含hTERT片段的重组逆转录病毒感染对树突状细胞功能的影响

目的观察含人端粒酶逆转录酶（hTERT）片段的重组逆转录病毒感染对树突状细胞（DCs）功能的影响。方法ELISA试剂盒检测DCs培养液中IL-12水平;混合白细胞（MLR）反应检测含hTERT片段的重组逆转录病毒感染的DCs（hTERT-DCs）和未感染的DCs（N-DCs）刺激同种异体淋巴细胞增殖能力;流式细胞术检测DCs表面分子CD80、CD83、CD86和HLA-DR的变化;CytoTox96非放射性细胞毒性检测试剂盒检测细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应。结果hTERT-DCs和N-DCs在分泌IL-12的水平、刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力方面无明显差异;hTERT-DCs的CD83表达水平低于N-DCs,同时,hTERT-DCs激发的CTL对端粒酶阳性的靶细胞杀伤率明显高于端粒酶阴性的靶细胞（P〈0．05）。结论hTERT-DCs尽管有可能阻止DCs自身的成熟,但在活化淋巴细胞、刺激淋巴细胞分化增殖的能力方面并没发生明显改变,并且还能激发hTERT特异性CTL。     

含人铜锌SOD基因逆转录病毒重组体的构建

构建含人铜锌ＳＯＤ基因逆转录病毒重组体。通过两步克隆将编码人铜锌超氧化物歧化酶基因片断从表达载体Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔｌｌ中切下，定向插入逆转录病毒载体ＸＭ－６上，以限制性内切酶切分析法判定插入是否正确。限制性内切酶谱分析与理论计算相符。含人铜锌ＳＯＤ基内逆转录病毒重组体和构建成功，为今后进行心肌保护，抗动脉粥样硬化及抗衰老的基因治疗等开辟了广阔前景。     

hTERT启动子引导的NIS基因重组腺病毒的构建

目的：构建在人端粒酶逆转录酶（hTERT）核心启动子引导钠碘转运体（NIS）基因的重组腺病毒。方法：PCR扩增目的片断;通过荧光分析实验,选取启动效果最好的hTERT启动子片断;建立3个重组腺病毒：Ad—hTERT—NIS、Ad—CMV—NIS及Ad—CMV-TPO,培养胶质瘤细胞系U87、U251及细胞系MRC-5（正常人胚胎成纤维细胞系）,然后转染病毒并进行westem bolt分析等实验。结果：胶质瘤细胞U87及U251中端粒酶为阳性,hTERT启动子片段204启动效率比较其他片段效率高。该启动子片段可以引导NIS基因的靶向性表达。结论：成功构建在hTERT核心启动子引导NIS基因的Ad—hTERT—NIS及重组腺病毒Ad—CMV—NIS和Ad-CMV—TPO,该重组腺病毒转染胶质细胞U87和U251后能成功表达NIS及TPO基因。     

人midkine基因重组逆转录病毒载体构建及鉴定

目的 构建人中期因子(MDK)基因重组逆转录病毒载体,转染人胃癌SGC7901细胞株,为探讨MDK的生物学功能奠定基础.方法 扩增人MDK编码序列基因片段,经限制性内切酶酶切后将目的 片段插入pLXSN逆转录病毒载体.经酶切及测序鉴定后与pVSVG共转染GP293包装细胞,收集病毒上清感染人胃癌SGC7901细胞,G418筛选获得阳性细胞株.,结果酶切及DNA测序证实MDK基因重组逆转录病毒载体构建正确.病毒上清感染SGC7901细胞,G418筛选出阳性克隆,经实时定量PCR及Western blot检测发现SGC7901细胞中MDK mRNA及蛋白表达水平明显上调.结论 成功构建了高表达MDK的SGC7901细胞株,为进一步探讨其生物学功能奠定实验基础.     

HBx基因重组逆转录病毒载体的构建及表达

目的:构建携带HBx基因的重组逆转录病毒载体,为进一步研究HBx基因在HBV相关性HCC(原发性肝癌)发病机制中的作用以及建立肝癌动物模型奠定基础.方法:根据基因库中已公布的HBx序列设计引物,采用PCR技术从HBx腺病毒质粒中扩增出HBx基因.将HBx基因克隆到逆转录病毒载体pSEB-HUS质粒中.酶切、PCR及测序鉴定后经脂质体介导转染L02细胞,Western Blotting检测HBx蛋白的表达.结果:PCR、酶切及测序鉴定证实目的基因正确克隆至逆转录病毒质粒pSEB-HUS中,目的基因序列与GENE BANK报道一致,转染L02细胞后荧光显微镜可观察到GFP的表达.Western Blotting检测可见HBx蛋白的表达.结论:成功构建HBx重组逆转录病毒载体.     

hTERT基因荧光真核表达载体的构建及表达

目的：构建人端粒酶催化亚单位(hTERT)正、反义荧光真核表达载体，并检测其在人胚胎成纤维细胞中的表达．方法：采用基因重组技术，将hTERT cDNA正向克隆到荧光真核表达载体pIRES2-EGFP中，NotI酶切鉴定；采用脂质法，将重组基因pIRES2-EGFP-hTERT转染入原代培养的人胚胎成纤维细胞；采用激光共聚焦显微镜、RT-PCR及Western blot检测hTERT在胚胎成纤维细胞中的表达．结果：经NotI酶切后，hTERT正义重组质粒被切成1．4kb和7．4kb2个片段，反义重组质粒为4．8kb和4．0kb2个片段，与理论预期长度相符；pIRER2-EGFP-hTERT重组基因经脂质法转染，G418筛选，获得一个阳性克隆，激光共聚焦显微镜下可见明显的绿色荧光，RT-PCR及Western blot可见hTERT mRNA转录及其蛋白的表达。结论：成功构建了h TERT正义荧光真核表达载体，并可在人胚胎成纤维细胞中表达。     

人端粒酶逆转录酶原核表达载体的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT,并观察融合蛋白的表达。方法：用RT-PCR方法从人肝癌组织中扩增出带有EcoRⅠ酶切位点的hTERT基因片段,与pGEM-T Easy连接,转化感受态大肠杆菌JM109,经蓝-白筛选、PCR扩增等筛选阳性菌落,用EcoRⅠ酶切获取目的片段,并与EcoRⅠ酶切过的pGEX-4T-1质粒连接,重组子转化BL21感受态大肠杆菌,PCR扩增筛选出阳性菌落。基因测序并用Omega 2．0软件比较分析重组质粒中hTERT基因片段与GenBank中的已知序列的同源性。通过诱导pGEX-4T-1融合蛋白表达,用抗hTERT多抗对融合蛋白进行Western blot鉴定,薄层凝胶光密度扫描测定融合蛋白表达量。结果：PCR扩增等方法证实,人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT构建成功,其中hTERT基因片段与GenBank中相应基因同源性为98．73％,氨基酸序列同源性为99．68％。Western blot检出GST-hTERT融合蛋白,其表达量达28．4％。结论：成功构建了pGEX-4T-1-hTERT原核重组质粒并获得高度表达。     

人端粒酶逆转录酶基因启动子调控表达载体的构建和鉴定

目的:构建并鉴定人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transeriptase,hTERT)基因启动子调控的荧光素酶基因表达载体。方法:用巢式PCR方法克隆hTERT序列长约1100bp的启动子片段,经测序无误后将其插入荧光素酶基因报告载体中,构建pGL3-hTERTp重组质粒,转化JM190细菌得到大量含有hTERT启动子的荧光素酶重组质粒。用双酶切和PCR法鉴定重组质粒,并送测序鉴定。结果:经过酶切和PCR法鉴定成功地构建了携带hTERT启动子的重组荧光素酶基因报告载体。结论:成功获得由hTERT启动子调控的荧光素酶基因表达载体,为研究As₂O₃对HL-60细胞端粒酶作用的分子机制打下基础。     

端粒酶逆转录酶与Bcl-2在口腔黏膜癌变过程中的表达及意义

目的：研究口腔黏膜癌前病变癌变过程中人端粒酶逆转录酶（hTERT）和Bcl-2的表达.方法：采用原位杂交和免疫组化方法对口腔黏膜单纯增生（HP）9例,轻度异常增生（LD）11例,中度异常增生（MD）10例,重度异常增生（原位癌CIS）9例,鳞癌（SCC）11例,进行hTERTmRNA及Bcl-2蛋白的检测.结果：hTERT和Bcl-2在口腔黏膜癌前病变和鳞癌中均有异常表达,CIS及SCC组织中hTERT的表达明显高于HP、LD和MD（P＜0.05）;SCC中Bcl-2表达明显高于HP和异常增生组织（P＜0.05）.结论：端粒酶的活化和Bcl-2表达的增强在口腔黏膜癌前病变和鳞癌的发生和发展中起着重要作用,它们的异常表达有助于口腔黏膜癌前病变和鳞癌的早期诊断.     

人端粒酶逆转录酶基因启动子区的克隆及其真核表达载体的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶基因启动子区的真核表达载体。方法：用核酸内切酶NotⅠ和KpnⅠ酶切报告基因GFP,插入pcDNA3．1( )载体,得到pcDNA3．1( )-GFP(PG)载体;用PCR方法扩增hTERT基因ATG上游的启动子序列,测序后用核酸内切酶BglⅡ和KpnⅠ酶切插入PG载体,得到pcDNA3．1( )-GFP—hTERT(PGT)载体。将PGT载体转染人食管癌EC9706细胞系,经G418筛选,荧光显微镜下观察。结果：克隆得到的启动子序列与文献相符,重组载体经酶切鉴定方向正确,含有人端粒酶逆转录酶基因启动子序列。经转染人食管癌EC9706细胞系,在荧光显微镜下观察到绿色的阳性克隆。结论：克隆的人端粒酶逆转录酶基因启动子序列在真核细胞中具有启动子活性。     

脂质体介导人端粒酶逆转录酶基因构建永生化软骨细胞方法的建立及评价

目的：探索将人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因转入兔软骨细胞以获取大量种子细胞的方法和技术。方法：分离培养原代兔软骨细胞,以pcDNA3.1/Zeo(+)-hTERT载体进行基因转染,对照组则为空载体pcDNA3.1/Zeo(+),筛选并挑选出阳性克隆后扩增,以逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测转染hTERT基因后的软骨细胞hTERT mRNA表达;甲苯胺蓝染色判断转染hTERT基因后的软骨细胞是否具有软骨细胞的生物学特性;流式细胞术检测细胞周期及核型;裸鼠致瘤实验观察成瘤情况。结果:RT-PCR检测RNA水平上hTERT在细胞中的表达情况,hTERT转入兔软骨细胞后细胞形态未发生变化,长满单层后仍然呈现出多角形,与正常体外培养的软骨细胞形态基本一致。甲苯胺蓝染色后可见多糖染成蓝紫色,呈现较小蓝紫色颗粒,蛋白多糖等基质分布均匀,即转染hTERT基因后的软骨细胞具有合成和分泌软骨相关基质的功能。细胞周期测定转染hTERT的兔软骨细胞的增殖能力明显上升,细胞分裂基本以整数二倍体方式进行,保持了核型的基本稳定。裸鼠接种不致瘤。结论：转染hTERT的软骨细胞表型未发生转化,具有作为种子细胞和研究正常软骨细胞的生理、生化工具细胞的可行性。     

肾癌尿沉渣中人端粒酶逆转录酶基因启动子区甲基化检测的临床意义

目的：探讨人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子区在肾癌患者尿沉渣中DNA甲基化状态及临床意义。方法提取76例肾癌（肾癌组）和38例非肾癌（对照组）患者术前尿沉渣中的DNA,经亚硫酸氢钠修饰后,应用甲基化特异性PCR（MSP）方法对DNA进行扩增,将MSP产物进行凝胶电泳观察分析甲基化情况。结果肾癌组患者hTERT启动子区高甲基化发生率明显高于对照组（P＜0．05）,但hTERT启动子区高甲基化与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤分期无统计学关联（P＞0．05）。结论尿沉渣中hTERT启动子区甲基化与肾癌发生相关,并且其作为一种无创性检测有助于肾癌的临床诊断。     

RNA干扰人端粒酶逆转录酶基因对膀胱尿路上皮癌BIU-87细胞株端粒酶活性抑制的研究

目的:探讨RNA干扰技术使人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因沉默,对膀胱尿路上皮癌BIU-87细胞株端粒酶活性的抑制作用。方法:针对hTERT基因设计构建多种siRNA表达载体,并转染至膀胱肿瘤BIU-87细胞,通过实时荧光定量、单四唑(MTT)检测端粒酶活性,观察siRNA表达载体对hTERT基因表达的影响。结果:实时荧光定量和MTT检测证明,所构建的载体能导致不同程度的hTERT基因沉默,并成功地抑制BIU-87细胞的生长。结论:RNA干扰膀胱尿路上皮癌细胞(BIU-87)端粒酶hTERT基因,能影响端粒酶基因的表达,为进一步研究端粒酶活性在膀胱尿路上皮癌中的作用奠定了基础。     

靶向人端粒酶逆转录酶进行RNAi的逆转录病毒载体的构建

目的构建靶向性干扰人端粒酶逆转录酶表达的特异性小干扰RNA的真核表达载体。方法采用PCR法分别扩增增强型绿色荧光蛋白的DNA序列、U6启动子序列和靶向性干扰人端粒酶逆转录酶的特异性小干扰RNA对应的DNA序列,随后将与之相应的DNA序列片断依次克隆入真核表达载体pLXSN中,并通过限制性内切酶和测序对该重组表达载体进行鉴定。以荧光显微镜和利用流式细胞仪分析重组病毒表达EGFP蛋白的情况。以MTT方法检测初步分析重组病毒对人Hela细胞的RNAi效果。结果限制性内切酶酶切和测序结果均表明成功构建了靶向人端粒酶逆转录酶的小干扰RNA的逆转录病毒表达载体pLXSN/EGFP-U6-siTERT。以磷酸钙共转染法制备的重组逆转录病毒滴定了病毒滴度后,重组病毒感染人Hela细胞24h时用流式细胞仪测得EGFP表达的阳性率为24.1%。重组逆转录病毒感染人Hela细胞48h时,MTT实验测得细胞死亡率为53.2%。结论成功构建了针对人端粒酶逆转录酶小干扰RNA的逆转录病毒表达载体pLXSN/EGFP-U6-siTERT,并制备了重组逆转录病毒,初步观察了效应,为进一步利用小干扰RNA技术研究肿瘤的基因治疗奠定了基础。