库普弗细胞内毒素耐受时白细胞介素-1受体相关激酶-4的表达变化

目的观察库普弗细胞（KCs）内毒素耐受形成后白细胞介素-1受体相关激酶4（IRAK-4）表达的变化，探讨KCs内毒素耐受形成的相关机制。方法分离培养Balb／c小鼠KCs，分为非内毒素耐受组与内毒素耐受组[给予脂多糖（LPS）10ng／ml预处理24h]。用LPS100ng／ml刺激后，蛋白免疫印迹法及逆转录聚合酶链反应法测定两组细胞IRAK-4蛋白及mRNA的表达水平；酶联免疫吸附法检测两组细胞核因子-κB（NF-κB）活性及培养上清液肿瘤坏死因子α（TNFα）含量。结果LPS刺激在两组细胞均引起IRAK-4 mRNA表达及NF-κB活性增强、TNFα释放增加，但内毒素耐受组3种指标的高峰值明显低于非内毒素耐受组（t值分别为l2．4、l7．4、l38．9，P值均〈0．01）。结论LPS预处理可诱导KCs形成内毒素耐受状态，IRAK4表达受到抑制可能是KCs内毒素耐受形成的机制之一。     

白细胞介素-1受体相关激酶1在脂多糖诱导的足细胞损伤中的作用及其机制

目的 探讨白细胞介素(IL)-1受体相关激酶1(IRAK1)在脂多糖(LPS)诱导的足细胞损伤中的作用及其机制。方法 将体外培养的永生化人足细胞分为5组：正常对照组(control组)、LPS组、LPS+空载转染组(LPS+si-NC组)、LPS+IRAK1干扰质粒转染组(LPS+si-IRAK1组)、LPS+肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)干扰质粒转染组(LPS+si-TRAF6组)。采用蛋白质免疫印迹法(Western Blot)及实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测5组足细胞IRAK1和TRAF6蛋白及其mRNA的相对表达水平;采用免疫荧光检测5组足细胞紧密连接蛋白(ZO)-1、结蛋白(Desmin)的定位及相对表达水平;采用Western Blot检测5组足细胞IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、人核因子(NF)-κB抑制蛋白(IKB)α、NF-κB(p65)、磷酸化NF-κB(p-p65)蛋白的相对表达水平;采用免疫共沉淀(Co-IP)实验检测IRAK1和TRAF6结合情况。结果 LPS组足细胞IRAK1、TRAF6蛋白及mRNA相对表达水平...     

白细胞介素-1受体拮抗剂与脑缺血

白细胞介素 1受体拮抗剂 (IL 1Ra)是白细胞介素 1(IL 1)的一种内源性拮抗剂。IL 1Ra可阻断IL 1的所有生物学作用 ,而无任何激动剂效应。文章对IL 1Ra的结构特点、生物学活性、IL 1Ra的结合受体及IL 1Ra在脑缺血中的保护作用等进行了综述。了解IL 1Ra在脑缺血中的保护作用 ,应用IL 1Ra或IL 1Ra转基因治疗将为脑缺血的治疗提供一条新的途径。     

白细胞介素-1受体拮抗剂与脑缺血（综述）

白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)是白细胞介素-1(IL-1)的一种内源性拮抗剂.IL-1Ra可阻断IL-1的所有生物学作用,而无任何激动剂效应.文章对IL-1Ra的结构特点、生物学活性、IL-1Ra的结合受体及IL-1Ra在脑缺血中的保护作用等进行了综述.了解IL-1Ra在脑缺血中的保护作用,应用IL-1Ra或IL-1Ra转基因治疗将为脑缺血的治疗提供一条新的途径.     

IRAK-M短发夹RNA对RAW264.7细胞内毒素耐受性的抑制作用

目的:观察白介素-1受体相关激酶-M(IRAK-M)基因沉寂后RAW264.7细胞内毒素耐受性的改变, 进而探讨IRAK-M在内毒素耐受形成中的作用.方法:构建表达IRAK-M短发夹RNA(shRNA)的阳性重组质粒(pshIRAK-M-A)和阴性重组质粒(pshIRAK-M-B), 转染RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞系)细胞; 各组细胞经10 μg/L脂多糖(LPS)预处理24 h后(或直接)用100 μg/LLPS刺激; 3 h后, 酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养液中TNF-α水平, 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞中的TNF-α mRNA表达水平, 蛋白印迹法(Western blotting)检测细胞中IRAK-M蛋白的表达, 凝胶电迁移率分析法(EMSA)检测细胞中NF-κB的活性.结果:pshIRAK-M-A对IRAK-M蛋白表达抑制率为83%左右, pshIRAK-M-B对IRAK-M蛋白表达无明显抑制作用; 两种转染细胞在用100 μg/L LPS直接刺激后, 其培养液中TNF-α水平、细胞内TNF-α mRNA表达及NF-κB活性无显著性差异; 两种转染细胞对L P S的再次应答均明显弱于初次应答细胞( P<0.05), 但pshIRAK-M-A转染组细胞对LPS的再次应答明显强于pshIRAK-M-B转染组细胞( P<0.05).结论:IRAK-M表达受抑导致细胞内毒素耐受性减弱, IRAK-M在内毒素耐受形成中起重要作用.     

人白细胞介素-1受体拮抗剂或白细胞介素-10逆转录病毒载体的构建与体外实验

目的 构建携带人白细胞介素-1受体拮抗剂(hIL-1Ra)或人白细胞介素-10(hIL-10)基因的重组逆转录病毒(rRv)，体外转染免滑膜成纤维样细胞，检测目的基因的表达水平与持续时间。方法 提取人外周血单个核细胞总RNA，反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增目的基因；酶切、连接目的基因与逆转录病毒载体pLXSN，筛出阳性克隆，经GP2-293细胞包装，收集病毒并鉴定；rRV-hlL-1Ra、rRV-hlI-10分别体外转染兔滑膜成纤维样细胞，RT-PcR测定目的基因mRNA表达水平与时间的关系。免疫组织化学与免疫印迹测定蛋白水平的表达与持续时间。结果 成功构建了携带hIL-1Ra或hIL-10基因的重组逆转录病毒，rRv-hIL-1Ra与rRV-hIL-10均能有效转染体外培养的兔滑膜成纤维样细胞，RT-PcR测定目的基因mRNA高峰均出现于转染后第5天左右。免疫组织化学和免疫印迹均检测到hIL-lRa、hlL-10的表达。经G418筛选后的细胞中，hIL-1Ra的表达在转染后第30天内达高峰，至少持续60d：hIL-10的表达至少持续40d。结论 以重组逆转录病毒为载体可以成功地将hIL-lRa或hIL-10基因导人体外培养的兔滑膜成纤维样细胞并实现稳定表达。     

溃疡性结肠炎的白细胞介素(IL)-1β、IL-1受体拮抗剂、IL-4基因多态性

目的研究溃疡性结肠炎(UC)病人的白细胞介素(IL)-1β、IL-1受体拮抗剂(IL-1RA)、IL-4基因多态性,并分析其与抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)及临床分型的关系.方法用PCR-限制性片段长度多态性方法和序列特异性引物-PCR方法分别对81例UC病人和114例健康者进行IL-1β和IL-1RA、IL-4基因多态性分析.结果 UC组IL-4 的RP2基因频率明显高于对照组(29.0% 对11.8%,P=0.000 02),而对照组RP1基因频率明显高于UC组(88.2% 对71.0%,P=0.000 02),UC组RP1.2、RP2.2基因型的优势比值分别为2.71 (95%CI, 1.39～5.31),9.04 (95%CI, 1.05～203.29);2组IL-1β、IL-1RA各基因频率比较差异均无显著性 (P＞0.05);ANCA(+)组和ANCA(-)组UC病人IL-4的 RP1、RP2基因频率显著不同,差异有显著性 (P值均<0.05).结论中国汉族UC病人与IL-4内含子3的基因多态性相关联,UC病人IL-4 RP1基因频率明显降低,而RP2基因频率明显增加,与正常人的差异发生在 ANCA(+) UC病人;中国汉族UC病人与IL-1β、IL-1RA基因多态性无关联.     

白细胞介素-1及白细胞介素-1受体拮抗剂与经皮腔内血管成形术后再狭窄的关系

炎性反应是经皮腔内血管成形术后再狭窄的主要发病机制之一。炎性反应通过刺激内膜增生在支架置入术后再狭窄的过程中发挥重要作用。支架置入术后局部和系统炎性反应的强度和持续时间直接与患者的预后有关。白细胞介素（IL）-1在其发病过程中发挥了重要作用,而作为IL-1特异性的天然拮抗物IL-1受体拮抗剂（IL-1Ra）也越来越受到广泛的重视。本文就IL-1和IL-1Ra与再狭窄的关系作一综述。     

白细胞介素-1α基因启动子-889C/T和白细胞1受体拮抗剂第2内含子VNTR基因多态性与脑梗死关系的研究

目的研究白细胞介素1α(IL1α)基因启动子889C/T多态性和白细胞介素1受体拮抗剂(IL1Ra)第2内含子可变数目串联重复(VNTR)多态性及血清水平与脑梗死的关系。方法采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCRRFLP)技术,检测155例脑梗死患者和170例健康对照者的IL1α(889C/T)和IL1Ra(VNTR)基因型,同时采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测脑梗死患者和对照者的血清IL1水平。结果脑梗死组血清IL1水平显著高于对照组(P<001),IL1α基因889C/T基因型频率和等位基因频率在脑梗死组和对照组比较差异有显著性(P<005),等位基因频率的相对风险分析发现,T等位基因携带者患脑梗死的风险是C等位基因的2029倍(OR=2029,95%CI1207~3410);IL1Ra基因型频率和等位基因频率在脑梗死组和对照组比较差异有显著性(P<005),与健康对照组比较,不携带IL1RaⅡ的基因型患脑梗死的相对风险度增加1853倍(OR=1853,95%CI1010~3398),携带IL1RaⅡ的基因型的脑梗死患者血清IL1Ra水平显著高于不携带者〔(142532±32392)pg/ml,(129634±29236)pg/ml,P<001〕。结论IL1α(889C/T)和IL1Ra(VNTR)基因多态性与脑梗死的发病具有相关性,其中T等位基因可能是脑梗死发病的遗传易感基因;携带IL1RaⅡ基因的个体可能通过促进IL1Ra的高度表达而对脑梗死具有保护作用     

构建shRNA真核表达质粒抑制CXCR4对人食管癌细胞Eca-109迁移的影响

目的 构建人CXCR4 mRNA的shRNA真核表达载体质粒,特异性抑制人食管癌细胞CXCR4的表达,并筛选抑制效果理想的质粒,研究对食管癌细胞迁移的影响.方法 以人CXCR4 mRNA编码区中3条不同序列作为RNA干扰靶点,分别构建3个shRNA真核表达载体质粒GYJ-1、GYJ-2、GYJ-3,并进行测序.用脂质体转染人食管癌细胞株Eca109,实时定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测mRNA水平.应用细胞划痕试验研究干扰质粒对食管癌细胞迁移的影响.结果 GYJ-1呈高效特异地抑制人CXCR4的表达;而GYJ-2及GYJ-3抑制效果较GYJ-1差.GYJ-1显著抑制食管癌细胞的迁移.结论 通过构建CXCR4的shRNA真核表达载体导入食管癌细胞,可有效抑制人食管癌细胞中CXCR4的表达,并影响食管癌细胞的迁移.     

CXCR4-shRNA重组腺病毒表达载体的构建及鉴定

目的选择性构建CXC趋化因子受体4（CXCR4）的特异RNA干扰载体。方法在GenBank中获取CXCR4基因的核苷酸序列,设计并合成3条短发夹RNA（shRNA）的DNA序列,并克隆到PL—Dest腺病毒骨架载体（shpAd／PL—Dest）中,组成人趋化因子受体重组腺病毒基因沉默子（shpAd—hCXCR4-eGFP）,采用酶切、PCR和DNA测序方法验证。将验证后3种沉默子经酶切后转染至HEK293A细胞包装病毒,得到CXCR4的腺病毒表达载体。结果构建的shRNA—Ad—hCXCR4-eGFP3种基因沉默子序列正确并成功克隆到腺病毒表达载体上。结论成功构建CXCR4-shRNA腺病毒表达载体。     

肝X受体-α对炎症的调节及其对神经元孤核受体-1的影响

目的 探讨肝X受体-α(LXR α)抑制小鼠枯否细胞(KCs),炎症反应途径与神经元孤核受体(NOR-1)的关系.方法 雄性昆明小鼠用密度梯度离心法分离培养KCs,获得的细胞随机分为对照组、脂多糖(LPS)处理组、LPS+T0901317共处理组.逆转录聚合酶链反应、细胞免疫荧光及Western blot法检测各组细胞LXR α和NOR-1及其蛋白表达水平,酶联免疫吸附法检测KCs培养上清液肿瘤坏死因子α和白细胞介素10含量.采用SPSS17.0统计软件分析,3组比较采用多个独立样本Kruskal-Wallis检验,组间两两比较采用Mann-Whitney U检验.结果 LXRα mRNA:对照组为0.426±0.034、LPS处理组为0.279±0.019、共处理组为0.748±0.072.对其进行多个独立样本Kruskal-Wsllis检验,Χ2=7.200,渐进的双尾P值=0.027,差异有统计学意义.NOR-1 mRNA:对照组为0.991±0.051,LPS处理组为0.722±0.061,共处理组为2.726±0.065.对其进行多个独立样本Kruskal Wsllis检验,χ2=12.500,渐进的双尾P值=0.002,差异有统计学意义.LXR α蛋白表达量对照组为1.040±0.113,LPS处理组为0.519±0.077,共处理组为1.217±0.133.对其进行多个独立样本Kruskal-Wsllis检验,χ2=13.661,渐进的双尾P值=0.001,差异有统计学意义.NOR-1蛋白表达量:对照组为0.560±0.100,LPS处理组为0.355±0.038,共处理组为0.842±0.058.对其进行多个独立样本Kruskal-Wsllis检验,χ2=15.158,渐进的双尾尸值=0.001,差异有统计学意义.肿瘤坏死因子α含量:对照组为(5.88±2.42)ng/L,LPS处理组为(450.89±78.52)ng/L,共处理组为(57.21±15.00)ng/L.多个独立样本Kruskal-Wsllis检验,χ2=12.500,渐进的双尾P值=0.002,差异有统计学意义.白细胞介素10含量:对照组为(10.68±3.48)ng/L,LPS处理组为(61.85±12.41)ng/L,共处理组为(537.41±36.41)ng/L.多个独立样本Kruskal-Wsllis检验,χ2=12.500,渐进的双尾P值=0.002,差异有统计学意义.结论 在KCs,LXR α的表达上调能有效增加NOR-1的mRNA和蛋白表达水平,进而抑制炎症反应.

Abstract：

Objective To investigate the relationship of NOR-1 with the inhibition of inflammatory reaction in mice Kupffer cells (KCs) induced by lipopolysaccharide (LPS) via liver X receptor alpha (LXR alpha). Methods KCs from male KM mice were isolated by density gradient centrifugation, incubated and then randomly assigned to three groups: control group, LPS treated group and LPS+T0901317 treated group. The mRNA and protein expressions of LXR alpha and NOR-1 in each group were determined by RT-PCR, immunofluorescent assay and western blot, respectively. The densities of TNF alpha and IL-10 in supernatants were evaluated by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Results The mRNA and protein expression levels of LXR alpha in LPS + T0901317 group were the highest as compared to the other two groups (0.748 ± 0.072 and 1.217 ± 0.133 respectively), The mRNA and protein expression levels of NOR-1 in LPS+ T0901317 group were the highest as compared to the other two groups (2.726 ± 0.065 and 0.842 ± 0.058 respectively). The densities of supernatant TNF alpha in LPS group and IL-10 in LPS+T0901317 group were the highest [(450.89 + 78.52) ng/L and (537.41 ± 36.41) ng/L respectively]. Conclusions Promoting the expression of LXR alpha in KCs can elevate the NOR-1 expression and then inhibit inflammatory reaction.     

小干扰RNA沉默垂体瘤转化基因1对肝癌细胞增殖和凋亡水平的影响

肝癌是全世界范围的高发恶性肿瘤,在亚洲的发病率、病死率都很高。肝癌的分子学发病机制尚不完全清楚,包括基因结构和功能的缺陷、癌基因的激活、抑癌基因的失活、细胞周期紊乱、染色体的非整倍体出现以及细胞凋亡途径受阻等。垂体瘤转化基因(PTTG)1是细胞周期调节蛋白,能抑制姐妹染色单体分离,导致染色体不稳定,形成非整倍体。在成人大多数正常组织中PTTG1表达较弱,甚至检测不到,而在垂体肿瘤等多种肿瘤细胞中表达明显升高,PTTG1基因可能是一种潜在的抗癌基因治疗靶点[1]。本研究用小干扰RNA (siRNA)降低肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721细胞中PTTG1的表达,检测PTTG1表达下调对肝癌细胞增殖及凋亡的影响,探讨PTTG1对肝癌细胞生物学行为的影响以及作为肝癌治疗靶基因的可能性。     

RNAi沉默Polo-like kinase-1基因表达对胰腺癌细胞增殖的影响

目的:探讨polo-like kinase-1(PLK1)基因在胰腺癌细胞中的作用.方法:采用PLK1小干扰核糖核酸分子(small interfering RNA,siRNA)转染人胰腺癌Mi- aPaCa-2细胞后,分别采用实时定量PCR和Western blot检测PLK1基因mRNA和蛋白表达水平,观察PLK1 siRNA转染对胰腺癌细胞体内外增殖的影响.于转染不同时间后收集细胞,分别采用琼脂糖凝胶电泳和TUNEL方法检测胰腺癌细胞凋亡情况.结果:胰腺癌MiaPaCa-2细胞经siRNA转染处理后,PLK1 mRNA和蛋白表达水平明显下降(P<0.05).PLK1基因siRNA可明显抑制癌细胞体外生长(P<0.05)和体内裸鼠模型增殖(P<0.05).细胞凋亡检测发现,DNA电泳出现明显的梯度图谱,且与浓度相关(r=0.836,P<0.05).TUNEL结果显示,转染组癌细胞凋亡指数明显增加,且呈时间和浓度依赖性(r= 0.875,P<0.05).结论:PLK1 siRNA转染可明显抑制胰腺癌细胞增殖,其机制可能与诱导细胞凋亡有关.     

叶酸脂质体对乳腺癌4T1细胞的体内靶向性研究

目的探讨叶酸脂质体对乳腺癌4T1细胞的体内靶向性,为开展叶酸介导的靶向性抗肿瘤药物的研究奠定基础。方法采用薄膜分散法结合冷冻超声法制备叶酸脂质体,原子力显微镜（AFM）确定叶酸脂质体的粒径大小和表征叶酸脂质体的表面形态结构。采用鼠源4T1细胞建立小鼠原位乳腺癌模型,原位皮下分别注射包封钙黄绿素的叶酸脂质体和脂质体,用荧光显微镜定性观察和荧光定量法测定叶酸脂质体与脂质体对肿瘤细胞的富集量。结果叶酸脂质体富集于原发性和转移性乳腺癌细胞的数量明显高于脂质体（P〈0．05）。结论通过细胞表面叶酸受体的介导作用,叶酸脂质体能明显富集于表达叶酸受体的乳腺癌细胞上,即具有肿瘤靶向性;本研究为开展叶酸介导的靶向性抗肿瘤药物的研究提供了依据。