乙型肝炎病毒拉米夫定耐药毒株的全基因质粒构建及其在HepG2细胞中复制与表达

目的 探讨拉米夫定耐药变异对病毒复制及抗原表达的影响.方法 通过定向点突变方法,成功的在模板质粒P3.8Ⅱ基础上构建成功3种P基因变异株质粒,并转染HepG2细胞,与HBV野毒株相比,分析变异毒株复制表达活性的差别.结果 经DNA测序证实,成功构建了rtG172E、rtG174C、rtG172E/rtG174C等3种变异株质粒,转染细胞系后发现上清均表达有HBsAg和HBeAg,证明转染质粒在细胞内成功表达并分泌HBsAg和HBeAg.通过检测细胞内复制产生的子代HBVDNA发现,rtG172E、rtG174C、rtG172E/rtG174C等3种变异株的复制活性均有明显减弱.结论 新发现的3种P基因变异株会影响HBV复制活性,对药物敏感性的影响需进一步研究.     

拉米夫定耐药者乙肝病毒P基因区的突变分析

目的 研究拉米夫定耐药者乙肝病毒P基因区的突变情况.方法 应用基因芯片技术对78例拉米夫定临床耐药者和12例未经拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者进行P基因区180位点和204位点变异的检测.结果 78例拉米夫定临床耐药者中发生P基因区变异者共有57例,rtL180M 单独变异占12.3%(7/57);204位点变异(YMDD变异)率为64.1%(50/78),其中rtM204Ⅰ占28.1%(16/57), rtL180M/M204Ⅰ占15.6%(9/57),rtL180M/M204Ⅴ占35.1%(20/57),rtM204Ⅰ/Ⅴ占5.3%(3/57),rtL180M/M204Ⅰ/Ⅴ占3.5%(2/57).12例未经拉米夫定治疗的患者,其中1例发生P基因区变异.结论 拉米夫定临床耐药者体内存在P基因区180位点和204位点的变异,且联合变异率较高.     

拉米夫定耐药慢性乙型肝炎患者HBV P基因区突变序列分析

目的 探讨拉米夫定耐药慢性乙型肝炎(CHB)患者HBV P基因逆转录酶区(RT区)序列突变特点.方法 收集115例接受拉米夫定治疗的CHB患者的临床资料,采用PCR产物直接测序法检测HBV P基因RT区序列耐药变异.结果 人选的115例患者中103例检测到拉米夫定基因型耐药变异,最主要的耐药变异模式为rtL180M rtM204V和rtM204I,分别占58.3％和22.3％,其他耐药位点包括rtL80V/I、rtT184S和rtA200V,并在5例患者中检测到RT区3个位点的联合变异.结论 对拉米夫定治疗患者的耐药检测除了HBV P基因区常见的rtL180和rtM204位点变异外,还应考虑其他位点的联合耐药变异.     

拉米夫定治疗53例HBV基因型对乙型肝炎患者P基因突变的影响

目的 探讨HBV基因型与拉米夫定耐药者P基因突变的关系.方法 53例慢性乙型肝炎(CHB)患者经拉米夫定治疗每天100 mg,并于治疗前及治疗后3、6、12、15、18、24个月监测肝功能、HBV M、HBV DNA、HBV基因型及YMDD变异.结果 (1)B基因型占56.60%(30/53),C基因型占41.51%(22/53);(2)在CHB重度及肝硬化病例中C基因型的检出率高于B基因型(P＜0.05);(3)拉米夫定治疗后C基因型较B基因型更易发生YMDD变异(P＞0.05);(4)B基因型主要发生rtM204I位点突变(62.5%,5/8),而C基因型则主要发生rtL180M/M204V突变(77.78%,7/9).结论 (1)遵义地区的HBV基因型主要由B、C基因型构成;(2)拉米夫定治疗后C基因型更易发生YMDD变异.     

聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性技术检测乙型肝炎病毒P基因区YMDD基因序列变异

目的建立检测基因变异的聚合酶链反应(PCR)限制性片段长度多态性(Restrictionfragmentlengthpolymophism,RFLP)法。方法从服用拉米夫定1年以上的慢性乙肝病例中选取10例抽取血清,分别采用错配套式PCR-RFLP技术、PCR产物直接测序和重组克隆测序,检测P基因YMDD变异。结果在10个病例中,PCR-RFLP检测到7例为野毒株、1例为混合株感染、2例为变异株;PCR产物直接测序,9例为野株、1例为变异株;对2份用PCR-RFLP法检测为非野株,而PCR测序为阴性的标本采用克隆后测序,发现均为混合株感染。结论通过对几种检测方法的对比,认为克隆后测序的结果最精确;而从实用性和经济角度来看,采用PCR-RFLP进行初步筛检的方法具有更大的意义,值得推广。     

替比夫定抗病毒治疗不同时间慢性乙型肝炎患者HBV P基因RT区序列突变模式及耐药率的改变

目的：通过研究替比夫定治疗不同时间慢性乙型肝炎患者HBV P基因RT区序列突变模式及耐药率的改变,探讨替比夫定的主要耐药变异模式及耐药率。方法：应用重组克隆测序检测法检测47例接受替比夫定治疗1、2、5年的慢性乙型肝炎患者HBV P基因区序列。结果：应用替比夫定治疗1年者有2例（4.26%）出现常见变异位点,P基因区突变模式均为rtM204I;治疗2年者有10例（21.28%）出现变异位点,9例突变模式为rtM204I,1例突变模式为rtL180M+rtM204I;治疗5年者有24例（51.06%）检测到替比夫定常见变异位点,16例（66.7%）变异模式为rtM204I、4例（16.7%）为rtL180M+rtM204I,另外还有rtL181V+rtM204I、rtM204V、rtM204I+rtN238H、rtL180M +rtM204I+rtD263E各1例。结论:替比夫定的主要耐药变异模式为rtM204I和rtL180M+rtM204I。替比夫定治疗1、2、5年的耐药率分别为4.26%、21.28%和51.06%。提示替比夫定的5年耐药率明显低于拉米夫定的4年耐药率,但替比夫定的耐药率高于阿德福韦酯。     

江苏徐州地区慢性乙型肝炎病人HBV耐药突变分析

目的分析徐州地区慢性乙型肝炎(CHB)病人乙型肝炎病毒(HBV)基因型及耐药变异位点的分布特点。方法收集2013年5月—2013年11月在我院就诊的门诊及住院CHB病人216例,采用核酸扩增技术结合荧光标记探针杂交方法检测病人血清HBV DNA,通过测序分析检测病人血清中的HBV基因分型及耐药变异位点。结果本组216例病人中,HBV基因C型207例(95.83%),B型9例(4.17%);病毒变异的85例,无变异的131例,变异率为39.35%;变异位点有rtV173、rtL180、rtA181、rtT184、rtS202、rtM204、rtV207、rtS213、rtV214、rtQ215、rtN236、rtN238。各突变位点中,rtM204和rtL180位点的突变检出率较高,分别为21.30%和13.89%。与拉米夫定、阿德福韦酯、替比夫定耐药相关的病毒基因位点的突变检出率分别为29.63%、20.37%、12.96%。结论徐州地区HBV基因型分布以C型多见,突变株占检测病毒株的39.35%;与拉米夫定和阿德福韦酯耐药相关的基因位点突变检出率相对较高,与恩替卡韦耐药相关的基因位点突变检出率相对较低。     

拉米夫定治疗后乙肝病毒发生YMDD变异的研究

目的 观察拉米夫定治疗后乙肝病毒发生YMDD变异情况。方法 87例慢性乙肝患者分成两组，一组51例接受拉米夫定及保肝治疗，另一组36例做为对照组只给予保肝治疗，治疗1年后对患者HBV多聚酶基因YMDD基序进行定性检测，观察是否有突变。结果 拉米夫定治疗组在用药1年后有8例发生YMDD突变，其中YIDD变异有5例，YVDD变异3例，变异株中有5例伴HBV DNA、ALT水平升高，而对照组无变异株产生。结论 拉米夫定可诱导HBV多聚酶基因(P基因)YMDD基序发生基因突变，而导致耐药株的产生。     

拉米夫定治疗期间患者体内HBV-DNA聚合酶基因变异的分析

目的：了解接受拉米夫定(Lamivudine)治疗的慢性乙型肝炎患者体内HBV-P基因的变异特点及规律，提高抗HBV的治疗效果。方法：①选择50例服用拉米夫定(100mg／d)的慢性乙型肝炎患者，采集13例服药48周时HBV-DNA检测阳性患者的外周血，提取HBV—DNA，用聚合酶链反应(PCR)技术扩增后直接测序，分析HBV-P基因的酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YMDD)基序变异情况，同时用基因芯片方法进行验证。②用逆向追踪方法对上述13例HBV-DNA阳性患者服药前和服药36周时血清标本中扩增的HBV-P基因片段进行测序及HBV-DNA定量的检测。同时对50例患者服药前、服药12、24、36和48周时的丙氨酸氨基转移酶(ALT)进行检测，观察对比发生YMDD变异者及非变异者、ALT的变化情况。结果：①拉米夫定治疗48周结束时，13例HBV-DNA检测阳性的患者中有5例外周血中HBV-P基因发生YMDD变异，其中2例为YVDD变异，伴L528M变异；3例为YIDD变异。②所有YMDD变异均发生于用药36周以后，变异率为10％，基因芯片检测结果与测序完全符合。③除了YMDD外，还发现了若干其他的变异位点，如1例伴有N482E、N487K、V521L、T532S和S561T突变；1例伴有T466N、N469I、Y472N、G475R、D479N和DM82N突变；1例伴发Q473K突变；3例伴发M477L突变。④13例HBV—DNA阳性的患者中共有8例在服药48周时HBV-DNA定量较服药前增高，其中5例为YMDD变异者。50例慢性乙肝患者中有5例48周时的ALT水平高于服药前，其中4例发生了YMDD变异。结论：拉米夫定可以诱导HBV-P基因的YMDD变异，变异者较非变异者临床疗效差，发生P基因区的YMDD变异是耐药的主要原因之一。     

乙型肝炎病毒耐药变异与基因型检测在临床上的应用

目的 建立直接测序法检测HBV P区耐药变异情况并分析基因型.探讨HBV基因型与临床病情的关系.方法 检测46例乙肝患者血清样本,采用特异的引物对待检标本HBV P区进行PCR扩增后作基因序列检测,利用Chromas2.23软件对测序结果 进行分析有无突变产生,测序结果 用软件clustalx1.81进行基因分型分析.结果 可通过一次测序反应完成对HBV.DNA P区的基因检测及基因型分析.检出YMDD变异株8例,其中YIDD 5例,YVDD 3例.在检测的46例标本中23例为B基因型,阳性率为50.0%;有21例为C基因型,其阳性率45.6;D基因型2例,阳性率4.4%.B基因型HBV感染者中HCC 2例,占8.7%;C基因型HBV感染者中HCC 8例,占38.1%.结论 直接测序法分析HBV常见耐药突变位点及基因型准确可行,B基因型乙肝患者预后优于C基因型患者.     

应用错配PCR和限制性片段长度多态性分析技术检测HBV YMDD变异株

目的：建立简便易行的检测乙型肝炎病毒（HBV）多聚酶基因（P基因）上YMDD变异株的方法，评价运用拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患对此变异的影响，方法：采用套式／错配聚合酶链反应（PCR）结合限制性片段长度多态性（RFLP）分析技术对108例治疗前HBV DNA（PCR）阳性正在拉米夫定治疗中的慢性乙型肝炎患者的HBV YMDD变异情况进行检测。结果：运用上述技术能有效区分HBV YMDD野生株和变异株，上述108例患者经拉米夫定治疗后，HBV DNA阴转者63例（58．3％），HBV YMDD野生株和变异株分别为23例（21．3％）和22例（20．4％），结论：建立的套式／错配PCR－RFLP分析技术可用于HBV YMDD变异株的临床监测，拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患者可导致部分患者的HBV多聚酶基因上YMDD发生变异。     

拉米夫定治疗中乙型肝炎病毒YMDD变异的研究

目的观察拉米夫定治疗慢性乙型盱炎后乙型肝炎病毒YMDD基序变异的情况。方法105例慢性乙型肝炎患者随机分成两组，一组68例为治疗组给予拉米夫定；另一组37例为对照组，给予除拉米夫定外的其他治疗。治疗1年后对患者乙型肝炎病毒多聚酶基因YMDD基序进行定性检测，观察突变情况。结果拉米夫定治疗组：用药1年后有12例发生YMDD突变，其中YVDD变异有8例，YIDD变异4例，变异株中有9例伴血清ALT、HBV-DNA水平回升；对照组无变异株产生。结论拉米夫定可诱导乙型肝炎病毒YMDD基序发生变异，导致耐药株的产生。     

拉米夫定对乙型肝炎病毒DNA复制及基因变异的影响

目的:研究拉米夫定治疗慢性乙型肝炎(CHB)的疗效、乙型肝炎病毒(HBV)DNA P基因变异特点及编码蛋白质的二级结构.方法:提取HBV DNA后,半巢式聚合酶链反应(PCR)扩增,PCR产物自动测序.总结拉米夫定的疗效、P基因变异出现的时间,用SAS软件分析影响疗效的因素.用DNA STAR软件的CLUSTAL V方法对HBV DNA P基因片段的核苷酸和氨基酸差异、变异类型进行分析.用DNAclub,DNAsis软件分析出现P基因变异前后所编码的蛋白质的二级结构的差异.结果:在治疗后6个月血清标本中未发现YMDD变异,在治疗后12个月血清标本中发现2例YMDD变异.在对照组中发现了1例L528M变异;在治疗后12个月发现了2例YVDD变异,2例只有L528M的变异.在发生变异后,YMDD的转角结构变为折叠,L528M的转角结构没变.结论:1年的拉米夫定治疗可以有效抑制HBV DNA的复制.YMDD变异发生在拉米夫定治疗6个月之后,L528M变异可单独在体内存在,未接受抗病毒治疗的慢性HBV携带者可发生L528M变异.发生YMDD变异的P基因编码的蛋白质二级结构由转角变为折叠.L528M变异不影响蛋白质二级结构.     

拉米夫定耐药HBV毒株伴随变异与YMDD变异的关系

目的研究拉米夫定耐药（LAMr）HBV毒株伴随变异及其与YMDD变异的关系。方法PCR方法扩增LAMr病人血清的HBVRT区基因，直接测序PCR产物。对测序发现含有LAMr变异的105例病人血清检测变异时HBVDNA载量，分为第1组含rtV173L／M或rtV207M／L／I变异、第2组含rtS213T变异、第3组不含此3种变异，共3组进行分析。结果①拉米夫定（LAM）治疗B、C基因型乙型肝炎病毒（HBV）感染的慢性乙型肝炎（CHB）病人耐药主要变异位点为YMDD变异，可以伴随rtL180M、rtV173L／M、rtV207M／L／I、rtS213T等变异，LAMr变异形式构成与基因型无关（P=0．2620）。②rtM204I、rtM204V、rtM204V／I变异分别有38．8％、89．2％、73.3％伴随其它位点变异（P〈0．0001）。③3组测序发现变异时HBVDNA载量分别为（7．43±0．16）log10拷贝／mL、（5．01±0．90）log10拷贝／mL、（5.75±0．34）log10拷贝／mL（F=4．48，P=0．0240）。结论LAM治疗B、C基因型HBV感染的CHB病人耐药变异形式构成无显著差异，rtM204V变异较rtM204I变异更易伴随其它位点变异，伴随变异rtV173L／M、rtV207M／L／I可以增强YMDD变异HBV毒株的复制能力。     

实时荧光PCR检测乙肝病毒YMDD变异的临床应用

目的 :探讨实时荧光 PCR检测 HBV YMDD变异价值。方法 :比较实时荧光 PCR法与 PCR产物直接测序的结果 ,以评价该方法的准确性 ,同时测定 10 3例拉米夫定治疗不同时期的患者血清 ,分析各时期的变异率及临床资料。结果 :19例标本的实时荧光 PCR结果与 PCR产物测序结果完全一致。10 3例患者中 13例发生 YMDD变异 ,治疗 7个月～ 12个月 YMDD变异率为 15 .2 % (5 /33) ,治疗 1a以上 YMDD变异率为 33.3% (8/2 4 )。变异患者与非变异患者体内的病毒量差异无显著性 ;变异患者 AL T异常发生率高于非变异患者 ,但升高程度不如部分非变异患者 ;变异患者保护性抗体的出现率较低。结论 :实时荧光 PCR检测 YMDD变异是一种准确、灵敏、经济、简便、快速并适合大批量标本检测的方法     

HBV耐拉米夫定多聚酶基因变异检测方法的建立

目的 建立一种简便，准确，实用的乙型肝炎病毒（HBV）耐拉米夫定多聚酶基因变异检测方法。方法 根据已公布的HBVDNA序列，在HBV多聚酶基因区设计并合成了两对寡核苷酸引物，其中一只为错配引物；应用巢式错配聚合酶链反应特异性扩增含有HBV多聚酶基因YMDD基序的片段，扩增产物用限制性内切酶（NdeⅠ）酶切，琼脂糖凝胶电泳，观察酶切后的目的片段限制性片段长度多态性（RFLP）图谱，部分标本进行DNA测序，结果 （1）所建立的巢式错配PCR-RFLP方法操作简便，快速，从DNA提取到酶切后电泳分析仅需要11小时；灵敏度高，可以检测到10^3copies/ml的HBVDNA；特异性强，结果准确，经DNA测序证实，（2）应用该方法对20例长期服用拉米夫定的慢性乙型肝炎患者的系列血清进行了检测，发现YMDD变异者（45%）9例，YMDD野毒株者（55%）11例，表明该方法可有效地鉴别HBVYMDD野毒株与变异株，结论 本实验所建立的巢式错配PCR-RFLP方法简单，敏感，特异，适合于一般实验室应用及大规模的人群调查。     

非抗病毒治疗相关的慢性乙型肝炎患者YMDD变异研究

目的：了解未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患乙型肝炎病毒基因YMDD变异及其与前C区变异、HBV基因型的相关性，HBV DNA水平与变异发生的关系。方法：从126例均未接受拉米夫定治疗和近一年内未经任何抗病毒治疗的慢性乙肝患随机抽取25例为研究对象。血清YMDD变异检测运用微板核酸杂交—核酸定量法，HBV基因型采用PCR微板核酸杂交—ELISA技术，HBVDNA定量采用荧光定量PCR分析系统，HBV—M采用ELISA法。结果：7例存在YMDD变异，变异HBeAg全部阳性，不同的HBV基因型形式存在不同的YMDD变异率，HBVDNA水平与YMDD变异的发生不呈正相关。结论：HBV存在YMDD野生变异株，并非完全由抗病毒治疗引起，变异株与前C区变异和HBV基因型的相关性以及HBV DNA水平和变异发生的关系有待进一步研究。     

拉米夫定治疗慢性乙型肝炎发生病毒学反弹患者YMDD变异分析

选取402例服用拉米夫定后出现乙型肝炎病毒(HBV)DNA反弹的慢性乙型肝炎(CHB)患者血清样品,应用荧光PCR法定性检测YMDD变异情况。402例中有309例(76.87%)检测出YMDD变异,其中120例为YVDD变异,74例为YIDD变异,115例为YVDD+YIDD联合变异;309例YMDD变异患者中同时检测出变异株与野生株占69.26%(214/309),仅检测出变异株占30.74%(95/309)。另外,93例为YMDD野生型阳性。