不同处理和保存条件下体外HCV RNA稳定性研究

对献血者或病人进行HCV核酸检测时，如果标本的采集、处理、保存不当，会造成病毒核酸降解，从而影响检测结果的真实性。本研究的目的是对不同抗凝剂、不同温度、不同保存时间下的HCV RNA病毒稳定性进行研究，以考察常规采供血过程中，标本采集及保存方式对NAT检测的影响。采集7例HCV RNA阳性献血者的血样，采用不同的抗凝剂、经不同的温度和不同的时间保存后，采用荧光定量PCR方法测定HCV RNA病毒含量，考察HCV RNA的稳定性。结果表明：①不同抗凝剂抗凝的全血于4℃保存48小时过程中，病毒含量下降至原滴度的42．7％；EDTA抗凝组各时间点的滴度均低于其它3组（分别相当于其它3组的67．6％-25．1％）。②ACD抗凝的全血在4、25和37℃保存48小时．病毒含量分剐下降到原滴度的53．8％、72．5％、29．8％。③ACD抗凝的全血离心分离出血浆，4℃或25℃继续保存7天，病毒含量分别下降至原滴度的70．9％和25．1％。④ACD抗凝的全血分离的血浆，反复冻融4次，病毒含量下降到原滴度的38．9％。结论：①用于核酸检测的标本应该用无菌采血管采样；②在无菌采血管采样的前提下，核酸检测标本用未抗凝血、EDTA、ACD、CPDA抗凝血均可；③采集的全血应避免放置37℃以上，ACD抗凝全血在4℃、25℃保存48小时内、37℃保存14小时内，HCV RNA病毒仍较为稳定；④分离后的血浆应避免放置25℃以上，ACD抗凝全血分离后的血浆在4℃保存7天，25℃保存3天，HCV RNA病毒仍比较稳定；⑤血浆标本应避免多次冻融，但冻融3次的血浆HCV RNA病毒含量仍然较为稳定；⑥无菌采样对维持病毒的稳定性非常重要；单纯的机械性溶血并不会明显导致病毒的降解；只要注意无菌的问题和有合适的核酸提取方法去除血红素，HCV RNA病毒实际上比以前认为的要稳定得多。     

血液处理和保存对丙型肝炎病毒RNA稳定性的影响

背景和目的 为测定捐血者血液样品在运送和保存期间,应用酸扩增技术进行HCV筛查之前,HCVRNA的稳定性。材料和方法 分别收集的血液和血浆样品于不同温度条件保存120h,应用逆转录PCR试验进行HCV RNA定量测定。结果保存在EDTA试管(Greiner)血浆预备试管(PPT,Becton Diekinson)中的全血4℃ 72h后,HCV RNA的浓度没有下降,保存在EDTA试管和PPT试管中25℃ 72h后,HCV RNA浓度下降亦     

不同保存条件对丙型肝炎病毒核酸稳定性的影响

目的探讨不同温度和时间条件下保存对血液中丙型肝炎病毒核酸(HCV RNA)稳定性的影响。方法采集12名丙型肝炎患者4 ml的外周血,分装、保存在不同温度及相同温度下的不同时间,利用实时荧光定量PCR检测其不同时间点血浆HCV RNA的水平(log IU/ml),并与该血液标本的起始HCV RNA水平做比较分析。结果当血液标本中的HCV RNA起始水平≥105IU/ml时,在25℃放置6 h后转至4℃保存18 h(a)、25℃放置12 h后转至4℃保存12 h(b)及4℃放置24 h(c)等3种保存条件,24 h时内检测到血液标本的HCV RNA水平105IU/ml组分别为(5.15±0.16)、(5.15±0.15)及(5.16±0.16)IU/ml(P>0.05),107 IU/ml组分别为(7.45±0.21)、(7.44±0.23)及(7.45±0.24)IU/ml(P>0.05);当血液标本中HCV RNA起始水平在临界范围[(3.38±0.14)IU/ml]时,在条件a、b保存24 h血液标本的HCV RNA含量分别为(2.28±1.52)IU/ml、0(均为P<0.01),而条件c保存24 h血液标本的HCV RNA含量为(3.28±0.20)IU/ml(P>0.05);当血液标本中HCV RNA起始水平为103 IU/ml时,在4℃保存48 h时HCV RNA含量为(2.31±1.54)IU/ml(P<0.01)。结论当血液中HCVRNA起始浓度较低时,HCV RNA的稳定性较差,短时常温保存都会造成病毒核酸的降解。     

血浆丙型肝炎病毒核酸稳定性的研究

目的：建立血浆丙型病毒性肝炎病毒(HCV)核酸的稳定保存方法，提高荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测的准确性。方法：HCV混合血浆以TRIZOL提取病毒核酸，分别保存于70％乙醇溶液及溶解于焦碳酸二乙醇(DEPC)水中。在4℃放置不同时间后，以FQ-PCR检测HCV RNA拷贝数。HCV RNA冻干质控品溶解于DEPC水并提取核酸后同时测定作为对照。另外，对保存的HCV RNA稀释后作线性分析。结果：未提取核酸的病毒血浆及70％乙醇溶液中的HCV RNA在4℃保存8d后，病毒核酸拷贝数无明显改变。HCV RNA DEPC水溶液在4℃放置30min后即发现拷贝数降低,5h后下降为零。质控品测定值无明显降低。在70％乙醇溶液中保存的HCV RNA稀释后测定值具有线性(r=0．9991)。结论：病毒在血浆及70％乙醇溶液中保存，其核酸可以在4℃稳定保存至少8d并具有良好的线性。病毒核酸DEPC水溶液在4℃易发生降解。     

血浆中丙型肝炎病毒核酸在不同保存条件下的稳定性

目的探讨不同保存条件和时间对丙型肝炎病毒(HCV)RNA稳定性的影响。方法将22份血浆样本置于-20℃保存4周,4℃保存12d,室温(20~25℃)保存7d,反复冻融5次,采用荧光定量聚合酶链反应测定HCV RNA水平,考察HCV RNA稳定性。结果样本在-20℃保存4周HCV RNA平均下降幅度小于或等于0.14lg,±95%CI≤0.20lg;4℃保存12dHCV RNA平均下降幅度小于或等于0.39lg,4℃保存12d时95%CI下限为-0.50lg,12d时±95%CI≤0.24lg;室温保存7dHCV RNA平均下降幅度小于或等于0.40lg,室温保存7d处理组95%CI下限为-0.53lg,7d时±95%CI≤0.29lg;反复冻融5次HCV RNA平均下降幅度小于或等于0.10lg,±95%CI≤0.15lg。结论血浆样本在-20℃保存4周、4℃保存9d、室温保存5d和反复冻融5次时,对HCV RNA水平影响不明显,但4℃保存12d或室温保存7d后,RNA水平显著降低,所以应避免在这种条件和时间下保存和运输血浆。     

标本前处理因素对流式细胞术检测淋巴细胞亚群的影响

目的:探讨抗凝剂、保存时间和保存温度等分析前因素对流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群的影响。方法:随机采集健康人全血10份,分别用乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)和肝素钠2种抗凝剂抗凝,4℃及室温(18℃~22℃)保存,在不同时间点(0.05)。结论:在检测总淋巴细胞亚群比例及绝对计数时,肝素钠抗凝的全血标本应保存在室温下,并在48 h内完成检测;EDTA-K2抗凝全血标本则可在4℃及室温下保存,在48 h内完成检测。     

问:基因扩增试验中临床标本的采集、外理和保存有哪些注意事项?

答：首先需明确检测目的，如检测的病原微生物为RNA病毒（如丙型肝炎病毒、禽流感病毒）须注意使用无RNA酶的、经高压灭菌的一次性制品，血标本应尽快分离血清或血浆，分离后如需长期保存，需在-70℃，如对新鲜组织进行mRNA检测，若不立即提取核酸，也应保存在-70℃；如检测沙眼衣原体DNA，取材时一定要取到上皮细胞（沙眼衣原体只有在活细胞内才能增殖复制），而只取分泌物会降低检出阳性率。根据不同的标本也有不同的要求，如血浆或全血标本最好用EDTA抗凝剂；血标本要避免溶血；尿标本以浓缩晨尿为好；     

标本因素及保存条件对HCV RNA检测的影响

目的探讨溶血、脂肪血、保存温度和保存时间对HCV RNA检测的影响,确认用于核酸检测的标本正确采集、处理及保存的关键控制点。方法应用实时荧光PCR法,采用混样检测+单检的检测模式,对在不同浓度的血红蛋白或甘油三脂下以及在不同温度条件下保存不同时间后的HCV RNA标本进行检测,对检测的Ct值进行分析。结果小于7.93mmol/L的不同浓度甘油三脂对HCV RNA检测没有影响(P0.05),血红蛋白浓度为97g/L、34g/L、17g/L以及8g/L时,其对HCV RNA检测均有影响(P0.05),当血红蛋白浓度小于5g/L时,其对HCV RNA检测均无影响(P0.05);保存温度在-30℃下4周内,其检测Ct值差异均无统计学意义(P0.05)。在低于37℃条件下,4h内保存的HCV RNA标本检测Ct值差异均无统计学意义(P0.05)。在4℃的条件下保存72h内,HCV RNA标本检测Ct值差异无统计学意义(P0.05),25℃的条件下能保存48h(P0.05)。结论甘油三脂浓度小于7.93mmol/L对HCV RNA的检测没有影响,血红蛋白浓度大于8g/L时会影响HCV RNA的检测,用于HCV RNA检测的标本在4℃保存时最好在72h内完成检测。     

干血斑样本用于人类免疫缺陷病毒1型前病毒基因诊断的研究

目的研究干血斑（DBS）样本用于人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）感染前病毒DNA基因诊断的可行性。方法采集59例静脉吸毒HIV-1感染者和22名HIV-1阴性健康人EDTA抗凝静脉全血5ml，保存全血1ml，另用50μl制备干血斑样本后，分离血浆。QIAamp Blood Mini试剂盒和10％Chelex 100树脂分别提取全血和干血斑中细胞DNA。Roche Cobas Amplicor逆转录聚合酶链反应检测HIV-1感染者血浆病毒载量。HIV-1Env基因Gp41区，gag基因，pol基因分别用2对外侧和内侧引物，按照套式PCR方法，进行扩增。以HIV-1任何两个基因区扩增结果组合判断HIV-1感染。结果在重复2～3次的前提下，59份DBS样本HIV-1感染基因诊断敏感度93％（95％可信区间89％～97％），34份全血样本94％（95％可信区间89％～98％）。疋。检验显示，两种样本用于HIV-1基因诊断时差异无统计学意义。22份两种阴性样本特异性均为100％（95％可信区间95．93％～100％）。8份血浆病毒载量（VL）〉4．0 Log的DBS样本用于基因诊断的可重复性和HIV-1感染样本检出率优于5份VL〈4．0 Log样本。18对全血和DBS样本HIV-1基因诊断一致性分析，符合率94％，一份DBS样本HIV-1特异三个基因片段均未扩增。结论干血斑样本易采集，便于运输，保存条件低，费用低廉，用于HIV-1基因诊断时与全血样本检测结果无显著性差异，病毒载量〈4．0 Log的样本，为增加检出概率需要对样本重复检测。DBS样本HIV-1基因诊断方法适合于无条件立即处理血样本的偏远地区或采样困难的感染者的诊断，及HIV-1母婴垂直传播研究中婴幼儿感染的早期诊断。     

标本保存温度与时间对血糖和血脂检测值的影响

目的分析保存温度与时间对血浆葡萄糖、血清胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇、极低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇测定结果的影响。方法采集20名自愿受试者空腹静脉血,将离心后的血浆和血清分装,分别放置室温（24℃）、4℃和-20℃,测定不同保存时间的血浆葡萄糖和血清胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇的浓度。结果室温条件下Glu测定值随放置时间而显著降低（P〈0.001）,4℃放置2～6h和-20℃保存6d的Glu检测值差异无显著性。HDL-C室温、4℃放置不同时间测定值差异无统计学意义（P〉0.05）。TC、TG和LDL-C室温2h、4℃4h内的检测结果相对稳定,未见差异有显著性。但-20℃6d保存的标本,除LDL-C外,其他血脂3项均与即刻检测结果有差别。结论4℃条件下保存的分离标本,在2～4h内的血糖和血脂4项检测结果比较稳定,不会影响研究结果。