抗肝纤维化有效中药复方血清药理学方法探讨

扶正化瘀方灌胃正常大鼠制备血清，温育大鼠肝细胞及星状细胞，将含药血清及冻干粉直接添加于培养细胞，通过观察细胞形态及功能变化，探讨复方抗肝纤维化的血清药理试验方法。结果表明冻干粉抑制细胞增殖及活力。二次给药１ｈ后同种灭活血清抑制星状细胞增殖、促进肝细胞增殖，能较好地用于抗肝纤维化的体外药理试验。     

复方五仁醇胶囊入血成分对原代培养肝细胞损伤的保护作用

目的:研究复方五仁醇胶囊含药血清对原代培养肝细胞损伤的保护作用。方法:建立CCl4诱导的大鼠肝细胞损伤模型,采用L8(27)正交设计给药和取血方案,制备大鼠含药血清或血浆,并考察含药血清或血浆对MTT和培养上清液中ALT的影响。结果:复方五仁醇胶囊含药血清或血浆对CCl4诱导的肝细胞损伤具有保护作用,不同给药方式及取血时间对作用有显著影响,且两者之间有交互作用,血浆略优于血清,动物是否造模对作用无明显影响。结论:复方五仁醇胶囊连续灌胃给药3天,每天上下午各给药1次,末次给药2h后获得的大鼠血浆对CCl4诱导的肝细胞损伤有良好的保护作用。     

复方鳖甲片预防肺纤维化大鼠细胞外基质过度形成的实验研究

目的 研究复方鳖甲片预防盐酸博莱霉素致大鼠肺纤维化细胞外基质过度沉积的作用。方法 SD雄性大鼠气管滴注盐酸博莱霉素造模，第2天ig复方鳖甲片1．4，0．7，0．35g／kg，每周连续给药6d，给药4周，观察第28天时大鼠肺组织羟脯氨酸和血清中Ⅲ型胶原(Ⅲ-C)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)及层黏连蛋白(LN)和透明质酸(HA)的含量，同时取肺组织行HE、Masson染色。结果 复方鳖甲片可降低肺纤维化大鼠血清Ⅲ-C、Ⅳ一C，LN及HA的含量，降低肺组织纤维性增生。结论 复方鳖甲片可能是通过降低肺纤维化大鼠细胞外基质含量而发挥治疗作用。     

复方加味桃仁承气汤对小鼠胰岛β细胞作用的研究

目的：研究复方加味桃仁承气汤对小鼠胰岛β细胞（NIT-1）的作用，探讨其抗糖尿病机制。方法：利用^3H—TdR掺入、细胞计数、胰岛素测定等研究复方加味桃仁承气汤水提液及含药血清对小鼠胰岛卢细胞的增殖及胰岛素分泌量的影响。其中含药血清的制备方法为给随机分组的5只大鼠灌胃复方加味桃仁承气汤水提液，每天2次，连续3d，末次给药2h后腹主静脉取血，离心，分离血清。结果：复方加味桃仁承气汤水提液及其含药血清均能明显促进小鼠胰岛β细胞增殖（P〈0．05），同时能明显促进胰岛素分泌（P〈0．05）。结论：复方加味桃仁承气汤抗糖尿病的作用机制可能与其促进胰岛β细胞增殖及胰岛素分泌有关。     

复方丹参滴丸含药血清体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞特异基因GATA-4的表达

目的:观察复方丹参滴丸含药血清体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞特异基因的表达。方法:分离培养大鼠MSCs,流式细胞仪鉴定细胞表面标记;采用复方丹参滴丸的含药血清体外定向诱导第4代MSCs,观察特异基因GATA-4的表达。结果:大鼠MSCs细胞表面抗原CD90、CD106阳性,CD34、CD45、CD31阴性。经含药血清、5-Aza体外诱导大鼠MSCs,细胞上清液中调节心肌发生的专有基因GATA-4的浓度有明显改变。结论:复方丹参滴丸可能有调控心肌发生的专有基因GATA-4的作用,启动细胞向心肌样细胞方向分化。     

补肾复方含药血清对大鼠成骨细胞OPG、ODF表达的影响

为研究补肾复方对大鼠成骨细胞OPG、ODF表达影响。以补肾活血方、补肾健脾方、龟鹿二仙膏、金匮肾气丸、六味地黄丸、左归丸6种补肾中药复方及生理盐水给体重为250g左右的大鼠灌胃,提取含药血清;采用酶消化法从初生2天SD大鼠头盖骨中分离出成骨细胞,用含药血清及生理盐水进行成骨细胞传代培养;取第2代细胞,培养至细胞铺满培养瓶约80%时,更换含药血清培养液24小时;用含药血清培养液24小时后终止培养,提取总RNA,应用RT-PCR方法观察六种补肾复方对大鼠成骨细胞OPG、ODF表达影响。结果显示补肾活血方、补肾健脾方、金匮肾气丸、六味地黄丸和左归丸含药血清培养的大鼠成骨细胞OPG的表达量高于生理盐水对照组,龟鹿二仙膏含药血清培养的大鼠成骨细胞OPG的表达量低于生理盐水对照组,其中补肾活血方组、补肾健脾方组大鼠成骨细胞OPG表达量明显高于生理盐水对照组,统计学有显著性差异(P<0.05)。6种补肾复方含药血清培养的大鼠成骨细胞ODF表达量均低于生理盐水对照组,其中补肾活血方组、补肾健脾方组和金匮肾气丸组大鼠成骨细胞ODF表达量明显低于生理盐水对照组,统计学有显著性差异(P<0.05)。表明补肾活血方、补肾健脾方含药血清能增加大鼠成骨细胞OPG表达量,降低大鼠成骨细胞ODF表达量。     

益气解毒方对体外培养小鼠肝癌H22细胞生长的抑制作用

目的 MTT法观察益气解毒中药复方含药血清对小鼠肝癌H22细胞生长的抑制作用。方法大鼠灌胃制备益气解毒复方中药含药血清,作用于体外培养的小鼠肝癌H22细胞,采用MTT法观察益气解毒中药复方含药血清对细胞生长的抑制作用。结果高剂量血清组与对照血清组之间的吸光度差异有显著统计学意义(P<0.001),随着作用时间的延长,其吸光度逐渐降低,抑制率逐渐增高。结论益气解毒中药复方含药血清对小鼠肝癌H22细胞生长具有较好的抑制作用。     

健脾导滞中药对胃癌细胞VEGF及其受体表达的作用

目的：研究中药复方健脾导滞中药对胃癌细胞血管内皮生长因子（VEGF）及其受体F1t、KDR表达的调控作用。方法：以不同剂量的中药复方健脾导滞中药制剂给SD大鼠灌胃制备含药血清，然后以含药血清培养胃癌细胞，共同培养两代后，分别用免疫组化法和RT-PCR检测不同剂量组胃癌细胞中VEGF及其受体Flt、KDR的表达情况。结果：与对照组相比，VEGF及其受体Flt在用药组胃癌细胞中的表达减弱，染色变浅，并且与用药剂量有一定的关系；VEGF mRNA及其受体Flt mRNA、KDR mRNA在用药组胃癌细胞中的表达也受到抑制。结论：中药健脾导滞中药对胃癌细胞血管内皮生长因子及其受体Flt、KDR的表达有抑制作用，是一个值得进一步研究开发的中药复方。     

益智复方对学习记忆障碍模型的影响及β淀粉样肽细胞毒性的保护作用

目的：探讨益智复方对学习记忆障碍模型的影响及β淀粉样肽细胞毒性的保护作用。方法：对SD大鼠给予不同剂量的益智复方灌胃给药，每次2次连续8次，第8天腹腔内注射氯溴酸东莨菪碱造成动物短暂性学习记忆紊乱，分别采用MORRIS水迷宫及穿梭箱避暗实验来测定大鼠的学习记忆变化。取新生3天以内的SD大鼠皮层神经元细胞进行体外培养7天，分别在加入β淀粉样肽25-35前后加入含益智复方的大鼠血清，测定细胞MTT及培养液上清的LDH含量变化。结果：与模型组相比较，大鼠益智复方组MORRIS水迷宫寻找平台时间显著缩短，避暗实验潜伏期显著增加，错误数显著减少；含益智复方的血清能显著增加β淀粉样肽25-35诱导的SD大鼠神经元存活率，减少培养液上清LDH含量。结论：益智复方具有改善学习记忆的作用，对β淀粉样肽25-35诱导的SD大鼠神经元毒性有较好的保护作用。     

中风醒脑液对体外培养缺血再灌注PC-12细胞SOD活性及MDA含量变化的影响

目的探寻中药复方中风醒脑液SD大鼠含药血清对体外培养的PC-12细胞缺血再灌注损伤的保护作用。方法采用血清药理学和原代神经细胞培养的方法,用SD大鼠的含中风醒脑液血清体外培养PC-12神经细胞,用连二亚硫酸钠造成细胞缺氧损伤模型,用H20：造成细胞氧化损伤模型,建立缺血再灌注的体外细胞模型,用酶标仪测定吸光度,检测PC-12细胞的SOD活性及MDA含量。结果中药复方中风醒脑液SD大鼠含药血清对体外培养的神经细胞缺血再灌注损伤具有保护作用。结论中风醒脑液是一种神经细胞保护剂,可以提高SOD活性、降低MDA水平,能阻断氧自由连锁反应,从而保护神经细胞。     

扶正化瘀方药物血清对原代培养大鼠肝细胞增殖及胶原生成率的影响

大鼠灌胃给扶正化瘀方后分离的药物血清，能显著促进正常及损伤肝细胞的增殖，有效地抑制ＣＣ１４所致损伤肝细胞培养上清液中ＡＬＴ、ＡＳＴ活性，抑制正常及损伤肝细胞的胶原生成率。     

Investigation of the absorbed and metabolized components of Danshen from Fuzheng Huayu recipe and study on the anti-hepatic fibrosis effects of these components

Ethnopharmacology

Fuzheng Huayu recipe (FZHY) was formulated on the basis of Chinese medicine theory in treating liver fibrosis. It has a significant efficacy against liver fibrosis caused by chronic hepatitis B, with the action mechanisms of inhibition of hepatic stellate cell activation, protection of hepatocyte oxidative injury and regulations of hepatic matrix remodeling etc.

Aim of the study

To identify the absorbed components and metabolites of Danshen in FZHY in rat serum, and find their active components for anti-liver fibrosis.

Material and methods

A valid high performance liquid chromatography–electrospray ionization ion trap mass spectrometry (HPLC-ESI/MSⁿ) method was established to investigate the absorbed and metabolized compounds of Danshen in FZHY in rat serum after oral administration. Mass spectra were acquired in both negative and positive modes. Otherwise, to evaluate the anti-hepatic fibrosis efficacies of absorbed and metabolized compounds, the LX-2 cell line of hepatic stellate cell (HSC), which was crucial cellular basis of fibrogenesis, was cultured and incubated with absorbed compounds, the cytotoxicity was determined with the cellomics Multiparameter Cytotoxicity Kit 1 by High Content Screening (HCS), the cell proliferation was assayed with EdU-DNA incorporation, and the cell activation was analyzed through α-smooth muscle actin (α–SMA) expression with high content screening technology.

Results

More than 11 compounds and 2 metabolites from Danshen were identified in the serum after oral administration of FZHY by comparing their mass spectra and retention behavior with reference compounds or literature data. Among these compounds, there were no obvious changes in nuclear morphology, membrane permeability with blow 96 μM of six polar compounds treatment in comparison with control cells, respectively. And the salvianolic acid B (6 μM, 48 μM), caffeic acid (6 μM, 48 μM) and rosmarinic acid (48 μM) could obviously inhibit LX-2 cells proliferation, down-regulate α–SMA expression.

Conclusion

The results proved that the established method could be applied to analyze the absorbed into blood compounds of Danshen after oral administration FZHY. These absorbed compounds included 11 compounds and 2 metabolites of Danshen. Among them, the salvianolic acid B, caffeic acid and rosmarinic acid were the effective components of FZHY to anti-hepatic fibrosis effects.     

扶正化瘀方对正常及肝纤维化大鼠体内CYP450酶的影响

使用Cocktail探针药物法,研究扶正化瘀方(FZHY)对正常和肝纤维化大鼠细胞色素P450(CYP450)5种同工酶的影响。正常和二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine,DMN)腹腔注射诱导的肝纤维化模型大鼠,以FZHY浸膏粉连续灌胃2周后,单剂量尾静脉注射由CYP450 5种同工酶的特异性探针底物非那西丁(CYP1A2)、甲苯磺丁脲(CYP2C9)、奥美拉唑(CYP2C19)、氢溴酸右美沙芬(CYP2D6)和咪达唑仑(CYP3A4)配置的Cocktail探针溶液后,通过建立的LC-MS/MS法同时检测血浆中5种探针药物的浓度,采用PK solution 2TM对数据进行处理,并计算主要药动学参数。正常大鼠灌胃FZHY后,非那西丁、甲苯磺丁脲、奥美拉唑和氢溴酸右美沙芬的AUC0-t均出现不同程度的增加,CL也均出现降低趋势,提示FZHY能明显抑制正常大鼠CYP1A2,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6的活性,但对CYP3A4的活性影响不明显;肝纤维化大鼠灌胃FZHY后,甲苯磺丁脲的AUC0-t显著增加,Vd显著降低,其他4种探针药物的药动学参数未见显著改变,提示在肝纤维化大鼠体内FZHY仅对CYP2C9有抑制作用,对CYP1A2,CYP2C19,CYP2D6,CYP3A4活性影响不明显。CYP450酶在肝纤维化条件下活性的改变可能是FZHY对正常和肝纤维化大鼠CYP450酶影响不同的原因。     

蛭元方对血小板加剧的类风湿关节炎滑膜炎症和增生的影响

目的:观察蛭元方对血小板加剧的类风湿关节炎( rheumatoid arthritis,RA)大鼠滑膜细胞炎症和增生反应的影响.方法:将常规培养的大鼠类纤维母样滑膜细胞株RSC364随机分为正常对照组、RA模型组、活化血小板干预组和蛭元方干预组.在不同浓度TNF-α诱发的大鼠RA滑膜细胞模型的基础上,以牛Ⅱ型胶原蛋白刺激血小板活化,用蛭元方含药血清作用于活化血小板干预下的RA模型细胞,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法分别检测RSC364细胞培养上清中白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)的生成量和P-选择素的表达情况,采用MTT比色法观察RSC364细胞增殖的情况.结果:①牛Ⅱ型胶原蛋白活化血小板5h时,血小板表达P-选择素最多;②在不同浓度肿瘤坏死因子-α(TNF-α)存在下,RA模型组RSC364细胞培养上清中IL-6和IL-8的生成量均增加,与同一浓度的正常对照组相比均有显著性差异(P＜0.05);RSC364细胞增殖率也明显高于正常对照组(P＜0.05),并呈现剂量依赖性;③与RA模型组相比,活化血小板干预组RSC364细胞生成IL-6和IL-8的量均明显增加(P＜0.05和P＜0.01),滑膜细胞增殖率显著升高(P＜0.05);④与血小板干预组相比,蛭元方干预组RSC364细胞的IL-6和IL-8生成量均显著降低(P＜0.05和P＜0.01),增殖率亦有明显下降(P＜0.05),同时P-选择素的表达量显著降低(P＜0.05).结论:活化血小板能加剧RA滑膜细胞的炎症和增生反应;蛭元方能有效缓解血小板对RA大鼠滑膜炎症及增生的促进作用,其机制可能与抑制P-选择素的表达有关.     

含耳叶牛皮消苷A血清的抗肿瘤作用实验研究

目的：研究含耳叶牛皮消苷A（AA）血清对肿瘤细胞的抑制作用及细胞形态变化。方法：选择SD大鼠,采用灌胃方式给予AA,待血药浓度到高峰时取血,MTT法确定含药血清对多种肿瘤细胞的生长抑制作用,并通过倒置显微镜和荧光显微镜观察细胞的形态学的改变。结果：含AA血清对多种肿瘤细胞均具有抑制作用,并在倒置显微镜和荧光显微镜下可以看到显著的细胞凋亡形态学变化。结论：经代谢后的AA血清仍具有抑制肿瘤细胞生长作用,且具有诱导肿瘤细胞凋亡的能力。     

丹红软肝胶囊药物血清对肝星状细胞增殖的干预作用

目的观察丹红软肝胶囊含药血清对肝星状细胞(HSC)增殖及分泌的相关细胞因子的干预作用。方法 15只SD大鼠按随机数字法分为3组,即丹红软肝胶囊组、复方鳖甲软肝片组和正常对照组,各5只,通过灌胃制备丹红软肝胶囊及复方鳖甲软肝片药物血清。将HSC-6细胞分为3组,分别加入含丹红软肝胶囊、复方鳖甲软肝片药物血清及正常小鼠血清的培养基,培养24 h后,采用噻唑蓝(MTT)法检测HSC的增殖率,收集培养上清,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测Ⅰ型胶原及转化生长因子β1(TGF-β1)的含量。结果丹红软肝胶囊组、复方鳖甲软肝片组吸光度(OD)值均低于正常血清对照组(P<0.01);丹红软肝胶囊组、复方鳖甲软肝片组HSC细胞增殖的抑制率比较差异无统计学意义(P>0.05)。丹红软肝胶囊组、复方鳖甲软肝片组培养上清中Ⅰ型胶原、TGF-β1的含量与正常血清对照组比较均降低(P<0.01);丹红软肝胶囊组、复方鳖甲软肝片组培养上清中Ⅰ型胶原、TGF-β1的含量比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论丹红软肝胶囊可抑制活化的HSC产生TGF-β1,并对HSC分泌胶原产生抑制作用,进而抑制HSC的增殖,这可能是其抗纤维化作用机制之一。     

抗纤复方对纤维肝大鼠肝细胞基底膜基质生成的影响

目的 :探讨抗纤复方对体外培养纤维肝大鼠肝细胞基底膜基质生成的影响。方法 :常规培养正常与 DMN纤维肝大鼠肝细胞 ,然后改用抗纤复方原液与抗纤复方药物血清温育肝细胞 48小时后 ,免疫组化 S-P法显色细胞纤维连接蛋白( FN)、层连蛋白 ( LM)和 IV型胶原蛋白 ( IV-C)的变化。结果 :正常肝细胞基底膜基质合成处于抑制状态 ,肝纤维化时肝细胞基底膜基质合成增加。抗纤复方能显著抑制纤维肝肝细胞 F N,L M及 IV-C的表达 ,抗纤复方药物血清效果优于原液。结论 :抗纤复方具有抑制 DMN纤维肝肝细胞基底膜基质的异常合成作用。     

Fuzheng Huayu recipe and vitamin E reverse renal interstitial fibrosis through counteracting TGF-β1-induced epithelial-to-mesenchymal transition

Aim

To investigate the mechanism of action of Fuzheng Huayu recipe (FZHY) and vitamin E (Vit E) against renal interstitial fibrosis related to transforming growth factor-beta1 (TGF-β1) mediated tubular epithelial-to-mesenchymal transition.

Materials and methods

Renal interstitial fibrosis was induced by administration of HgCl₂ at a dose of 8 mg/kg body weight once a day for 9 weeks. Rats were randomly divided into four groups: normal, model, FZHY, and Vit E group. Rats in the latter two groups were treated with the FZHY recipe and Vit E respectively. HK-2 cells were treated with TGF-β1 for 24 h, followed by incubation with either SB-431542 (a potent and specific inhibitor of TβR-I kinase) or FZHY drug-containing serum for another 24 h. Hyp content in rat kidney tissue was assayed with Jamall's method and collagen deposition in kidney was visualized using Masson stain. Protein expression of TGF-β1, TβR-I, Smad2, p-Smad2, Smad3, and p-Smad3 was analyzed by Western blotting. Protein expression and the location of Smad3 in kidney was assayed by immunohistochemistry, E-cadherin, cytokeratin 18 (CK-18), α-SMA and TGF-β1 by immunofluorescent stain.

Results

FZHY and Vit E inhibited renal collagen deposition and reduced Hyp content significantly. They upregulated E-cadherin protein expression and down-regulated the protein expression of α-SMA, TGF-β1, p-Smad2, p-Smad3, and TβR-I. Lastly, they inhibited the nuclear translocation of Smad3 in fibrotic kidney tissue. FZHY drug-containing serum significantly upregulated the expression of CK-18 and down-regulated the expression of α-SMA, TβR-I, p-Smad2/3 in TGF-β1 stimulated HK-2 cells.

Conclusion

The mechanism of action of FZHY and Vit E against renal interstitial fibrosis is related to the reversal of tubular EMT induced by TGF-β1.