己酮可可碱对高糖时人肾小球系膜细胞单核细胞趋化蛋白-1表达的影响

目的 探讨高糖对人肾小球系膜细胞单核细胞趋化蛋白1(nonocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)表达的影响及己酮可可碱(pentoxifylline,PTX)对其干预作用.方法 将培养的人肾小球系膜细胞分为6组:正常对照组、高糖组、甘露醇组、PTX甲组、PTX乙组、PTX丙组,分别在24、48和72 h采用RT-PCR法和ELISA法检测PTX对高糖条件下系膜细胞内MCP-1mRNA及蛋白、细胞外基质纤维连接蛋白(fi-bronectin,FN)表达的影响.结果 高糖组人肾小球系膜细胞MCP-1mRNA及蛋白、FN的表达较正常对照组明显增加(P<0.01);己酮可可碱各组比高糖组有明显下降(P<0.01);不同浓度的己酮可可碱对高糖诱导的系膜细胞MCP-1的表达抑制程度不同(P<0.05).结论 己酮可可碱可抑制高糖诱导的人肾小球系膜细胞MCP-1的表达以及FN的分泌,呈时间、剂量依赖关系,己酮可可碱可能对糖尿病肾病的防治起到有益的作用.     

高糖诱导的MAPK激活对人肾小球系膜细胞的影响

目的：探讨高精对人肾小球系膜细胞丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)活性的影响及MAPK在人肾小球系膜细胞的纤维结合蛋白(FN)分泌和c-fos表达中的作用。方法：采用人肾小球系膜细胞进行体外培养，高精作为刺激因素，PD98059作为MAPK特异性抑制剂．同位素示踪法测定MAPK活性．ELISA法测定培养上清中FN含量，免疫细胞化学方法检测c-fos的表达．结果：高糖可增加MAPK活性、促进FN分泌、增加c-fos的表达、抑制MAPK后，可阻止高糖诱导的FN分泌以及c-fos表达：结论：高糖可激活人肾小球系膜细胞内的MAPK，促进FN的分泌，c-fos的表达及导致糖尿病肾病的发生。     

高糖对人肾小球系膜细胞细胞间黏附分子-1及层黏连蛋白表达的影响

目的 探讨高糖对人肾小球系膜细胞表达细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,I-CAM-1)及层黏连蛋白(laminin,LN)的影响.方法 将培养的人肾小球系膜细胞分为正常糖对照组、高糖组和甘露醇对照组,分别在24、48、72 h收集培养液上清,采用ELISA法检测上清液中ICAM-1和LN的表达.结果 人肾小球系膜细胞表达ICAM-1在24 h开始升高,48 h达高峰,72 h下降.LN表达呈时间依赖性.且高糖组ICAM-1及LN的表达显著高于正常糖对照组及甘露醇组(P<0.05),正常糖对照组与甘露醇组对比ICAM-1及LN的表达差异无显著性(P>0.05).结论 高糖可导致人肾小球系膜细胞ICAM-1及LN表达增加.I-CAM-1对肾脏可能具有炎性损伤作用,LN的增加表明肾小球系膜外基质的过度表达.二者均可促进糖尿病肾病的发生发展.从而为糖尿病肾病的治疗提供了新靶点.     

Smad4反义寡核苷酸对高糖培养的人肾小球系膜细胞分泌纤连蛋白、层黏连蛋白的影响

目的 观察Smad4反义寡核苷酸(antioligodeoxynucleotide,antiODN)对体外高糖培养的人肾小球系膜细胞(human glomerular mesangial cells,HGMC)分泌纤连蛋白(fibronectin,FN),层黏连蛋白(laminin,LN)的影响.方法 用脂质体法将正义、反义、错义Smad4寡核苷酸瞬时转染体外培养的HGMC,并进行高糖培养,同时设立正常糖组、高糖组、甘露醇组、脂质体组为对照组,用ELISA法检测培养上清液中FN、LN的含量,进行统计学分析.结果 转染Smad4反义寡核苷酸的HGMC分泌的FN、LN量与正常对照组相比无统计学意义(P>0.05),而与高糖组、正义组、错义组相比差异有统计学意义(P<0.01).结论 随着高糖作用的时间延长,体外培养的HGMC分泌的FN、LN量逐渐增加,而转染Smad4 antiODN可以抑制高糖的刺激,减少FN、LN的表达,从而减少系膜细胞细胞外基质的堆积,为延缓肾脏纤维化提供了新的途径.     

益肾化浊注射液对高糖培养肾小球系膜细胞表达FN及PAI-1 mRNA的影响

观察高糖对体外培养肾小球系膜细胞表达纤维连接蛋自 (FN)、纤溶酶原激活物抑制物(PAI 1)mRNA以及细胞增殖、分泌FN的影响 ,同时观察益肾化浊注射液对高糖引起上述各指标变化的影响。采用体外培养肾小球系膜细胞方法 ,用高糖及益肾化浊注射液作为刺激物 ,四甲基偶氮唑盐微量酶比色法 (MTT)检测细胞增殖 ,酶联免疫吸附测定法 (ELISA)测定细胞上清FN含量 ,Northem杂交检测FN、PAI 1mRNA表达水平。结果表明 ,高糖可促进分泌FN ,上调PAI 1mRNA的表达 ,明显抑制系膜细胞的增殖 ;而益肾化浊注射液可缓解高糖所引起的上述指标的改变 ,并可下调FNmRNA的表达。     

低分子肝素对肾小球系膜细胞产生细胞外基质的影响

[目的]了解不同葡萄糖浓度环境下,低分子肝素对人系膜细胞表达纤维连接蛋白(FN)和IV型胶原作用。[方法]培养人肾小球系膜细胞,分为正常葡萄糖组、高葡萄糖组及加低分子肝素组,培养24、48 h收集细胞上清液,用酶联免疫法检测FN和IV型胶原。[结果]高糖组24和48 h FN分别为(1.552±0.546)ng/mL和(2.547±0.968)ng/mL明显高于正常糖组(0.777±0.076)ng/mL和(1.180±0.091)ng/mL(P<0.01);IV型胶原分别为(64.577±5.543)ng/mL和(80.140±6.605)ng/mL,明显高于正常糖组(42.468±5.615)ng/mL和(46.368±5.714)ng/mL(P<0.01)。在低分子肝素1 ng/mL的作用下,高糖组的FN24 h及FN48 h分别降低为(1.070±0.349)ng/mL及(1.918±0.074)ng/mL,IV型胶原24 h及IV型胶原48 h分别降低至(41.993±7.470)ng/mL及(40.490±4.377)ng/mL。低分子肝素提高至10 ng/mL时,高糖组的FN24 h及FN48 ...     

高糖诱导下人肾小球系膜细胞AMPK、MPO、α-SMA的变化以及α-硫辛酸的干预作用

目的 探讨高糖诱导下人肾小球系膜细胞(HMCs)中腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、炎症反应指标、细胞外基质的变化及α-硫辛酸的干预作用.方法 传代培养的HMCs同步化后分组:正常对照组、高糖组、甘露醇对照组、高糖+α-硫辛酸处理组(α-硫辛酸浓度分别为50、100和200μmol/L),于实验0、12、24、48和72 h收集各组细胞及上清液,采用RT-PCR法和ELISA法检测各组细胞中AMPK mRNA及上清液中AMPK、髓过氧化物酶(MPO)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的含量.结果 高糖组人肾小球系膜细胞AMPK mRNA及AMPK蛋白的表达较正常对照组明显下降(P＜0.01),MPO、α-SMA蛋白的表达明显增加(P＜0.01).α-硫辛酸各处理组AMPK mRNA及AMPK蛋白表达比高糖组有明显增加(P＜0.01),MPO、α-SMA蛋白的分泌较处理前明显降低(P＜0.05).结论 高糖能够抑制人肾小球系膜细胞中AMPK的表达,诱导MPO(炎症反应指标)、α-SMA(系膜细胞活化从而分泌细胞外基质增多的指标)的表达,抗氧化剂α-硫辛酸可以上调高糖抑制的AMPK的表达,减少高糖刺激下HMCs中MPO、α-SMA蛋白的分泌,为糖尿病肾病的防治提供新的理论依据.     

高糖对人肾小球系膜细胞TGF-β1 mRNA表达的影响及茶多酚对其干预作用

目的 :探讨高糖对人肾小球系膜细胞转化生长因子 β1 (TGF β1 )mRNA表达的影响及茶多酚的干预作用。方法 :运用RT PCR法检测 ,TGF β1 在空白对照组、高糖组、茶多酚干预组和茶多酚对照组中 0、12、3 6h的表达情况。结果 :高糖组TGF β1mRNA在 3个时间点的吸光度值分别为 0 .3 3 0± 0 .0 14、0 .5 49± 0 .0 2 7、0 .761± 0 .0 3 2 ,与对照组相比有显著差异 (均P <0 .0 1) ,且3 6h比 12h变化显著 (P <0 .0 1) ;茶多酚干预组分别为 0 .3 3 0± 0 .0 14、0 .3 85± 0 .0 45、0 .5 41± 0 .0 44 ,各时点均低于高糖组 (均P<0 .0 1) ,而与对照组无明显差异 (均P >0 .0 5 )。结论 :高糖可导致人肾小球系膜细胞TGF β1 mRNA表达的增加 ,而茶多酚可有效干预此效应。     

两种不同状态系膜细胞的培养及其功能研究

目的　比较糖尿病大鼠成模后的系膜细胞与高糖刺激下的系膜细胞在功能上的异同 ,并探讨用体外培养的成模后系膜细胞研究糖尿病肾病的可行性及优越性。方法　将 2 0只 Wistar大鼠随机分成糖尿病成模组和正常组 ,每组各 10只。糖尿病成模组先采用链脲佐菌素复制糖尿病模型 ,然后再进行系膜细胞体外培养 ;正常组大鼠的系膜细胞又分为高糖组和正常对照组两个亚组 ,高糖组采用高糖刺激系膜细胞 ,正常对照组为常规培养基培养。分别对三组细胞用 3 H - Td R摄入法测定细胞增殖 ,EL ISA法测定纤维连接蛋白 (FN)分泌 ,用共聚焦显微镜检测胞内〔Ca2 +〕 i及对血管紧张素 的反应。结果　糖尿病成模组系膜细胞 3 H - Td R掺入率高于正常对照组 ,高糖组系膜细胞 3 H- Td R掺入率低于正常对照组 (P<0 .0 5 ) ;糖尿病成模组及高糖组系膜细胞分泌 FN量均较正常对照组增加 (P分别 <0 .0 1和 <0 .0 5 ) ,且糖尿病成模组系膜细胞分泌 FN量虽高于高糖组 ,但无统计学意义 (P >0 .0 5 ) ;糖尿病成模组及高糖组系膜细胞胞内〔Ca2 +〕i对血管紧张素 的反应都减弱 ,且前者更为明显。结论　先建立糖尿病模型再培养的系膜细胞在功能和生物学性状方面更接近于糖尿病体内系膜细胞     

高糖对培养的肾小球系膜细胞产生t-PA及与其结合的影响

目的 观察高糖状态下系膜细胞与组织型纤溶酶原激活物（Tissue plasminogen,t-PA）结合力及系膜细胞产生t-PA活性改变与纤维连接蛋白（Fibromectin,FN）产生的影响。方法 采用体外人肾小球系膜细胞培养，放射性核素标记法测定系模细胞与t-PA结合力，纤维蛋白酶谱法检测t-PA活性，酶联免疫分析检测FN。结果 高糖可抑制系膜细胞与t-PA结合力，同时t-PA活性增加，FN产生明显增多，并随着培养时间的延长，葡萄糖愈高，作用愈明显。结论 高糖致系膜细胞与t-PA结合力下降，t-PA活性增加，同时可能其抑制物明显增多，导致细胞外基质积聚，可能是糖尿病肾小球坚硬是化发生的重要原因之一。     

表没食子儿茶素没食子酸酯对高糖培养的系膜细胞糖原合成酶激酶-3β和细胞外基质合成的影响

目的观察高糖对大鼠肾小球系膜细胞（GMCs）糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）及细胞外基质成分（ECM）的影响及表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的干预效果。方法以大鼠GMCs为实验对象,培养48h后,用四甲基偶氮唑蓝（MTT）测定GMCs增殖情况,Western blot法测定GSK-3β蛋白表达,酶联免疫吸附实验（ELISA）检测高糖条件下细胞培养液中细胞外基质成分纤维连接蛋白（FN）、Ⅳ型胶原（ColⅣ）及层粘连蛋白（LN）的含量。结果高糖明显诱导GMCs增殖并抑制GSK-3β磷酸化,EGCG和GSK-3β特异性的抑制剂TDZD-8均能抑制高糖诱导的细胞增生,并增加GSK-3β磷酸化水平。高糖环境下系膜细胞分泌的FN、ColⅣ及LN明显增加（P〈0.05）,EGCG能抑制上述作用。结论EGCG通过GSK-3β信号通路抑制高糖诱导的GMCs增殖,并能抑制GMCs细胞外基质的合成,从而延缓糖尿病肾小球肥大和肾小球硬化。     

高糖通过血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶1通路促进人系膜细胞合成纤连蛋白

目的研究血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶1(SGK1)在高糖诱导人肾小球系膜细胞(HMC)产生纤连蛋白(FN)中的作用,探讨SGK1在糖尿病肾病(DN)肾小球硬化中的作用机制。方法将带有SGK1显性激活型突变体质粒(PIRES2EGFPS422DSGK1mutant,SD)瞬时转染HMC;同时,设空质粒(PIRES2EGFP,FP)转染组和未转染组(NT)为对照。分别用正常糖(NG,5.5mmol/LD葡萄糖)和高糖(HG,25mmol/LD葡萄糖)刺激8h后,采用RTPCR方法和Western印迹方法来观察SGK1和FN的mRNA及蛋白的表达。结果高糖环境下,转染SD的HMC与转染FP、NT组比较,其SGK1mRNA表达显著性增高(0.704vs0.497,0.491,P<0.01),SGK1蛋白过度活化(1178497vs193875,195597,P<0.01),其FNmRNA和蛋白的表达显著性的增加(0.749vs0.463,0.475,P<0.01;659550vs342354,340428,P<0.01)。结论在糖尿病肾病中,高糖可以通过SGK1介导的信号通路来诱导人肾小球系膜细胞增加合成FN,这种新发现的信号通路,表明SGK1可能参入糖尿病肾病肾小球纤维化的发生。     

RNA干扰下调Gremlin表达对高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞分泌FN、ColⅣ的影响

目的探讨在高糖培养条件下,应用慢病毒介导的RNA干扰下调Gremlin表达对大鼠肾小球系膜细胞(RMCs)分泌纤维连接蛋白(FN)、Ⅳ型胶原(ColⅣ)的影响及机制。方法构建Gremlin基因特异性的短发夹双链RNA(shRNA)慢病毒GREM1-RNAi-LV,感染RMCs后,分为5.5 mmol/L葡萄糖组、30 mmol/L葡萄糖组、30 mmol/L葡萄糖+GREM1-RNAi-LV组及30 mmol/L葡萄糖+NC-GFP-LV(感染携带绿色荧光蛋白的阴性对照慢病毒)组,分别处理48 h,RT-PCR检测Gremlin mRNA表达,Western Blot检测Gremlin蛋白表达,ELISA法检测细胞上清FN、ColⅣ蛋白表达变化。结果与5.5 mmol/L葡萄糖组相比,30 mmol/L葡萄糖组Gremlin mRNA和蛋白水平显著升高(P均<0.05),细胞外基质分泌FN、ColⅣ蛋白增加(P均<0.05),而RNA干扰能下调高糖诱导的Gremlin mRNA与蛋白高表达(P<0.05),降低细胞外基质FN、ColⅣ蛋白分泌(P<0.05)。结论慢病毒介导的RNA干扰可明显抑制高糖诱导的Gremlin高表达,降低细胞外基质分泌,改善肾脏纤维化,可能是一个预防和治疗糖尿病肾病新型的潜在靶点。     

贝前列素钠对高糖条件下大鼠系膜细胞细胞外基质代谢的影响

目的探讨前列环素类似物贝前列素钠（BPS）对高糖条件下大鼠系膜细胞细胞外基质代谢的影响及其可能的机制。方法
将实验分为对照（NG）组、高糖（HG）组和高糖联合不同浓度BPS组（0.5、1、2、5 μmol/L）。体外培养系膜细胞,收集24、48 h时细
胞培养上清液,Elisa法测转化生长因子β1（TGFβ1）、纤维连接蛋白（FN）及基质金属蛋白酶-2（MMP-2）蛋白的表达;提取细胞总
蛋白,免疫印迹法测Smad3磷酸化蛋白的表达。结果与NG组相比,HG培养24及48 h细胞TGFβ1、FN蛋白表达均显著增加
（P<0.01）,MMP-2蛋白表达量显著下降（P<0.01）;细胞培养24、48 h后,与HG组相比,HG+1 μmol/L BPS组、HG+2 μmol/L BPS
组及HG+5 μmol/LBPS组细胞TGFβ1蛋白表达量均显著降低（P<0.01）;HG+2 μmol/L BPS组、HG+5 μmol/L BPS组细胞FN蛋
白表达量均显著降低（P<0.01）;HG+2 μmol/L BPS组及HG+5 μmol/L BPS组细胞MMP-2蛋白表达量均显著增加（P<0.05）;HG
组细胞Smad3 磷酸化蛋白表达较NG组显著增加（P<0.01）;与HG组相比,HG+2 μmol/L BPS组与HG+5 μmol/L BPS组细胞
Smad3蛋白磷酸化水平显著下降（P<0.05）。结论BPS可能通过抑制TGFβ1/Smad3通路活性对高糖条件下系膜细胞ECM代谢
起到了保护性的调节作用。
     

L158,809和西拉普利对体外培养系膜细胞TGF-β1表达和细胞外基质蛋白分泌的影响

目的：观察血管紧张素受体拮抗剂(ARBs)L158，809和血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂西拉普利对体外培养人肾小球系膜细胞转化生成因子(TGF—β1)表达和纤维连接蛋白、层粘连蛋白和Ⅳ型胶原分泌的影响。方法：分别在不同葡萄糖浓度(5.6mmol／L和30mmol／L)和药物浓度(1、10、100和500μmol／L)下体外培养人肾小球系膜细胞，分别于24、48和72h后测定细胞增殖。然后将系膜细胞分为低糖(5．6mmol／L)对照组(LG)、高糖(30mmol／L)对照组(HG)、L158，809(10μmol／L)组和西拉普利(10μmmol／L)组，48h后，分别用RT-PCR法测定TGF-β1表达，ELISA和放射免疫法测定细胞上清液中TGF-β1、纤维连接蛋白、层粘连蛋白和Ⅳ胶原浓度。结果：与低糖对照组相比，高糖对照组系膜细胞过度增殖，细胞上清液中TGF-βl、纤维连接蛋白、层粘连蛋白和Ⅳ胶原浓度明显升高，TGF-βlmRNA表达也显升高；而L158，809组和西拉普利组TGF-β1和细胞外基质(ECM)蛋白水平明显低于高糖对照组，且TGF-β1mRNA水平亦表达明显降低。结论：高糖可刺激体外培养系膜细胞过度增殖，TGF-β1表达增高，ECM蛋白分泌明显增加，而L158，809和西拉普利均可抑制高糖环境下上述现象。     

表达过氧化物酶增殖物激活受体γ1全长基因质粒的构建及其在转染的系膜细胞中功能的鉴定

目的构建过氧化物酶增殖物激活受体γ1（PPARγ1）全长表达基因质粒,观察PPARγ1过表达对系膜细胞细胞外基质（ECM）的作用。方法将野生型（WT）小鼠PPARγ1全长cDNA连接入真核细胞表达质粒pIRES2-绿色荧光蛋白中,以脂质体介导的方法将该表达质粒pIRES2-EGFP-mPPARγ1／WT转染入系膜细胞,采用RT-PCR、Western印迹、PPARγ与PPRE结合活性测定等方法鉴定PPARγ1在系膜细胞中的表达与活性,并且给予高糖（30mmol／L）刺激,观察PPARγ1过表达对TGF-β1、PAI-1及纤连蛋白等ECM的作用。本研究中同时以一用相同方法构建的表达功能缺陷型（DN）PPARγ1的质粒pIRES2-EGFP—mPPARγ1／DN作为对照。结果限制性酶切及DNA测序结果均说明所构建的质粒为PPARγ1全长表达基因质粒。该质粒的表达在转染48h后达到高峰。PPARγ1过表达能显著减少高糖所致的系膜细胞的转化生长因子（TGF）-β1、纤溶酶原激活剂抑制物（PAI）-1的mRNA和培养细胞上清液中FN的高表达（P〈0．05）。结论PPARγ1全长表达基因质粒的构建为进一步研究PPAMγ1的效应和机制提供了有利的工具,此研究结果显示PPARγ1过表达可以抑制高糖引起的细胞外基质的积聚。     

糖尿病肾病系膜细胞增殖功能、[Ca~(2 )]i和分泌纤维连接蛋白的研究

目的 :探讨糖尿病肾病系膜细胞功能改变及意义。方法 :采用STZ复制糖尿病模型 ,取肾进行系膜细胞培养 ,3 H -TdR法测定细胞增殖 ,用fluro - 3探针经共聚焦显微镜检测 [Ca2 ]i 变化 ,ELISA法测定纤维连接蛋白 (FN)分泌量。结果 :糖尿病大鼠系膜细胞3 H -TdR掺入率和FN分泌量较正常大鼠增加 ,基础 [Ca2 ]i 两组无差异 ,但糖尿病系膜细胞 [Ca2 ]i 对血管紧张素II反应明显减弱。结论 :糖尿病系膜细胞增殖和分泌FN增加参与了糖尿病肾病细胞外基质的积聚 ,其 [Ca2 ]i对AngII反应减弱可能参与了糖尿病肾病早期高滤过