0μg/L组[(587.3±106.9)ng/L]均高于对照组[(58.5±16.0)ng/L],差异有统计学意义(P均<0.01),并且这3组之间比较差异也有统计学意义(P均<0.01);气道成纤维细胞COX-2表达在IL-1β 0.1μg/L组(0.525±0.032)ng/L、1.0μg/L组(0.672±0.047)ng/L和10.0μg/L组(1.022±0.064)ng/L均高于对照组(0.309±0.019)ng/L,差异有统计学意义(P均<0.01),并且这3组之间比较差异也有统计学意义(P均<0.02);气道成纤维细胞mPGES1表达在IL-1β 0.1μg/L组(0.380±0.021)ng/L、1.0μg/L组(0.549±0.034)ng/L和10.0μg/L组(0.879±0.045)ng/L均高于对照组(0.199±0.022)ng/L,差异有统计学意义(P均<0.01),并且这3组之间比较差异也有统计学意义(P均<0.01).结论 炎症递质IL-1β可上调气道成纤维细胞PGE_2水平、COX-2和mPGES1表达,这表明IL-1β可能是通过COX-2和mPGES1的表达来影响PGE_2合成,从而参与气道吸入性损伤修复过程.气道成纤维细胞可能是损伤修复过程中炎症递质的主要来源细胞之一.     

心肌梗死大鼠TGF-β1与Ⅰ型胶原变化的研究

目的研究大鼠心肌梗死后心肌转化生长因子β1(TGF-β1)与Ⅰ型胶原表达,并测定大鼠血浆内TGF-β1的含量。方法结扎左冠状动脉建立大鼠心肌梗死模型,采用ELISA法测定心肌梗死不同时间内大鼠血浆内TGF-β1的含量;应用免疫荧光染色的方法,通过激光扫描共聚焦显微镜观察TGF-β1与Ⅰ型胶原表达的变化。结果大鼠心梗后1 d3、d5、d血浆内TGF-β1含量明显增加(P<0.01),呈时间依赖性。心梗后24 h心肌TGF-β1与Ⅰ型胶原表达与假手术组相比明显增强。结论心梗后心肌通过增加TGF-β1、Ⅰ型胶原的表达参与心室重构。     

丹参酮ⅡA抑制心肌细胞的纤维化

背景：转化生长因子β-Smads信号通路是心肌纤维化的关键通路;丹参酮ⅡA具有抑制心肌纤维化作用.目的：验证丹参酮ⅡA对转化生长因子β1致心肌纤维化的作用并探讨其机制.方法：取出生24 h内的SD大鼠心脏,利用酶消化法结合差速贴壁体外培养心肌成纤维细胞.取上述第3代心肌成纤维细胞,用5μg/L转化生长因子β1培养15,30,60,120 min或6,12,24 h后收集细胞,用不同浓度（10-5 mol/L、10-4结果与结论：转化生长因子β1在一定范围内以时间依赖方式诱导结缔组织生长因子、Ⅰ型胶原、磷酸化Smad3及Smad7的表达,刺激终末结缔组织生长因子、Ⅰ型胶原mRNA的表达量明显上升（均P 〈0.01）;磷酸化Smad3及Smad7蛋白表达量在刺激后1 h达到峰值,表达量显著增加（均P 〈0.01）.高浓度丹参酮ⅡA预处理可显著下调磷酸化Smad3、结缔组织生长因子及Ⅰ型胶原表达（均P 〈0.01）.两种浓度的丹参酮ⅡA预处理均可上调Smad7蛋白表达（P 〈0.05,P 〈0.01）.提示丹参酮ⅡA对心肌纤维化有抑制作用,可能与其上调Smad7蛋白表达,抑制转化生长因子β1诱导的Smad3磷酸化,部分阻断转化生长因子β1-Smads信号通路有关. mol/L）丹参酮ⅡA预处理2 h后再加入5μg/L转化生长因子β1培养120 min或24 h后收集细胞,并设空白对照组.免疫细胞化学染色法进行细胞鉴定,反转录聚合酶链反应检测结缔组织生长因子及Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达,Western Blot检测Smad7及磷酸化Smad3蛋白表达.免疫组织化学染色及免疫荧光法检测磷酸化Smad3、结缔组织生长因子及Ⅰ型胶原蛋白表达.     

柯萨奇病毒B3感染人宫颈癌细胞株HeLa细胞后Bad mRNA表达的意义

目的探讨柯萨奇病毒B3(CVB3)诱导的Bad mRNA表达的意义。 方法体外培养的HeLa细胞通过CVB3感染建立模型,通过倒置显微镜下观察CVB3感染HeLa细胞后在不同时间点(3 h、6 h、9 h、12 h、24 h)细胞形态学变化,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测凋亡相关基因Bad mRNA的表达。采用SPSS 16.0统计软件进行统计分析,两组Bad mRNA的表达水平采用均数±标准差表示,显著性比较采用t检验。 结果CVB3感染HeLa细胞后对照组各时间点无形态上的变化;病毒组随着感染时间的延长,逐渐出现细胞病变效应,以感染24 h后最明显。对照组各时间点Bad mRNA的表达量比较差异无统计学意义(P>0.05),病毒组各时间点Bad mRNA的表达量比较差异无统计学意义(P>0.05),但感染24 h后病毒组Bad mRNA[(0.61±0.06) s]表达低于对照组[(0.76±0.06) s],差异有统计学意义(t＝－3.445,P<0.05),而3 h、6 h、9 h、12 h后病毒组和对照组Bad mRNA表达量的比较差异无统计学意义(t＝－0.97,－0.43,－3.9,－0.97;P>0.05)。 结论促凋亡基因Bad mRNA在CVB3病毒感染的HeLa细胞中发挥促凋亡作用。     

心肌梗死大鼠TGF-β1与Ⅰ型胶原表达的研究

目的研究大鼠心肌梗死后转化生长因子β1(TGF-β1)与Ⅰ型胶原表达。方法结扎左冠状动脉建立大鼠心肌梗死模型,采用免疫荧光染色的方法,通过激光扫描共聚焦显微镜观察TGF-β1与Ⅰ型胶原表达的变化。结果心梗24h后心肌TGF-β1与Ⅰ型胶原表达与假手术组相比明显增强。结论心梗后心肌通过增加TGF-β1、Ⅰ型胶原的表达参与心室重构。     

BRL37344对大鼠心肌成纤维细胞磷脂酰肌醇(-3)激酶-蛋白激酶B信号通路的影响

目的 探讨β3-肾上腺素能受体(β3-adrenergic receptor,β3-AR)激动剂BRL37344是否通过细胞内磷脂酰肌醇(-3)激酶-蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3 kinase-protein kinase B,PI3K-Akt)信号传导途径促进大鼠心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFbs)增殖及胶原纤维增生.方法 哈尔滨医科大学附属第一医院中心实验室无菌条件下剪取新生1～3 d的Wistar大鼠心脏,采用酶消化法、差速贴壁法获取CFbs.随机数字法分为5组:①空白组:不给予任何药物干预.②BRL组:给予BRL37344孵育.③LY组:给予LY294002(PI3K抑制剂)预孵育1 h后联合BRL37344共同孵育.④Akt-Ⅰ组:给予Akt-Ⅰ(Akt抑制剂)预孵育1 h后联合BRL37344共同孵育.⑤L-A组:LY294002和Akt-Ⅰ预孵育1 h后联合BRL37344共同孵育.通过MTT比色法观察细胞的增殖情况,RT-PCR法观察Ⅰ、Ⅲ型胶原表达情况.组间进行单因素方差分析,组间比较采用Tukey检验.以P＜0.05为差异具有统计学意义.结果 ①CFbs中存在β3-AR.②与BRL组比较,LY组和Akt-Ⅰ组增殖减低(P＜0.01);L-A组较LY组和Akt-Ⅰ组增殖减低更明显(P＜0.01).③与空白组比较,BRL组Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达均明显增加,给药48 h增加最显著.选取48 h点为作用时间点,与BRL组比较,LY组、Akt-Ⅰ组Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达减低,L-A组较LY组和Akt-Ⅰ组表达减低更显著(P＜0.01).结论 BRL37344通过PI3K-Akt信号传导途径促进心肌成纤维细胞增殖和Ⅰ,Ⅲ型胶原表达增加.     

醛固酮与转化生长因子-β1在心肌纤维化中的作用机制

目的探讨醛固酮与转化生长因子-β1（TGF-β1）在心肌纤维化的作用机制。方法将体外培养的心肌成纤维细胞（CFs）分为对照组、醛固酮组、醛固酮＋依普利酮组、依普利酮组及SB431542预处理组。给予相应处理后,ELISA检测TGF-β1水平,RT-PCR检测Smad2、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达。结果与对照组比较,醛固酮处理后,能显著促进TGF-β1分泌,促进Smad2、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达（P〈0.01）;与醛固酮组比较,醛固酮＋依普利酮组TGF-β1分泌、Smad2、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达均明显下降（P〈0.01）;与醛固酮组比较,SB43l542预处理组抑制Smad2、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达的差异有统计学意义（P〈0.01）。结论醛固酮通过激活MR促进CFs细胞TGF-β1分泌,激活Smad2,使Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达增加,诱导心肌纤维化。     

白细胞介素-1β对小鼠气道成纤维细胞前列腺素E2表达的影响

目的研究白细胞介素-1β（IL-β）对小鼠气道成纤维细胞前列腺素E2（PGE2）表达的影响,以探讨其在吸入性损伤修复中的作用。方法分离雄性昆明种小鼠的气道成纤维细胞并进行体外培养,分别收集不同浓度的IL-1β作用后不同时间点IL-1β的培养上清液及细胞;采用酶联免疫吸附试验法和westem blot技术测定PGE2水平,环氧化酶-2（COX-2）、膜相关前列腺素E2合成酶1（mPGES1）蛋白表达。结果①经IL-1β1．0μg/L处理后不同时间点气道成纤维细胞培养上清液PGE2水平在8h[（148．2±28．3）ng／L]、16h[（267．6±45．4）μg／L]、24h[（210．5±38．6）ng／L]、48h[（198．7±36．5）ng／L]均高于各对照组[分别为（57．8±15．3）、（58．2±15．7）、（57．9±15．8）、（58．1±16．1）ng／L],差异均有统计学意义（P均〈0．01）,其中16h时间点水平最高;气道成纤维细胞COX-2表达在8h[（0．478±0．029）COX-2／β-actin、16h（0．672±0．047）cox-2／β-aetin、24h（0．617±0．036）cox-2／β-actin、48h（0．593±0．034）COX-2／β-actin]均高于对照组[（0．309±0．019）COX-2／β-actin、（0．311±0．019）COX-2／13-actin、（0．309±0．019）COX-2／β-actin、（0．310±0．018）cox-2／β-actin],差异有统计学意义（P均〈0．01）,其中16h时间点表达水平最高;气道成纤维细胞mPGESl的表达在8h（0．300±0．018）mPGES1／β-actin、16h（0．549±0．034）mPGES1／β-actin、24h（0．497±0．030）mPGES1/β-actin、48h（0．443±0．026）mPGES1／β-aetin均高于各对照组[（0．1994±0．012）、（0．201±0．013）、（0．200±0．013）和（0．200±0．012）mPGES1／β-actin],差异有统计学意义（P均〈0．01）,其中16h时间点表达水平最高。②不同浓度IL-1β处理气道成纤维细胞后,气道成纤维细胞培养上清液PGE：水平在IL-1β0．1μg／L组[（142．9±22．3）ng／L]、1．0μg／L组[（267．6±45．4）μg／L和10．0μg／L组[（587．3±106．9）μg／L]均高于对照组[（58．5±16．0）μg／L],差异有统计学意义（P均〈0．01）,并且这3组之间比较差异也有统计学意义（P均〈0．01）;气道成纤维细胞COX-2表达在IL-1β0．1μg／L组（0．525±0．031）ng／L、1．0μg/L组（0．672±0．047）ng／L和10.0μg/L组（1.012±0．064）ng／L均高于对照组（0．309±0．019）ng／L,差异有统计学意义（P均〈0．01）,并且这3组之间比较差异也有统计学意义（P均〈0．01）;气道成纤维细胞mPGES1表达在IL-1β0．1μg／L组（0．380±0．021）ng／L、1．0μg／L组（0．549±0．034）ng／L和10．0μg／L组（0．879±0．045）ng／L均高于对照组（0．199±0．012）ng／L,差异有统计学意义（P均〈0．01）,并且这3组之间比较差异也有统计学意义（P均〈0．01）。结论炎症递质IL-1β可上调气道成纤维细胞PGE2水平、COX-2和mPGES1表达,这表明IL-1β可能是通过COX-2和mPGES1的表达来影响PGE2合成,从而参与气道吸入性损伤修复过程。气道成纤维细胞可能是损伤修复过程中炎症递质的主要来源细胞之一。     

白细胞介素13刺激成纤维细胞胶原基因转录和胶原蛋白的合成

目的:以成纤维细胞株3T3为实验对象,观察白细胞介素13对成纤维细胞株3T3胶原合成作用,探讨白细胞介素13对纤维化形成的作用机制。方法:实验于2005-03/2006-10在江西医学科学研究所江西省医学生物高技术重点实验室进行。实验材料:成纤维细胞株3T3细胞为江西省医学科学研究所江西省医学生物高技术重点实验室保存。白细胞介素13购自Peprotech公司。实验方法:①3T3细胞培养:3T3细胞常规培养在含体积分数为0.15胎牛血清、100U/mL青、链霉素的DMEM培养液中,置于37℃、含体积分数为0.05的CO2孵箱中培养,并分为实验组和对照组,两组细胞均用无血清DMEM培养12～16h,实验组加入100μg/L白细胞介素13,作用24,48,72h后进行以下实验。②应用Van Gieson胶原纤维特殊染色观察白细胞介素13作用下,3T3细胞体外合成胶原纤维情况。细胞培养上清液采用羟脯氨酸实验检测细胞分泌的总胶原蛋白含量。采用RT-PCR检测3T3细胞Ⅰ型胶原α1基因(COL1A1)mRNA的表达。采用Western blotting检测白细胞介素13作用后成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白的表达。结果:①Van Gieson胶原纤维特殊染色观察白细胞介素13对成纤维细胞体外合成胶原纤维的影响:有胶原纤维地方被Van Gieson液染成红色,细胞核则为灰黑色。显微镜下可见成纤维细胞呈放射状、编织状或旋涡状排列,细胞体呈梭形或不规则三角形,胞质向外伸出大小不等的突起,核为椭圆形,位于胞浆的中央,在白细胞介素13孵育的3T3细胞中可观察到较多的胶原纤维。②羟脯氨酸实验检测白细胞介素13对成纤维细胞分泌总胶原含量影响:白细胞介素13刺激3T3细胞分泌的总胶原含量24h后即明显增高,持续至72h(t=6.751,P<0.01),明显高于对照组(t=3.019,P<0.05)。③RT-PCR检测白细胞介素13作用下3T3细胞Ⅰ型胶原α1mRNA水平:在511bp(β-actin)和378bp处(COL1A1)均可见一明显条带。④Western blotting检测白细胞介素13作用下Ⅰ型胶原蛋白表达情况:白细胞介素13作用3T3细胞0,24,48,72h后,Ⅰ型胶原蛋白表达逐渐增强,与actin蛋白相比,差异显著(P<0.05)。结论:白细胞介素13可促进3T3细胞胶原基因的转录和胶原蛋白的合成,可能在纤维化疾病发病机制中发挥重要作用。     

白藜芦醇对肾细胞癌ACHN细胞增殖与凋亡的影响

目的探讨白藜芦醇对肾细胞癌ACHN细胞增殖及凋亡的影响及可能机制。方法对数生长期ACHN细胞随机分为对照组(100μmol/L培养液)、25μmol/L白藜芦醇组(100μmol/L培养液+25μmol/L白藜芦醇)、50μmol/L白藜芦醇组(100μmol/L培养液+50μmol/L白藜芦醇)、100μmol/L白藜芦醇组(100μmol/L培养液+100μmol/L白藜芦醇)、200μmol/L白藜芦醇组(100μmol/L培养液+200μmol/L白藜芦醇)。培养12、24、48 h,采用CCK-8法检测细胞增殖活力;培养24 h,采用流式细胞仪检测细胞凋亡率,采用荧光探针法检测ACHN细胞氧化型二氯荧光素(dichlorofluorecin, DCF)荧光强度,采用Western blot法检测B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphom-2, Bcl-2)、caspase-3蛋白表达。结果对照组及25、50、100、200μmol/L白藜芦醇组培养12 h(0.71±0.01、0.63±0.01、0.56±0.03、0.48±0.02、0.39±0.02)、24 h(1.19±0.04、1.00±0.02、0.79±0.03、0.63±0.03、0.41±0.06)、48 h(1.62±0.02、1.15±0.03、0.79±0.04、0.62±0.04、0.41±0.08)细胞增殖活力吸光度值依次降低(P0.05),培养24 h细胞凋亡率[(7.73±0.87)%、(12.64±1.13)%、(29.43±1.25)%、(37.73±1.24)%、(48.56±1.78)%]依次升高(P0.05);培养24 h,对照组及25、50、100、200μmol/L白藜芦醇组细胞DCF荧光强度[(5.40±0.70)、(14.97±1.33)、(17.03±0.80)、(19.67±1.16)、(31.50±2.28)u/(s·mg)]及caspase-3相对表达量(0.24±0.02、0.58±0.02、1.19±0.05、1.41±0.05、1.74±0.06)依次升高,Bcl-2相对表达量(1.67±0.10、1.11±0.16、0.94±0.11、0.67±0.09、0.53±0.02)依次降低(P0.05)。结论白藜芦醇可诱导肾细胞癌ACHN细胞内活性氧累积,上调caspase-3表达,下调Bcl-2表达,进而抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,且呈剂量依赖性。     

体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原的表达

背景:尽管目前研究将骨髓间充质干细胞的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白高表达作为细胞向某一方向分化的重要标志,但未分化的骨髓间充质干细胞是否表达该类蛋白目前尚无定论.目的:观察分离培养的小鼠骨髓间充质干细胞内Ⅰ、Ⅲ型前胶原的表达情况.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007-10/2008-05在广东药学院完成.材料:ICR小鼠3只,1 d龄ICR乳鼠1只,由广东省医学实验动物中心提供.方法:利用差速贴壁法体外分离纯化小鼠骨髓间充质下细胞,待细胞至70%～80%融合时传代.取1 d龄ICR乳鼠皮肤组织,自行分离传代并冻存,经复苏后获得乳鼠皮肤成纤维细胞.实验组将稳定传代3次的小鼠骨髓间充质干细胞接种到6孔培养板中,按109L-1密度接种,1 mL/孔;对照组同法接种乳鼠皮肤成纤维细胞,培养72 h.主要观察指标:骨髓间充质干细胞的形态及生长情况,RT-PCR法检测细胞内Ⅰ、Ⅲ型前胶原的表达.结果:原代培养的小鼠骨髓间允质干细胞集落形成初期,细胞核较大,胞浆较少,细胞呈三角形、多角形和长梭形等多科形态;传代后细胞生长旺盛.多数呈长梭型,细胞表面有大量微绒毛.培养48 h时,实验组无Ⅰ、Ⅲ型前胶原表达,对照组表达Ⅰ、Ⅲ型前胶原;培养72 h时.实验组Ⅰ、Ⅲ型前胶原表达芾显著低于对照组(t=42.692,85.349,P＜0.01). 结论:传代培养48 h时,骨髓间充质干细胞内Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因尚未启动,至72 h后Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因出现低表达,其并非像成纤维细胞那样在生长过程中持续的表达Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因.     

白细胞介素-22对转化生长因子β1诱导的大鼠肝细胞上皮-间质转化的调控作用

目的研究白细胞介素-22(IL-22)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的大鼠肝细胞上皮-间质转化(EMT)的调控作用。方法将大鼠正常肝细胞BRL-3A细胞分为空白对照组、模型对照组和梯度浓度的重组IL-22(1、10、50 ng/ml)干预组,除空白对照组外,各组均给予2 ng/ml的TGF-β1进行刺激,培养48 h,实时荧光定量PCR检测细胞E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)m RNA的表达量;Western blot检测E-cadherin、vimentin蛋白的表达量。结果空白对照组vimentin m RNA和蛋白的相对表达量分别为0.99±0.11、0.67±0.08,E-cadherin m RNA和蛋白的相对表达量分别为0.98±0.08、0.77±0.06;与空白对照组相比,模型对照组vimentin m RNA(1.24±0.02)和蛋白(0.96±0.06)的表达均增强(t值为-3.805和-4.946,均P<0.05),E-cadherin m RNA(0.81±0.06)和蛋白(0.58±0.03)的表达均减弱(t值为2.868和4.890,均P<0.05)。与模型对照组相比,梯度浓度重组IL-22干预组vimentin m RNA(0.97±0.10、0.57±0.03、0.30±0.77)和蛋白(0.86±0.03、0.74±0.02、0.61±0.04)的表达均减弱(F值为115.068和45.057,均P<0.05),E-cadherin m RNA(1.03±0.07、1.31±0.02、1.61±0.09)和蛋白(0.70±0.02、0.80±0.03、0.88±0.03)的表达均增强(F值为81.163和59.197,均P<0.05);梯度浓度的重组IL-22(1、10、50 ng/ml)干预组之间比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 TGF-β1能诱导大鼠肝细胞发生EMT,IL-22能够逆转TGF-β1介导的EMT,且呈剂量依赖性。     

结缔组织生长因子反义寡核苷酸对人增生性瘢痕成纤维细胞结缔组织生长因子表达及胶原合成的作用

目的:观察结缔组织生长因子反义寡核苷酸对转化生长因子β1诱导的人增生性瘢痕成纤维细胞结缔组织生长因子mRNA、蛋白的表达和胶原合成的影响。方法:实验于2005-03/12在哈尔滨医科大学免疫教研室完成。选取哈尔滨医科大学附属第二医院整形美容中心手术标本,包括正常皮肤和增生性瘢痕。将手术中切下的正常皮肤、增生性瘢痕组织在无菌条件下去除表皮后采用组织块贴壁法培养于含体积分数为0.1的胎牛血清的RPMI1640培养液中,置37℃,体积分数为0.05的CO2条件下原代培养。经2.5g/L胰蛋白酶消化传代,传代至3～5代时进行实验。实验分4组:①正常皮肤成纤维细胞组。②增生性瘢痕成纤维细胞组。③增生性瘢痕成纤维细胞 5.0mg/L转化生长因子β1组(简称转化生长因子β1组)。④增生性瘢痕成纤维细胞 5.0mg/L转化生长因子β1 结缔组织生长因子反义寡核苷酸组(简称反义寡核苷酸组)。用5.0mg/L转化生长因子β1刺激增生性瘢痕成纤维细胞后,以脂质体介导方法将结缔组织生长因子反义寡核苷酸转染增生性瘢痕成纤维细胞中,用反转录-聚合酶链反应方法和WesternBlot方法检测细胞中结缔组织生长因子mRNA和蛋白质的表达;采用3H-脯氨酸掺入法检测细胞的胶原合成量。结果:①反转录-聚合酶链反应结果:结缔组织生长因子mRNA在正常皮肤成纤维细胞中无表达,在增生性瘢痕成纤维细胞中表达增强,转化生长因子β1刺激后表达量0.64±0.32明显高于增生性瘢痕成纤维细胞0.31±0.14,差异显著(P<0.01);反义寡核苷酸组可以大部分抑制结缔组织生长因子mRNA的表达,表达量0.12±0.62明显低于增生性瘢痕成纤维细胞组和转化生长因子β1组,差异显著(P<0.01)。②Western印迹结果:蛋白水平趋势与mRNA水平相一致。结缔组织生长因子蛋白在正常皮肤成纤维细胞中无表达,在增生性瘢痕成纤维细胞中表达增强84.63±11.49,转化生长因子β1刺激后表达量102.89±14.35明显高于增生性瘢痕成纤维细胞组,差异显著(P<0.01);反义寡核苷酸组可以大部分抑制转化生长因子β1的作用,结缔组织生长因子蛋白表达量41.75±10.56低于增生性瘢痕成纤维细胞组和转化生长因子β1组(P<0.01)。③结缔组织生长因子反义寡核苷酸对增生性瘢痕成纤维细胞胶原合成的作用:增生性瘢痕成纤维细胞组、转化生长因子β1组、反义寡核苷酸组的3H-脯氨酸掺入率分别为5381±185,8273±357,2475±859,转化生长因子β1可以显著增加成纤维细胞胶原的合成(P<0.01);而结缔组织生长因子反义寡核苷酸对转化生长因子β1刺激后的成纤维细胞胶原合成有明显抑制作用,差异显著(P<0.01)。结论:结缔组织生长因子反义寡核苷酸能够抑制转化生长因子β1引起的结缔组织生长因子mRNA、蛋白质表达的增高和胶原合成的增多,表明阻断结缔组织生长因子可能是延缓瘢痕纤维化的有效手段。     

转化生长因子β1对培养的瘢痕成纤维细胞挛缩功能的作用

目的研究转化生长因子β1(TGF-β1)对瘢痕成纤维细胞诱导肌动蛋白(α-actin)和粘连蛋白(FN)表达的作用,探讨TGF-β1与烧伤瘢痕挛缩的关系.方法采用细胞培养、ELISA法、免疫组化、图像分析技术,观察在不同TGF-β1含量作用下,瘢痕成纤维细胞α-actin和FN表达的情况.结果不同含量TGF-β1诱导瘢痕成纤维细胞表达α-actin和FN的作用不同,以10～50 μg/L的TGF-β1作用最有效;与对照组相比,实验组的成纤维细胞表达更明显,差异均有显著性意义.结论TGF-β1诱导瘢痕成纤维细胞α-actin和FN的表达增加可能与烧伤瘢痕挛缩有关.     

缬沙坦对心肌缺血坏死后心肌转化生长因子-β1及ⅠⅢ型胶原表达的影响

目的本研究通过观察缬沙坦对大鼠急性缺血坏死后的心肌转化生长因子-β1(TGF-β1)及Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响,探讨缬沙坦对心肌缺血坏死后心室重构的作用.方法实验动物随机分为Val组(缺血加缬沙坦组)、MI组(心肌缺血组)和C组(对照组).14 d后将三组动物处死,心肌组织经HE染色作形态学观察,用免疫组化SP法检测心肌组织切片内的TGF-β1及Ⅰ、Ⅲ型胶原表达.结果心肌组织HE染色:Val组和MI组可见心肌纤维溶解断裂、炎症细胞浸润等改变;免疫组化染色结果:Val组与MI组比较,TGF-β1及Ⅰ、Ⅲ型胶原表达量明显降低(P＜0.01).结论缬沙坦可明显降低心肌缺血坏死后心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原和TGF-β1的表达,从而减轻了心室的重构.     

圆盘状受体反义寡核苷酸对瘢痕疙瘩成纤维细胞中圆盘状受体表达和胶原合成的抑制作用

目的:观察硫代修饰和脂质体包埋的反义寡核苷酸(ASODN)抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞圆盘状受体基因表达及其对瘢痕疙瘩胶原抑制的影响。方法:实验于2005-03/2006-01进行。收集解放军第二军医大学长海医院整形外科手术切除的4例瘢痕疙瘩(供体知情同意),采用组织块培养法进行细胞培养。并将经脂质体包埋并全硫代修饰后的圆盘状受体ASODN加入培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞中,实验分6组,ASODN 5,10,20 μmol/L组、无寡核苷酸组、单纯脂质体及空白对照组。采用反转录-聚合酶链反应技术及[3H]-脯氨酸掺入法检测瘢痕疙瘩成纤维细胞中圆盘状受体1 mRNA、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA表达相对量及其对瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原合成分泌的影响。结果:①圆盘状受体1 mRNA表达相对量:ASODN 5,10,20 μmol/L组低于空白对照组(1.91±0.19,1.19±0.37,0.49±0.14,2.61±0.47,P<0.01),ASODN 20 μmol/L组低于ASODN 5,10 μmol/L组(P<0.01)。②Ⅰ型胶原mRNA表达相对量:ASODN 5,10,20 μmol/L组低于空白对照组(1.91±0.59,1.46±0.17,0.19±0.27,3.31±0.53,P<0.01),ASODN 20 μmol/L组低于ASODN 5,10μmol/L组(P<0.01)。③Ⅲ型胶原mRNA表达相对量:ASODN 10,20 μmol/L组低于空白对照组(0.73±0.36,0.61±0.23,1.16±0.43,P<0.01)。④Ⅰ型胶原mRNA/Ⅲ型胶原mRNA:空白对照组为4.50±0.12,ASODN 5,10,20 μmol/L组均低于空白对照组(2.40±0.11,2.00±0.06,1.50±0.07,P<0.05,0.01),ASODN 20 μmol/L组低于ASODN 5,10μmol/L组(P<0.01)。⑤胶原合成分泌量:ASODN 10,20 μmol/L组低于空白对照组(P<0.01)。ASODN 20 μmol/L组低于ASODN 5 μmol/L组(P<0.01)。结论:圆盘状受体-ASODN能明显抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞中圆盘状受体表达,显著抑制Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA表达,调整Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原比例,并抑制胶原合成和分泌。     

心肌梗死大鼠TGF-βl与工型胶原变化的研究

目的 研究大鼠心肌梗死后心肌转化生长因子βl（TGF-βl）与I型胶原表达，并测定大鼠血浆内TGF-βl的含量。方法 结扎冠状动脉建立大鼠心肌梗死模型，采用ELISA法测定心肌梗死不同时间内大鼠血浆内TGF-βl的含量；应用免疫荧光染色的方法，通过激光扫描共聚焦显微镜观察TCF-β与I型胶原表达的变化。结果 大鼠心梗后1 d、3 d、,5 d血浆内TGF-βl含量明显增加（P〈O．01），呈时间依赖性。心梗后24h心肌TGF-βl与I型胶原表达与假手术组相比明显增强。结论 心梗后心肌通过增加TGF-βl、I型胶原的表达参与心室重构。