荧光定量RT-PCR快速检测B型流感病毒的研究

目的:利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测B型流感病毒的方法。方法:根据B型流感病毒HA基因的相对保守序列分别设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立、优化反应体系后,利用10倍稀释法检验方法的灵敏度并建立相对定量标准曲线;特异性检验后利用临床标本与普通RT-PCR法进行比较。结果:B型流感病毒检测反应的灵敏度为5.0×10-6TCID50,标准曲线相关系数为0.998,扩增效率为107.8%,5种非B型流感病毒病原体检测均为阴性,说明此方法具有很好的稳定性、重现性和特异性。结论:本研究建立荧光定量RT-PCR技术可以准确检测B型流感病毒,不仅灵敏度高、稳定性好,而且可以对病毒滴度进行定量检测。     

荧光定量RT-PCR快速检测A型流感病毒

目的利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测A型流感病毒的方法。方法根据A型流感M2基因的相对保守序列分别设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立、优化反应体系后,利用十倍稀释法检验方法的灵敏度并建立相对定量标准曲线并与普通RT-PCR法进行比较;特异性检验后进行临床标本的检验。结果A型流感病毒检测反应的灵敏度为2·56×10-6TCID50,标准曲线相关系数为0·999,扩增效率为108·5%,5种非A型流感病毒病原体检测均为阴性,说明此方法具有很好的稳定性、重现性和特异性。结论本研究建立荧光定量RT-PCR技术可以准确检测A型流感病毒,不仅灵敏度高、稳定性好,而且可以对病毒滴度进行定量检测。     

荧光定量RT-PCR快速检测N_2亚型流感病毒的研究

目的利用荧光定量RT-PCR技术建立快速检测甲型流感病毒N2亚型的方法。方法根据N2亚型流感病毒HA基因的相对保守序列,分别设计一对引物及其相应的Taqman探针,利用一步法RT-PCR试剂盒建立、优化反应体系后,采用十倍稀释法检验建立体系的灵敏度并建立相对定量标准曲线;采用N1亚型毒株核酸进行方法特异性检验并对临床疑似流感样病例样本进行检测。结果N2亚型流感病毒的检测灵敏度为2.56×10-6,扩增效率为99.9%,标准曲线r=0.997,特异性为100%。临床ILI样本检测结果与HAI鉴定结果相符。结论本研究建立的荧光定量RT-PCR技术可以快速、准确的检测N2亚型流感病毒。     

双重荧光定量RT-PCR快速检测N_1、N_2亚型流感病毒的研究

目的利用荧光定量RT-PCR技术建立快速检测流感病毒N1、N2亚型的方法。方法根据N1、N2亚型流感病毒NA基因的相对保守序列,设计两对引物及其相应的Taqman探针,利用一步法RT-PCR试剂盒建立、优化反应体系后,采用十倍稀释体外转录RNA检验建立体系的灵敏度和重复性并建立相对定量标准曲线;利用多种流感病毒和具有相似临床症状的呼吸道病毒检验建立体系的特异性。结果 N1、N2亚型流感病毒的检测灵敏度为10拷贝/μl,扩增效率分别为102.21%和101.78%,标准曲线相关系数大于99%,重复性良好,特异度实验未发现有非特异性扩增。结论双重荧光定量RT-PCR技术可以快速、准确的检测N1、N2亚型流感病毒。     

荧光定量RT-PCR快速检测乙型流感病毒核酸

目的建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RT-PCR方法用于检测乙型流感病毒核酸.方法根据GenBank登录的流感毒株序列,应用生物学软件进行序列比对,在乙型流感病毒核蛋白(NP)基因的保守区设计引物和TaqMan探针进行筛选,对荧光定量RT-PCR反应条件进行优化,检测该方法的特异性和灵敏度.此外还对疑似乙型流感含漱液标本进行检测.结果该方法对乙型流感病毒的检测有高度的特异性,对甲1型、甲3型、禽流感病毒H5、SARS病毒及其他呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.01 TCID50,可从疑似流感患者含漱液中直接检测流感病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右.结论本研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR是一种快速检测乙型流感病毒特异、敏感的新方法.     

实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法与RT-PCR法及细胞培养法检测甲3型流行性感冒病毒的比较

目的比较实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法、RT-PCR法及细胞培养法检测甲3型流行性感冒(流感)病毒的灵敏度与特异性.方法采用建立的实时荧光定量RT-PCR、RT-PCR及经典的狗肾传代细胞病毒分离等3种方法,同时对流感监测点送检的60份疑似流感标本检测甲3型流感病毒.结果细胞病毒分离的阳性数为10份,RT-PCR与实时荧光定量RT-PCR的阳性数分别为12份和15份.实时荧光定量RT-PCR的灵敏度达0.01TCID50且对甲1型流感病毒、乙型流感病毒、禽流感病毒H5、严重急性呼吸道综合征冠状病毒及其它呼吸道病毒均无交叉反应,从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右.结论实时荧光定量RT-PCR由于检测在密封环境中进行,避免了产物与环境间的交叉污染,且是3种方法中最为快速敏感的方法,适用于公共卫生应急疫情的实验室快速诊断.     

应用实时荧光RT-PCR对象山地区婴幼儿副流感病毒感染的监测分析

目的应用实时荧光RT-PCR方法检测副流感病毒1型~3型,初步探讨象山地区儿童感染副流感病毒的状况。方法以副流感病毒的HN基因序列为参考,综合分析Gen Bank上的HN基因序列,使用引物和探针设计软件Primer Express设计特异性引物和Taq Man荧光探针,建立实时荧光RT-PCR方法,用于分别检测副流感病毒1型~3型,并进行灵敏度和特异度检测。结果实时荧光RT-PCR方法具有较好的特异度和灵敏度,与其他常见呼吸道病毒无交叉反应。1 172例标本中实时荧光RT-PCR方法检测阳性为85例(7.25%),HPIV 3型阳性73例(6.23%);检测结果显示2010年第四季度,HPIV感染以HPIV 3型为主,HPIV 1型和HPIV 2型散发存在。应用实时荧光RT-PCR方法还检测到1株HPIV 1型和HPIV 3型的混合感染。结论本研究建立的实时荧光RT-PCR方法具有简便快捷、特异、敏感的特点,适用于临床诊断。HPIV在儿童感染中除了单一型感染外,还存在混合型感染。     

荧光定量PCR法快速检测海南省流感样病例样本的结果与分析

[目的]探讨荧光定量PCR检测方法在海南流感病毒检测中的意义. [方法]随机抽取该省流感监测点流感样病例的咽拭子标本459份和当年1起流感暴发标本共14份,应用荧光定量RT-PCR和常规病毒分离方法进行平行检测. [结果]对于473份流感样病例的咽拭子标本,用荧光定量RT-PCR法检测出阳性结果98份,阳性率20.7%;MDCK细胞培养及病毒分离鉴定出阳性结果46份,阳性率9.7%. [结论]荧光定量RT-PCR方法能在短时间内快速检测流感病毒,并且操作简便、特异性强、灵敏度高.所以荧光定量RT-PCR方法可作为海南省流感样病例的一种快速检测手段,为该省流感疫情的快速检测和疫情处置提供科学的实验室依据.     

荧光定量RT-PCR在快速检测流感病毒A型和B型上的应用研究

[目的]探讨荧光定量RT-PCR在流感病毒快速检测上的意义。[方法]收集疑似流感样本20例,分别用定量RT-PCR技术和鸡胚分离培养方法进行检测。[结果]26份标本中定量RT-PCR检测阳性率为57.7%（15/26）,鸡胚分离培养检测的阳性率为26.9%（7/26）。两者的阳性率有统计学差异。[结论]荧光定量RT-PCR方法在检测流感病毒方面具有快速、操作方便、特异性强、灵敏度高优点。因此可以作为一种快速流感病毒检测的诊断方法。     

荧光定量RT-PCR技术在副流感病毒检测中的应用研究

目的:建立人副流感病毒的荧光定量RT-PCR快速检测方法。方法:根据GeneBank数据库中已有的人副流感毒株的HN基因核苷酸序列,用DNASTAR生物软件进行同源性分析比较,选出高度保守且特异的核苷酸区域,用Primer express5.0软件设计人副流感病毒的引物和TaqMan核苷酸探针。建立PCR反应体系,并优化反应条件。结果:建立了具有高度灵敏度和特异度的人副流感病毒的荧光定量PCR快速检测方法。结论:本研究建立实时荧光定量PCR检测方法可以快速的检测人副流感病毒,可以用于临床的早期诊断。