携带BARF1基因的重组巨细胞病毒的构建

目的 依据细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome,BAC)能够克隆大段DNA病毒的特点,通过galk为基础的同源重组,将EB病毒编码BARF1基因插入巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV),构建重组病毒。方法 PCR扩增带有巨细胞病毒UL57基因左右同源臂的galk及BARF1基因片段,经过电转化,进行同源重组,经含有galk培养基及脱galk培养基筛选,获得带有BARF1的巨细胞病毒细菌人工染色体克隆,提取质粒,转染到ARPE-19细胞,观察带有BARF1基因的巨细胞病毒对ARPE-19细胞的影响。结果 感染带有BARF1基因的巨细胞病毒的ARPE-19细胞形态由原来的长梭形变为变圆、肿胀、胞浆颗粒增多,并且细胞生长失去接触抑制,出现重叠生长现象。结论 建立了携带BARF1基因的重组巨细胞病毒;同时表明利用细菌人工染色体,可方便地对病毒基因组进行准确操作。     

表达绿色荧光蛋白的单核细胞增生李斯特菌重组菌株的构建及其生物学特性

目的为了对单核细胞增生李斯特菌运送外源抗原所诱导免疫应答特性进行评价,开展了以原核方式运送模式蛋白GFP的研究。方法利用SOEing PCR的方法把LLO的启动子与GFP融合在一起,通过同源重组的方式整合到yzuLM1-2actA和plcB基因片段之后,在LLO启动子的作用下实现GFP的表达。结果PCR扩增证实目的基因gfp融合到李斯特菌基基因组中,重组菌对小鼠的LD50为4.31×108,毒力比yzuLM1-2显著降低。以重组菌株免疫小鼠后获得的血清进行Western blot显示在27kD处出现特异印迹带;ELISA测定结果显示能诱导小鼠产生较高的抗GFP的抗体水平。结论研究结果表明减毒LM所运送的GFP能诱导小鼠产生较强的免疫应答的特性,这为减毒株yzuLM1-2运送外源保护性抗原的研究奠定了基础,也为开展减毒重组菌与抗原递呈细胞之间的相互作用及其诱导的免疫应答分析提供了必要条件。     

携带增强绿色荧光蛋白基因的TSLC1真核表达载体构建及鉴定

目的构建携带增强绿色荧光蛋白基因的TSLC1真核表达载体,为研究其抗肿瘤功能奠定基础。方法提取基因组RNA,利用特异性引物进行RT-PCR反应,扩增全长TSLC1基因片段,与真核表达载体pReceiver-M29载体进行连接,并转化到大肠杆菌JM109中扩增,以获得重组载体,应用酶切、PCR及测序鉴定此重组载体。结果RT-PCR获得约1 329 bp大小的特异性TSLC1基因片段;测序鉴定证实,TSLC1基因片段正确插入真核表达载体pReceiver-M29中。结论成功构建了真核表达载体pReceiver-M29-TSLC1。     

增强型绿色荧光蛋白真核表达载体的构建和表达

目的 构建增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP)编码基因的真核表达载体pcDNA3．1( )-GFP，并观察其在Hep2细胞中的表达情况。方法据已知的EGFP基因序列，设计合成1对引物，并引入HindⅢ和EcoR V酶切位点。应用PCR技术，从含有EGFP的pAdTrack-CMV中扩增EGFP编码基因。通过TA连接将其克隆人pGEM-T easy载体，经PCR及限制性内切酶鉴定后，插入真核表达质粒pcDNA3．1( )中，转化Escherichia coli DH50感受态细胞，于Amp^ LB平板上筛选阳性克隆。重组子经HindⅢ和EcoR V双酶切、PCR鉴定，将该载体转染入喉癌细胞Hep-2后48h观察EGFP表达情况。结果 成功构建了含EGFP编码基因的真核表达载体pcDNA3．1( )GFP，并成功转染Hep2细胞，在倒置荧光显微镜下呈现绿色光。结论 获得可产生绿色荧光的EG-FP，能方便地用作报告基因和筛选标记。     

绿色荧光蛋白-CCNG2表达载体的构建及鉴定

目的为进一步探讨细胞周期蛋白G2（CCNG2）基因功能奠定基础。方法以成人脑cDNA文库为模板,PCR扩增人CCNG2基因,In-Fusion技术定向克隆到pENTR1A中,酶切测序鉴定后重组到pcDNA6.2TM/EmG-FP-DEST Gateway载体,构建pcDNA6.2-EmGFP-G2。将鉴定正确的质粒瞬时转染人舌鳞癌细胞Tca-8113,24 h后观察,定量PCR检测CCNG2 mRNA表达。结果扩增得到1 032 bp的基因片段,经测序验证与GenBank中人CCNG2序列相符;pcDNA6.2-EmGFP-G2经酶切和测序鉴定无误。转染Tca-8113后,荧光信号除在胞质中表达外,在部分细胞的胞核DAPI染色弱信号区浓聚。转染该重组质粒后CCNG2 mRNA表达水平显著增高。结论成功构建了以绿色荧光蛋白作为报告基因的CCNG2表达载体,为进一步研究CCNG2基因功能奠定了基础。     

稳定表达绿色荧光蛋白基因胃癌细胞株的构建

目的建立稳定表达绿色荧光蛋白（GFP）的胃癌细胞株。方法将携带GFPcDNA的质粒载体转染至胃癌细胞株SGC-7901内，经过C-418筛选和克隆化培养，用荧光显微镜检测癌细胞荧光表达情况。结果转染GF-PcDNA的胃癌细胞用G418筛选及克隆化培养后，再经150d（50代）培养，96％高表达GFP。将SGC-7901-GFP细胞株接种于裸鼠皮下，成瘤良好。结论成功建立了稳定表达GFP的胃癌细胞株SCC-7901-GFP。     

增强型绿色荧光蛋白真核表达载体的构建和表达

目的　构建增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)编码基因的真核表达载体 pcDNA3.1(+) GFP,并观察其在Hep 2细胞中的表达情况。　方法　据已知的EGFP基因序列,设计合成 1 对引物,并引入Hind Ⅲ和EcoR Ⅴ酶切位点。应用PCR技术,从含有 EGFP的 pAdTrack CMV中扩增 EGFP编码基因。通过 TA连接将其克隆入pGEM T easy载体,经PCR及限制性内切酶鉴定后,插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,转化Esche richia coli DH5α感受态细胞,于Amp+ LB平板上筛选阳性克隆。重组子经 Hind Ⅲ和EcoRⅤ双酶切、PCR鉴定,将该载体转染人喉癌细胞 Hep 2 后 48 h观察 EGFP表达情况。　结果　成功构建了含 EGFP 编码基因的真核表达载体pcDNA3.1(+) GFP,并成功转染Hep 2细胞,在倒置荧光显微镜下呈现绿色光。　结论　获得可产生绿色荧光的 EG FP,能方便地用作报告基因和筛选标记。     

人肝细胞生长因子基因腺病毒重组体的构建及转染血管平滑肌细胞的表达

为探讨构建能表达肝细胞生长因子基因的腺病毒重组体的方法，以及这种腺病毒重组体能否在血管平滑肌细胞表达。将含有肝细胞生长因子基因片段的质粒用限制内切酶酶切，以琼脂糖凝胶电泳回收得到目的基因片段：将它用DNA连接酶插入至腺病毒穿梭质粒中，并用限制内切酶鉴别插入方向，得到插入方向正确的重组腺病毒穿梭质粒。用限制内切酶酶切重组腺病毒穿梭质粒和表达载体，使它们线性化；以电转化方法使它们共转化至BJ5183细胞中进行同源重组，构成肝细胞生长因子基因腺病毒重组体。以脂质体为转染介质，将肝细胞生长因子基因腺病毒重组体转染到人胚肾细胞中进行包装，使病毒复性具有感染能力。用包装后的肝细胞生长因子基因腺病毒重组体感染体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞；经逆转录一聚合酶链反应和蛋白印迹检测发现肝细胞生长因子呈现过表达。此外，酶切及测序发现重组腺病毒穿梭质粒和肝细胞生长因子基因腺病毒重组体是正确的；绿色荧光蛋白标记对重组体在人胚肾细胞中的包装及包装后感染大鼠主动脉平滑肌细胞进行了荧光示踪。结果提示，肝细胞生长因子基因腺病毒重组体构建成功，为血管疾病转基因治疗奠定了基础，具有一定临床价值，     

稳定高表达增强型绿色荧光蛋白基因膀胱癌细胞株的构建

目的 建立稳定高表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的膀胱癌细胞株(KU-7/EGFP)并观察其生物特性的变化.方法 利用脂质体将EGFP真核表达质粒(pEGFP-N3)转染至人膀胱癌细胞株KU-7,经过G418筛选和克隆化培养,荧光显微镜及流式细胞仪观察转染EGFP基因的KU-7在裸鼠体内外的表达情况,分析转染细胞生物学行为变化.结果 KU-7/EGFP在荧光显微镜下发出绿色荧光,能稳定、高效和持久地表达EGFP,与未转染细胞比较,其生物学特性未改变.KU-7/EGFP接种于裸鼠皮下5 d后成瘤,14 d后肿瘤直径达到15 mm.结论 成功建立了稳定高表达EGFP的膀胱癌细胞株KU-7-EGFP,其生物学特性未变.     

食管癌点突变型DNA聚合酶β与绿色荧光蛋白重组表达载体的构建

目的构建携带食管癌点突变型DNA聚合酶β基因的重组真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-polβ.方法运用PCR方法,从质粒pcDNA3.1-polβ中扩增出点突变型的DNA聚合酶β基因,作为目的片段,T-A克隆至pGEM-TEasy载体,再定向克隆至pEGFP-C3真核绿色荧光蛋白表达载体,重组质粒pEGFP-C3-polβ用限制性内切酶酶切和通用鉴定引物PCR扩增鉴定,并进行DNA序列分析.结果 DNA序列分析证实了重组载体中的DNA聚合酶β序列与已知的点突变型DNA聚合酶β基因序列相符.结论成功构建了携带食管癌点突变型DNA聚合酶β基因的重组的荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-polβ,为DNA聚合酶β基因的体内外表达及蛋白定位提供了理想的标记.     

猪带绦虫重组BCG-TSOL18疫苗构建及其表达

目的 构建猪带绦虫重组BCG-TSOL18疫苗,研究TSOL18基因在BCG中的表达情况。方法 通过酶切的方法 从重组质粒pGEX-TSOL18获取猪带绦虫TSOL18基因,将其定向克隆到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMV261中,构建猪带绦虫重组质粒pMV261-TSOL18,进行酶切、PCR和测序鉴定;再将其电穿孔转化入BCG,构建猪带绦虫重组BCG-TSOL18疫苗,进行PCR鉴定;SDS-PAGE和Western blot分析TSOL18基因在BCG中的表达情况。结果 通过酶切成功获得了393 bp的TSOL18基因片段;酶切、PCR和测序鉴定证明成功构建了猪带绦虫重组质粒pMV261-TSOL18;PCR鉴定证实猪带绦虫重组质粒pMV261-TSOL18成功转入BCG中,提示猪带绦虫重组BCG-TSOL18疫苗构建成功;SDS-PAGE分析发现在相对分子质量(Mr)约为14.7 kD处有明显的TSOL18目的蛋白条带,Western blot证实表达的TSOL18目的蛋白能被兔抗血清和囊虫病猪血清所识别。结论 成功构建了猪带绦虫重组BCG-TSOL18疫苗,TSOL18基因能够在BCG中成功表达,表达的TSOL18重组蛋白具有特异的抗原性,为该疫苗的进一步研究奠定了基础。     

小鼠IL-4真核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠白介素-4(murine interleukin-4,mIL-4)的真核表达载体,并研究其在293T细胞中的表达。方法 RT-PCR扩增小鼠IL-4基因后,克隆到真核表达载体pcDNA3.0上,利用电泳和测序鉴定重组质粒的大小、序列。脂质体转染法将重组质粒pcDNA3.0-mIL-4转入293T细胞中,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测其表达。结果经酶切和测序鉴定重组质粒pcDNA3.0-mIL-4构建成功,并在293T细胞中成功表达。结论 pcDNA3.0-mIL-4可在真核细胞中成功表达,为进一步研究其在炎症性肠病(IBD)动物模型中的生物学功能提供了条件。     

应用pAdEasy-1系统构建表达狂犬病毒核蛋白的重组腺病毒

目的应用pAdEasy-1系统,将分离自我国的狂犬病毒CTN株N基因重组入人5型腺病毒基因组的E1区,成功获得了表达狂犬病毒核蛋白的复制缺陷型重组腺病毒。为使核蛋白得到高效表达,在构建时,将N基因控制在CMV早期启动子和SV40poly(A)加尾信号下,并对其翻译调控区进行了改造,在其第一个密码子前加入了哺乳动物典型的Kozak序列基本功能单位ACG,在N基因终止密码子的3’端另加了一个终止密码子。Western Blotting方法证实该重组腺病毒能正确表达产生核蛋白。重组腺病毒在细胞上遗传稳定性分析表明N基因能稳定存在于腺病毒基因组而不被切除。     

携抗菌肽PR39基因重组腺病毒的构建及抗胞内伤寒菌研究

目的构建抗菌肽PR39基因腺病毒表达载体,观察其在小鼠巨噬细胞RAW264.7中的表达及抗菌活性。方法PCR扩增抗菌肽PR39成熟肽基因,插入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,经PmeI线性化后与腺病毒骨架(pAdEasy-1)共转化大肠杆菌BJ5183,通过细菌内同源重组产生重组腺病毒载体(pAd-PR39)。重组腺病毒载体经PacI线性化后转染293细胞,包装出重组腺病毒(Ad-PR39)。利用重组腺病毒感染体外培养的小鼠巨噬细胞RAW264.7,采用RT-PCR和免疫细胞化学检测目的基因的表达,并对其抗菌活性进行初步检测。结果先后构建了携抗菌肽PR39基因的穿梭载体和重组病毒载体,包装出重组腺病毒,并成功感染小鼠巨噬细胞RAW264.7。感染重组腺病毒的小鼠巨噬细胞RAW264.7能有效表达抗菌肽PR39。与对照(10.8±2.1CFU/cell)相比,感染重组腺病毒的小鼠巨噬细胞RAW264.7具有更强的杀灭胞内伤寒菌的能力(7.2±1.8CFU/cell)。结论构建的重组腺病毒能够感染小鼠巨噬细胞RAW264.7并发挥抗菌作用,为抗菌肽PR39在胞内菌感染基因治疗中的应用奠定了实验基础。     

含Apoptin基因重组腺病毒的构建及鉴定

目的:构建携凋亡素(Apoptin)基因重组腺病毒,为进一步研究Apoptin基因抗肿瘤作用分子机制建立基础.方法:利用BamH Ⅰ和Spe Ⅰ双酶切质粒pVAXl Apoptin,获得Apoptin片段并连接入pacAd5 CMV K-N pA,构建含Apoptin基因的穿梭质粒pacAd5-Apoptin.利用尸盘Pac Ⅰ单酶切对pacAd5-Apoptin和腺病毒基因组质粒(pAd5)进行线性化处理后应用脂质体介导法共转染AAV-293细胞,分别利用蚀斑纯化和RT-PCR、Westem blot等方法对重组病毒进行筛选和鉴定,并测定所获得重组病毒的滴度.结果:所构建重组腺病毒中的Apoptin基因得到了正确转录,表达产物的相对分子质量约为13 kDa,与CVA阳性对照一致;所获得重组腺病毒可有效表达Apoptin蛋白,该蛋白与CAV阳性血清具有反应原性,重组病毒滴度为1011PFU/L.结论:成功构建含Apoptin基因的重组腺病毒,所获得重组病毒的滴度可以满足体内外实验要求.     

牛分枝杆菌ESAT-6-CFP-10融合基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的构建表达牛分枝杆菌的ESAT-6-CFP-10融合基因的重组腺病毒载体,为研制能有效防治牛结核病的重组腺病毒活载体疫苗打下基础。方法以牛分枝杆菌ValleeⅢ株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得ESAT-6和CFP-10两个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术(SOE)将ESAT-6和CFP-10基因通过(G1y4Ser)3接头连接,得到融合基因。将融合基因T/A克隆后,亚克隆至腺病毒转移载体pShuttle-CMV中,构建重组穿梭质粒pShuttle-CMV-ESAT-6-CFP-10,限制性内切酶消化、菌液PCR、序列分析验证无误后,PmeⅠ酶切,转化含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的BJ5183-AD-1感受态细胞,经同源重组获得复制缺陷型重组腺病毒载体pAd-CMV-ESAT-6-CFP-10。PacI酶切线性化的重组质粒pAd-CMV-ES-AT-6-CFP-10转染AD-293细胞进行病毒包装和扩增。PCR、Western blot检测包装病毒的融合基因及其表达情况。结果成功构建携带牛分枝杆菌的ESAT-6-CFP-10融合基因的重组腺病毒载体,包装病毒用PCR、Western blot检测到包装病毒的融合基因及其表达。结论本研究成功地构建携带牛分枝杆菌的ESAT-6-CFP-10融合基因的重组腺病毒,为下一步在动物体内进行免疫效果研究打下基础。     

细胞色素P450 3A4及谷胱甘肽S转移酶A1重组质粒的构建及表达

目的构建重组质粒pBudCE4.1-细胞色素P450 3A4(CYP3A4)-谷胱甘肽S转移酶A1(GSTA1),使CYP3A4和GSTA1可在真核细胞C3A中表达,并且增加其表达量。方法从含有GSTA1和CYP3A4的开放阅读框(ORF)克隆中扩增GSTA1和CYP3A4基因;将片段GSTA1以及载体pBuDCE4.1双酶切后连接并转化,质粒命名为pBuDCE4.1-GSTA1;将片段CYP3A4以及质粒pBuDCE4.1-GSTA1双酶切后连接并转化,所得重组质粒命名为pBudCE4.1-CYP3A4-GSTA1;测序验证重组克隆中目的基因片段的序列信息;构建稳定细胞系,测定CYP3A4活性及GSTA1的表达情况。结果酶切及测序验证双表达重组质粒pBudCE4.1-CYP3A4-GSTA1构建成功,CYP3A4及GSTA1在转染细胞系中的表达量增多。结论构建成的双表达重组质粒pBudCE4.1-CYP3A4-GSTA1符合应用要求。     

猪囊尾蚴特异性抗原cC1重组耻垢分枝杆菌疫苗的构建与鉴定

目的 目的 构建表达猪囊尾蚴cC1抗原的重组耻垢分枝杆菌疫苗。方法 方法 提取pET28a?cC1质粒DNA, 用xho I和 BamH I双酶切, 用Klenow酶补平xho I酶切末端, 同时提取pMV261穿梭质粒载体, 用Hind III和BamH I双酶切, 用Klenow 酶补平Hind III酶切末端, 纯化后的酶切产物通过T4连接酶连接, 构建pMV261?cC1穿梭质粒, 测序验证正确后, 将 pMV261cC1穿梭质粒经电穿孔法转化耻垢分枝杆菌, 构建重组耻垢分枝杆菌, 经热诱导后, 以猪囊尾蚴病患者血清为一抗 进行Western?blotting鉴定。此外, 比较正常耻垢分枝杆菌和重组cC1耻垢分枝杆菌生长状态并绘制生长曲线。结果 结果 构 建的重组穿梭载体经酶切、 测序验证正确。构建的重组耻垢分枝杆菌经热诱导后, SDS?PAGE电泳分析显示, 在40 kDa处 有外源性蛋白表达, 与预期值相符。Western?blotting显示其可被猪囊尾蚴病患者血清识别, 表明cC1抗原基因在耻垢分枝 杆菌中表达成功。重组耻垢分枝杆菌与正常耻垢分枝杆菌的增殖特性无明显差异。结论 结论 成功构建了表达猪囊尾蚴特 异性抗原cC1的重组耻垢分枝杆菌疫苗。     

Construction and identification of a recombinant adenovirus expressing bioactive GM-CSF: Implication for GM-CSF secreting tumor vaccines design

IntroductionGranulocyte-monocyte colony stimulating factor (GM-CSF) has been reported to to mediate antitumor effects through stimulation of various antigen presentation cells. Clearly, these properties make GM-CSF a potent adjuvant. Therefore, an oncolytic adenovirus coding for GMCSF was engineered.ObjectiveContraction, identification and characterization of recombinant adenovirus encoding GM-CSF.MethodsIn this study, a recombinant adenovirus expressing GM-CSF (rAd-GM) was constructed and characterized. Homologous recombination in bacteria followed by transfection of recombinant plasmid into a mammalian packaging cell line, viral production was conveniently followed by the gene incorporated into the viral backbone.Results & DiscussionWe also showed that the construct produced a 12 kDa recombinant protein which stimulated colony formation in bone marrow cells in vitro, indicating that the recombinant GM-CSF was biologically active.ConclusionFuture work will demonstrate the rAd-GM mediated antitumor immunity in rats with experimentally induced breast cancer.