人肝癌细胞系7721与原代人胎肝细胞用于体外培养HCV的对比研究

目的 研究丙型肝炎病毒（HCV）在体外培养原代人胎肝细胞和人肝癌细胞系7721中复制和表达的异同,探讨HCV体外培养条件。方法 原代人胎肝细胞系7721分别与HCV感染血清共孵育后,用逆转录-聚合酶链反应、原位杂交、免疫组化检测细胞和培养上清中的HCV RNA和抗原表达。结果 从孵育的2～3天,即可在细胞内和/或培养上清中间断地检出HCV RNA（其中HCV在7721细胞株中的复制至少可达66d,HCV在 人胎肝细胞中的复制持续25d）;HCV抗原可在感染细胞内得到稳定表达,感染细胞内存在HCV负链RNA杂交信号,且多位于细胞浆。结论 两种肝细胞对HCV易感,尤其是7721细胞可以稳定地支持HCV体外复制,可用于HCV体外长期培养的靶细胞。     

重组丙型肝炎病毒在7721细胞中的复制

目的 探讨构建的重组丙型肝炎病毒(HCV)能否在易感细胞系中复制和表达。方法 用人工构建的HCV感染易感细胞系7721，培养72h后利用RT-PCR检测HCV的RNA表达，并应用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察免疫荧光标记的HCV核心抗原和胞膜抗原EI在细胞中的表达。结果 人工构建的HCV感染7721细胞72h后、RT-PCR检测细胞内可检出HCV正链及负链RNA，细胞培养上清中可检出HCV正链RNA，CLSM检测HCV核心抗原和E1抗原在细胞内的分布呈胞浆型。结论 构建的HCV72h内可以在易感细胞系7721中复制和表达。     

形成丙型肝炎病毒负链复制体的相关蛋白的分析

目的：确定丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS5B以及肝母细胞瘤株HepG2胞浆提取物中的宿主蛋白与HCV负链RNA3′末端的特异性结合作用。方法：用蛋白-核酸紫外交联试验分别检测NS5B以及HepG2胞浆提取物中的宿主蛋白与HCV负链RNA3′末端的结合作用，用非同源RNA和非同源蛋白作为竞争物分析这种结合的特异性。结果：NS5B以及宿主细胞内一约45ku的蛋白质（简称P45）均可与HCV负链RNA3′末端特异性结合。结论：NS5B和P45是HCV负链RNA3′末端复制体的两个成分。     

丙型肝炎阳性血清直接感染HepG2细胞的初步研究

目的 :用丙型肝炎 (丙肝 )阳性血清 (抗HCV阳性及HCVRNART PCR阳性 )感染HepG2细胞 ,以期建立稳定的HCV感染的细胞模型。方法 :采用丙肝阳性血清连续感染法感染HepG2细胞 ,用逆转录多聚酶链反应检测传代HepG2细胞内HCVRNA正链和负链 ,电镜观察感染后的细胞内的病毒颗粒 ,免疫组化方法检测感染后的细胞内丙肝病毒蛋白抗原 (HCVNS5、HCVcapsid)的存在。结果 :感染后传代的第一代至第三代细胞内检出HCVRNA正链及负链 ;在感染后传代的细胞内发现球形、密集分布的类丙肝病毒颗粒 ,直径为 30～ 6 0nm ;免疫金银染色发现部分细胞内有聚集的银染颗粒 ;免疫电镜检查在细胞胞浆的囊泡样结构中发现聚集的金颗粒。结论 :HCV可在HepG2细胞内复制 ,可形成病毒颗粒 ,可随细胞传代。本研究初步建立了用丙肝阳性血清感染HepG2细胞的丙肝病毒感染细胞模型     

形成丙型肝炎病毒负链复制体的相关蛋白的分析

【目的】确定丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白NS5B以及肝母细胞瘤株HepG2胞浆提取物中的宿主蛋白与HCV负链RNA 3′末端的特异性结合作用。【方法】用蛋白 核酸紫外交联试验分别检测NS5B以及HepG2胞浆提取物中的宿主蛋白与HCV负链RNA 3′末端的结合作用 ,用非同源RNA和非同源蛋白作为竞争物分析这种结合的特异性。【结果】NS5B以及宿主细胞内一约 4 5ku的蛋白质 (简称P4 5 )均可与HCV负链RNA 3′末端特异性结合。【结论】NS5B和P4 5是HCV负链RNA 3′末端复制体的两个成分     

重组丙型肝炎病毒在7721细胞中的复制

目的 探讨构建的重组丙型肝炎病毒(HCV)能否在易感细胞系中复制和表达。方法 用人工构建的HCV感染易感细胞系7721,培养72h后利用RT-PCR检测HCV的RNA表达,并应用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察免疫荧光标记的HCV核心抗原和胞膜抗原E1在细胞中的表达。结果 人工构建的HCV感染7721细胞72h后,RT-PCR检测细胞内可检出HCV正链及负链RNA,细胞培养上清中可检出HCV正链RNA,CLSM检测HCV核心抗原和E1抗原在细胞内的分布呈胞浆型。结论 构建的HCV72h内可以在易感细胞系7721中复制和表达。     

多重人肝癌多药耐药细胞模型的建立

目的　研究肝癌多药耐药 (MDR)机制。　方法　采用阿霉素 丝裂霉素通过药物间断 /持续接触诱导法诱导 SMMC 772 1细胞株建立一组多重人肝癌 MDR细胞模型 SMMC 772 1/ M细胞亚系。　结果　多重人肝癌MDR亚系 SMMC 772 1/ M的耐药涉及 mdr1 、MRP、L RP、Topo α和 GSTP1 基因。　结论　 SMMC 772 1/ M亚株是目前肝癌 MDR研究的较适合的模型     

HCV亚基因复制子支持细胞的筛选

目的寻找新的支持HCV亚基因复制子复制的支持细胞,为研究HCV复制机制、HCV与宿主间的关系,及建立HCV缺陷病毒培养体系提供材料储备。方法质粒pNNeo3-5B含HCV-N亚基因复制子cDNA,该复制子RNA能在Huh7细胞中有效复制。缺失其中的BsaBⅠ-HpaⅠ片段(含NS5B的GDD基序),生成缺陷型复制子质粒pNNeo3-5B(Δ)。将以上两个质粒线性化后体外转录出复制子RNA:rNNeo3-5B和rNNeo3-5B(Δ)。将rNNeo3-5B电转染Huh7、SMMC7721、HepG2、BEL7402、Lo2、CBRH7919、BHK21、VeroE6、293和293T等细胞,以G418筛选3周,观察克隆形成情况,并检测克隆中HCV特异性RNA和蛋白。结果在CBRH7919和BHK21获得G418抗性克隆,转染rNNeo3-5B(Δ)的细胞和未转染复制子的细胞则全部死亡。RT-PCR检测证实各克隆都含有HCV5′NTR和新霉素磷酸转移酶基因,间接免疫荧光和Westernblot检测证实有大量表达的HCVNS3和NS5A蛋白,未转染复制子的细胞全为阴性。结论本研究证实CBRH7919和BHK21能支持HCV复制子的自主复制,可作为建立HCV病毒培养体系的备选材料。     

体外感染细胞表达HCV-NS5和复制HCV RNA的实验研究

为了研究 HCV- NS5 和 HCV RNA在体外感染细胞培养系统中的表达和复制情况 ,选用 HCV RNA水平为2× 10 4拷贝 / m l的阳性血清感染人肝癌细胞株 (Hep G2细胞株 )。应用胶体金标免疫电镜法和原位杂交法检测 HCV在被感染细胞中 NS5 蛋白表达和 RNA复制的情况。结果在细胞浆内有电子密度大的金标颗粒的吸附 ,在感染后的第 1至第 9代细胞中均有发现。感染后的细胞超微结构完整 ,未发现 HCV颗粒。在感染后的第 1至第 7代细胞内出现特异性杂交信号 ,HCV RNA阳性物呈蓝紫色细小颗粒分布在细胞浆和细胞核内。因此 ,HCV能够在 Hep G2细胞中表达 NS5抗原和复制 RNA,而细胞超微结构完整。     

Characteristics of HCV replication and expression in a cultured human liver carcinoma cell line in vitro

ProgressonhepatitisCresearchhasadvancedquickly.However,theabsenceofcellculturesystemofHCVinfectionhashamperednotonlytheunder-standingofitslifecycle,butalsotheanalysisofthemoleculardeterminantsofitspersistence.Toidentifycriticalepitopesthatelicitaneutralizingantibodyre-sponseandtounderstandthepathogenesisofpersis-tentHCVinfection,efficientcellmodelsofHCVin-fectionisneeded[1].HumanT-lymphocytecelllines[2-5],humanfibroblastcells[6](VH3),peripheralbloodmono-nuclearcells[7](PBMCs)andhepatocy…     

RPS27a蛋白重组质粒的构建及其在肝癌细胞株的定位

目的:构建pcDNA3.1-RPS27a重组质粒载体并观察其在HepG2和SMMC7721细胞株中的定位和表达情况.方法:使用基因合成法合成RPS27a基因,将扩增后的目的基因连接至pcDNA3.1载体.转化DH5α大肠埃希菌后,进行质粒抽提然后电泳及测序鉴定.将鉴定后的pCDNA3.1-RPS27a质粒分别转染HepG2和SMMC7721细胞株,通过激光共聚焦显微镜观察其在真核细胞中的表达和定位情况.结果:pCDNA3.1-RPS27a 重组质粒构建成功.通过激光共聚焦显微镜观察发现RPS27a主要表达于HepG2和SMMC7721细胞的胞质中.结论:pCDNA3.1-RPS27a载体构建成功,证实了RPS27a主要表达于HepG2和SMMC7721细胞的细胞质中.     

一氧化氮对人肝癌细胞SMMC-7721和HepG2生长增殖的影响

目的：应用两株人肝癌细胞（SMMC-7721和HepG2）为实验模型，以硝普钠（SNP）为NNO供体，探讨NO对人肝癌细胞生长增殖的影响。方法：应用MTT、荧光染色技术和电子显微技术、DNA琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术定性和定量地检测SMMC-7721和HepG2细胞凋亡情况。结果：NO供体SNP能抑制人肝癌细胞SMMC-7721和HepG2的生长增殖，并诱导其凋亡，在一定范围内呈时间-剂量依赖关系，同时也引起细胞坏死；SMMC-7721细胞对NO作用的敏感性较HepG2高。结论：NO可抑制人肝癌细胞生长增殖，诱导细胞凋亡，并引起死亡，且两株细胞对其敏感性不同。     

GSK-J4通过抑制STAT3磷酸化对HepG2肝癌细胞凋亡和侵袭的影响

目的 探讨GSK-J4通过抑制组蛋白去甲基化酶含Jumonji结构域蛋白3(Jumonji domain-containing protein 3, Jmjd3) 并上调H3K27me3的表达影响HepG2肝癌细胞凋亡和侵袭的分子机制.方法 体外培养人正常肝细胞L02及人肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC) 细胞株HepG2、 SMMC7721,RT-PCR检测Jmjd3 mRNA表达,Western blot检测Jmjd3、H3K27me3蛋白表达;CCK-8法检测不同浓度GSK-J4(0、10、30、50 μmol /mL) 处理HepG2后增殖能力;流式细胞仪检测凋亡率;Transwell检测细胞侵袭力;Western blot检测Jmjd3、H3K27me3和凋亡相关蛋白Bcl2、Bax、Caspase3、上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT) 相关标记物E-钙黏蛋白(E-cadherin ) 、波形蛋白(Vimentin) 以及p-STAT3、STAT3蛋白表达.结果 与L02比,Jmjd3高表达,H3K27me3低表达于HepG2、SMMC7721肝癌细胞株(P＜0. 05);GSK-J4抑制HepG2增殖(P＜0. 05);GSK-J4处理组细胞凋亡率明显提高,细胞侵袭能力减弱(P＜0. 05);GSK-J4处理HepG2后Jmjd3水平降低,H3K27me3水平增高,Bcl2水平降低,Bax、Caspase3水平增高,E-cadherin表达增高,Vimentin水平降低(P＜0. 05);p-STAT3表达下调(P＜0. 01) .结论 GSK-J4通过抑制Jmjd3并上调H3K27me3表达而诱导HepG2发生凋亡并减弱侵袭,其可能与抑制EMT形成和STAT3的磷酸化有关.     

亚砷酸钠抑制肝癌细胞增殖与PML蛋白表达

目的：研究亚砷酸钠抑制肝癌（HCC）细胞增殖是否与早幼粒细胞白血病（PML）蛋白表达有关。方法免疫组织化学法、免疫荧光、蛋白免疫印迹法（Western blot）和荧光定量PCR检测HCC组织PML蛋白及基因表达。结果免疫组织化学分析显示随机选择15例高分化、中度分化和低分化HCC组织和细胞均不同程度表达PML蛋白。Western blot 分析发现24例HCC组织、HuH7、HepG2、Hep3B、SMMC‐7721和 L02细胞均表达 PML 蛋白。免疫荧光提示 HuH7、HepG2、Hep3B、SMMC‐7721细胞核均有PML蛋白颗粒,其中 HuH7和 Hep3B细胞表达PML蛋白较 HepG2、SMMC‐7721细胞多。24例 HCC组织, Hep3B、HepG2、SMCC‐7721和HuH7细胞都表达PML基因。亚砷酸钠不仅可下调HuH7和原代 HCC细胞表达PML蛋白,而且亚砷酸钠抑制HuH7,HepG2,Hep3B和SMMC‐7721细胞生长,随着暴露时间延长亚砷酸钠对HCC细胞抑制作用增强。结论HCC 组织和细胞系普遍表达PML 基因和蛋白,PML 蛋白可能是砷剂直接靶向作用的分子基础。     

长链非编码RNA CCAT2在肝癌中的作用及其机制

目的 探讨长链非编码RNA CCAT2(LncRNA CCAT2)在肝癌中的作用及机制.方法 选取我院2013年1-6月60例肝癌及其癌旁组织,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测其组织中CCAT2的表达,同时培养正常肝细胞L02和人源性肝癌细胞系HepG、H2P、SMMC和HLE细胞,采用qRT-PCR检测细胞中CCAT2的表达,采用siRNA干扰细胞CCAT2表达后,在24、48、72、96 h用CCK-8检测SMMC和HLE细胞增殖;Transwell实验分析细胞迁移和侵袭情况;采用流式细胞仪分析CCAT2对SMMC和HLE细胞周期分布和凋亡的影响;Western blot检测P53、Bcl-2、Caspase-8蛋白的表达.结果 在肝癌组织和肝癌细胞中,CCAT2的表达显著升高(P均＜0.05),CCAT2高表达的患者预后和生存率均较低(P均＜0.05).肝癌细胞中低表达的CCAT2能显著抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭(P均＜0.05).肝癌细胞中低表达的CCAT2也能使肝癌细胞周期停留在Go/G1期并促进细胞凋亡(P均＜0.05).采用siRNA干扰细胞CCAT2表达后,肝癌细胞中P53和Caspase-8蛋白的表达显著升高(P均＜0.05),Bcl-2蛋白的表达显著降低(P＜0.05).结论 CCAT2在肝癌组织和细胞系中高表达,siRNA干扰CCAT2表达后能够抑制细胞增殖、迁移、侵袭以及促进肝癌细胞的凋亡,其机制可能通过升高P53和Caspase-8蛋白的表达和降低Bcl-2蛋白的表达有关.     

Hsa_circ_0000711在人肝癌细胞系中的功能研究

目的 研究环状RNA hsa_circ_0000711在人肝癌细胞系中的表达以及对肝癌细胞生物学功能的影响.方法 利用RT-qPCR检测环状RNA hsa_circ_0000711在肝癌细胞系的表达;通过小干扰RNA特异性敲低hsa_circ_0000711的表达;通过CCK-8实验检测肝癌细胞系的增殖情况;利用流式细胞技术检测细胞周期及细胞凋亡.Western blot检测下调hsa _circ _0000711后Cyclin D1、CDK4、 cleavaed Caspase 3及Bcl-2蛋白的表达水平.结果 Hsa_circ_0000711在肝癌细胞HepG2和SMMC- 7721中明显高表达(P＜0. 05) .与对照组相比,hsa_circ_0000711干扰组的肝癌细胞增殖能力显著降低(P＜0. 05),处于G1期细胞增多(P＜0. 05),且凋亡细胞显著增加(P＜0. 05) .干扰hsa_circ_0000711的表达后,肝癌细胞中Cyclin D1、CDK4和Bcl-2的蛋白表达量显著降低(P＜0. 05),cleavaed Caspase 3蛋白表达量显著升高(P＜0. 05) .结论 Hsa_circ_0000711可能通过调控细胞周期及凋亡影响肝癌细胞的增殖.