黄芪多糖对RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇含量的影响

目的 探讨黄芪多糖(APS)对RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇含量的影响.方法采用体外培养小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞,用50 mg/L氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导,建立泡沫细胞模型.用油红O染色在光镜下鉴定泡沫细胞形态及变化.再以不同浓度APS(0 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L)作用泡沫细胞24 h;以100 mg/L APS作用泡沫细胞不同时间(0 h、6 h、12 h、24 h、48 h)后,酶比色法检测泡沫细胞内胆固醇的含量.结果①巨噬细胞经ox-LDL诱导48 h后转化为泡沫细胞.②与对照组相比,10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L的APS作用于巨噬细胞源性泡沫细胞24 h后,细胞内胆固醇含量均明显减少(P＜0.01).③与对照组相比,100 mg/L的APS作用于巨噬细胞源性泡沫细胞6 h、12 h、24 h、48 h,细胞内胆固醇含量均明显减少(P＜0.01).结论①巨噬细胞经ox-LDL诱导后,有大量泡沫细胞形成.②APS可减少RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇含量.     

泡沫细胞胆固醇逆向转运机制及药物干预研究

目的 人THP-1单核/巨噬细胞源性泡沫细胞为研究对象,探讨罗格列酮、洛伐他汀对三磷酸腺苷结合盒转运蛋白(ABC)A1表达和细胞内胆固醇含量的影响.方法 低密度脂蛋白(LDL)提取,Cu2+氧化法获得氧化型LDL(ox-LDL).建立泡沫细胞模型.Western blot检测洛伐他汀、罗格列酮对THP-1单核/巨噬细胞ABCA1蛋白表达的影响.泡沫细胞分9组,分别给予相应的干预因子,培养24 h,检测各组细胞内胆固醇含量.结果 与对照组比较,洛伐他汀组、罗格列酮组、各ABCA1单克隆抗体预处理组细胞内胆固醇含量无明显变化(P>0.05);而载脂蛋白(Apo)A-I组、洛伐他汀+ApoA-I组、罗格列酮+ApoA-I组显著降低(P<0.05).结论 胆固醇逆向转运需在ApoA-I和ABCA1蛋白共同参与下完成,并能降低细胞内胆固醇含量.罗格列酮能通过促进ABCA1蛋白表达介导胆固醇向胞外转运,使细胞内胆固醇含量进一步降低.     

不对称二甲基精氨酸对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇含量的影响

目的 观察不对称二甲基精氨酸（ADMA）对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇含量的影响.方法 THP-1单核细胞给予160nmol/L佛波酯（PMA）孵育48h,诱导分化成巨噬细胞,与80mg/L氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）孵育24h,使巨噬细胞转化为泡沫细胞,用油红O染色在光镜下鉴定泡沫细胞形态及变化.再以不同浓度ADMA（1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L）作用泡沫细胞24h,以20μmol/L ADMA作用泡沫细胞不同时间（0h,6h,12h,24h,48h）,酶比色法检测泡沫细胞内胆固醇的含量.结果 ①单核细胞加人PMA诱导48h后,分化为巨噬细胞,再经ox-LDL诱导24h后转化为泡沫细胞.②与对照组相比,5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L,30μmol/L的ADMA作用于,THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞24h后,细胞内胆固醇含量均明显增加（P＜0.01）,③与对照组相比,20μmol/L的ADMA作用于THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞12h,24h,48h,细胞内胆固醇含量均明显增加（P＜0.01）.结论 ①单核细胞株THP-1经PMA诱导后,可分化为巨噬细胞,再经ox-LDL诱导后,可转化为泡沫细胞.②ADMA可以增加THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇的含量.     

PPARs激动剂对RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇含量的影响

目的 探讨PPARs激动剂吡格列酮对RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇含量的影响.方法 首先用50 mg/L氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）将体外培养的RAW264.7巨噬细胞诱导分化为泡沫细胞,然后进行油红O染色,并在光镜下鉴定泡沫细胞形态及变化;再以不同浓度吡格列酮（0 μmol/L、5 μmol/L、10μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L）作用泡沫细胞24h,以30 μmol/L的吡格列酮作用0h、6h、12h、24 h、48 h;最后酶法检测泡沫细胞内胆固醇的含量.结果 ①50 mg/Lox-LDL诱导巨噬细胞48 h后分化为泡沫细胞.②与对照组相比,不同浓度吡格列酮作用后泡沫细胞内胆固醇含量均减少,差异有统计学意义（P＜0.01）,且呈剂量依赖性.③与对照组相比,30 μmol/L的吡格列酮作用6h、12 h、24 h、48 h后,泡沫细胞内胆固醇含量均减少,差异有统计学意义（P＜0.01）,且呈时间依赖性.结论 PPARs激动剂吡格列酮能够减少泡沫细胞内胆固醇含量,且呈剂量和时间依赖性。     

ox-LDL诱导泡沫细胞形成中AnnexinⅡ的表达改变及意义

目的观察AnnexinⅡ在氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导泡沫细胞形成中表达的改变及其与细胞内胆固醇酯(CE)/总胆固醇(TC)比值(CE/TC)改变的相关性,从而探讨AnnexinⅡ在ox-LDL诱导泡沫细胞形成中的意义。方法常规培养RAW264.7单核细胞株,待细胞长至90%汇合度时,分别加入不同浓度的ox-LDL(50、100、200 mg/L)孵育24 h,以未经氧化修饰的天然低密度脂蛋白(n-LDL,200 mg/L)为阴性对照,测定细胞内TC和CE含量,油红O染色鉴定泡沫细胞;比色法测定乳酸脱氢酶(LDH)释出量和MTT法检测细胞存活率来观察oxLDL对细胞的毒性作用;RT-PCR和Western blot检测AnnexinⅡmRNA和蛋白的表达水平。结果不同浓度的oxLDL(50、100、200 mg/L)孵育24 h,仅200 mg/L ox-LDL组细胞活力显著降低,LDH释出量显著升高,与n-LDL(200mg/L)组比较差异具有显著性(P0.01),50 mg/L和100 mg/L ox-LDL对细胞活力和LDH释出量无显著影响(P0.05);CE/TC比值分别是55.0%±6.7%、61.8%±4.8%和59.6%±5.2%,与n-LDL(200 mg/L)组比较差异均具有显著性(P0.05),其中浓度为100 mg/L的ox-LDL作用最显著;ox-LDL呈浓度依赖性抑制AnnexinⅡmRNA和蛋白的表达,AnnexinⅡmRNA和蛋白的表达改变与CE/TC比值呈负相关(r_1=-0.9374,P0.05;r_2=-0.9548,P0.05)。结论 ox-LDL呈浓度依赖性抑制AnnexinⅡ表达,提示其可能影响细胞内胆固醇自平衡从而诱导泡沫细胞形成。     

体外氧化修饰高密度脂蛋白对人单核细胞源性泡沫细胞内胆固醇流出的影响

目的探讨体外氧化修饰后的高密度脂蛋白（ox-HDL）对人外周血单核细胞源性泡沫细胞内胆固醇流出的影响。方法采用一次性密度梯度超速离心法从血浆中分离低密度脂蛋白（LDL）及高密度脂蛋白（HDL）,分别以Cu2+诱导法将其氧化修饰成ox-LDL及ox-HDL。采用密度梯度离心法和塑料吸附法从人外周血中分离出单核细胞,以50nmol/L佛波酯（PMA）刺激48h使之转化为巨噬细胞。细胞分为对照组（ox-LDL组）、阳性对照组（HDL组）及实验组（ox-HDL组）,对照组仅加入终浓度为80mg/L的ox-LDL;HDL组和ox-HDL组分别先加入终浓度均为50mg/L的HDL和ox-HDL共孵育1h后,再分别加入终浓度为80mg/L的ox-LDL,并于实验的0、6、12及24h测定细胞内总胆固醇（TC）、游离胆固醇（FC）及蛋白（Pro）含量。观察不同时间点各组细胞内TC/Pro比值的变化,并比较ox-HDL与HDL对细胞内TC/Pro比值影响的时效关系。结果成功地由体外氧化修饰了LDL及HDL并制备出理想的泡沫细胞模型。在实验的6、12及24h,ox-HDL组细胞内TC/Pro比值均较HDL组细胞高,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论体外氧化修饰后的HDL导致其胆固醇逆向转运（RCT）功能与效率的降低。     

晚期氧化蛋白产物对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1表达的影响

目的探讨晚期氧化蛋白产物对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞三磷酸腺苷结合盒转运体A1表达及胆固醇流出的影响。方法用160nmol/L的佛波酯诱导THP-1细胞24h,使其贴壁并转化为巨噬细胞,并以50mg/L的氧化型低密度脂蛋白孵育细胞使其转化为泡沫细胞,再用不同浓度的晚期氧化蛋白产物(0、50、100、200μmol/L)处理细胞24h,或以100μmol/L的晚期氧化蛋白产物处理细胞不同的时间(0、12、24、48h)。采用液体闪烁计数法观察细胞内胆固醇的流出....     

黄芪多糖对RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出及PPARγ表达的影响

目的 以RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞为研究对象,观察不同浓度黄芪多糖（APS）对细胞内胆固醇流出及PPARγ表达的影响,探讨可能作用机制.方法 将RAW264.7细胞诱导分化为泡沫细胞,用油红O染色法鉴定.不同浓度APS作用泡沫细胞48 h后,液体闪烁计数仪检测胆固醇的流出率,并用RTPCR及ELISA测定PPARγ的基因及蛋白表达.结果 ①巨噬细胞经氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导48 h后转化为泡沫细胞.②与对照组相比,不同浓度APS干预组泡沫细胞的胆固醇流出率上升（P＜0.01）,且在一定浓度范围内呈剂量依赖性.③与对照组相比,不同浓度APS干预组泡沫细胞内PPARγ的基因表达上调（P＜0.01）,且在一定浓度范围内呈剂量依赖性.④与对照组相比,20、50、100 mg/L浓度APS干预组泡沫细胞内PPARγ的蛋白表达增加（P＜0.01）.结论 ①经ox-LDL诱导后,巨噬细胞分化为泡沫细胞,细胞内脂质大量增加.②APS促进巨噬细胞内胆固醇流出,可能与上调细胞内PPARγ的表达有关.     

小檗碱调节肝X受体α去乙酰化促进THP-1

目的 观察小檗碱对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ATP结合盒转运体A1(ABCA1)表达及其细胞内胆固醇流出的影响,并探讨肝x受体α(LXR-α)去乙酰化在此过程中的作用.方法 用不同浓度的小檗碱(0、5、10、20 μmol/L)处理THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞24 h,或以20 μmol/L小檗碱处理THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞不同的时间(0、6、12、24 h).采用Western Blot检测ABCA1、LXR-α和乙酰化LXR-α的蛋白表达,液体闪烁计数法观察细胞内胆固醇的流出,高效液相色谱法测定细胞内胆固醇浓度.结果 与对照组比较,小檗碱呈浓度(0～20 μmol/L)和时间依赖性(0～24 h)上调巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1的表达和下调乙酰化LXR-α的表达,增加THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇的流出,减少细胞内胆固醇的含量.上述效应在20 μmol/L小檗碱处理THP-1巨噬细胞24 h后达到最大值.结论 小檗碱能上调THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1的表达,并促进细胞内胆固醇流出,这种效应与调节LXR-α乙酰化有关.     

槟榔碱对泡沫细胞胆固醇流出和ABCA1表达的影响

目的 探讨槟榔碱对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的鼠源性巨噬细胞性泡沫细胞形成的影响及可能机制.方法 采用体外培养的鼠源性巨噬细胞株作为研究对象,加入ox-LDL (50 mg/L)诱导泡沫细胞,同时加入不同浓度的槟榔碱处理,油红0染色进行形态学观察,高效液相色谱法测定细胞内总胆固醇(TC)、游离胆固醇(FC)和胆固醇酯(CE)的水平,3H标记的胆固醇测定胆固醇流出率.采用实时定量PCR和蛋白印迹法分别检测细胞中三磷酸腺苷结合盒转运体A1( ABCA1)的表达.结果 ox-LDL处理48 h后,与正常巨噬细胞相比,油红O染色阳性细胞显著增加,细胞体积明显增大,形态多呈圆形或不规则形;槟榔碱(10-6、10-5和10-4mol/L)组油红O染色阳性细胞数比泡沫细胞模型组显著减少,细胞体积明显缩小.与泡沫细胞模型组相比,槟榔碱(10-5和10-4mol/L)显著性降低细胞内TC、FC、CE水平及CE/TC,显著性增加细胞胆固醇流出率和ABCA1的表达.结论 槟榔碱抑制ox-LDL诱导的鼠源性巨噬细胞性泡沫细胞形成,上调泡沫细胞中ABCA1的表达.     

1-Naphthyl isocyanate and 1-naphthylamine as metabolites of 1-naphthylisothiocyanate

Abstract: The importance of the bioactivation of 1-naphthylisothiocyanate was studied. Forty minutes after 1-naphthylisothiocyanate administration to rats, bile was collected over a 2.5-h period; the liver was then excised and homogenized. 1-naphthylisothiocyanate and its metabolites in bile and liver of rats were identified and quantified using coupled gas chromatography-mass spectrometry. Three main compounds were found in all 1-naphthylisothiocyanate-treated animals. They were identified as 1-naphthyl isocyanate, 1-naphthylamine and the parent compound, 1-naphthylisothiocyanate. When rats were given cycloheximide, which attenuates 1-naphthylisothiocyanate toxicity, 30 min before 1-naphthylisothiocyanate (300 mg/kg), 1-naphthyl isocyanate concentration was significantly lower than in rats receiving only 1-naphthylisothiocyanate. The appearance of 1-naphthylamine was also inhibited by cycloheximide, although not to the same extent as 1-naphthyl isocyanate. On the other hand, phenobarbital, which potentiates 1-naphthylisothiocyanate hepatotoxicity, enhanced 1-naphthyl isocyanate and 1-naphthylamine formation. It is suggested that 1-naphthyl isocyanate, 1-naphthylamine and the highly reactive sulfur released from 1-naphthylisothiocyanate might be involved in the hepatotoxic effect of 1-naphthylisothiocyanate.     

The target of ezetimibe is Niemann-Pick C1-Like 1 (NPC1L1)

Ezetimibe is a potent inhibitor of cholesterol absorption that has been approved for the treatment of hypercholesterolemia, but its molecular target has been elusive. Using a genetic approach, we recently identified Niemann-Pick C1-Like 1 (NPC1L1) as a critical mediator of cholesterol absorption and an essential component of the ezetimibe-sensitive pathway. To determine whether NPC1L1 is the direct molecular target of ezetimibe, we have developed a binding assay and shown that labeled ezetimibe glucuronide binds specifically to a single site in brush border membranes and to human embryonic kidney 293 cells expressing NPC1L1. Moreover, the binding affinities of ezetimibe and several key analogs to recombinant NPC1L1 are virtually identical to those observed for native enterocyte membranes. KD values of ezetimibe glucuronide for mouse, rat, rhesus monkey, and human NPC1L1 are 12,000, 540, 40, and 220 nM, respectively. Last, ezetimibe no longer binds to membranes from NPC1L1 knockout mice. These results unequivocally establish NPC1L1 as the direct target of ezetimibe and should facilitate efforts to identify the molecular mechanism of cholesterol transport.     

Inhibition of procarcinogen-bioactivating human CYP1A1, CYP1A2 and CYP1B1 enzymes by melatonin

Abstract:  Administration of melatonin to rodents decreases the incidence of tumorigenesis initiated by benzo[ a ]pyrene or 7,12-dimethylbenz[ a ]anthracene, which requires bioactivation by cytochrome P450 enzymes, such as CYP1A1, CYP1A2 and CYP1B1, to produce carcinogenic metabolites. The present study tested the hypothesis that melatonin is a modulator of human CYP1 catalytic activity and gene expression. As a comparison, we also investigated the effect of melatonin on the catalytic activity of CYP2A6, which is also a procarcinogen-bioactivating enzyme. Melatonin (3–300 μ m ) decreased 7-ethoxyresorufin O -dealkylation catalyzed by human hepatic microsomes and recombinant CYP1A1, CYP1A2 and CYP1B1, whereas it did not affect coumarin 7-hydroxylation catalyzed by hepatic microsomes or recombinant CYP2A6. Melatonin inhibited CYP1 enzymes by mixed inhibition, with apparent K _i values (mean ± S.E.M.) of 59 ± 1 (CYP1A1), 12 ± 1 (CYP1A2), 14 ± 2 (CYP1B1) and 46 ± 8 μ m (hepatic microsomes). Additional experiments indicated that melatonin decreased benzo[ a ]pyrene hydroxylation catalyzed by hepatic microsomes and CYP1A2 but not by CYP1A1 or CYP1B1. Treatment of MCF-10A human mammary epithelial cells with melatonin (up to 300 μ m ) did not affect basal or benzo[ a ]pyrene-inducible CYP1A1 or CYP1B1 gene expression. Consistent with this finding, melatonin did not influence reporter activity in aryl hydrocarbon receptor-dependent pGudluc6.1-transfected MCF-10A cells treated with or without benzo[ a ]pyrene, as assessed in an in vitro cell-based luciferase reporter gene assay. Overall, melatonin is an in vitro inhibitor of human CYP1 catalytic activity, and it may be useful to develop potent analogues of melatonin as potential cancer chemopreventive agents that block CYP1-mediated chemical carcinogenesis.     

甲型H1N1与季节性H1N1流感病毒血凝素基因比较分析

目的分析泰安市2008～2009年度季节性流感与2009年度甲型H1N1流感病原学检测结果 ,比较季节性H1N1与甲型H1N1血凝素基因变异情况。方法选择国家级流感监测哨点医院以及暴发疫情的疫点,采集流感样病例的鼻咽拭子标本,通过RealtimePCR进行病毒检测,用MDCK细胞进行病毒分离,通过RT-PCR扩增血凝素HA1片段的基因并测序,利用生物信息学进行序列分析。结果 2008～2009年共检测鼻咽拭子标本283份,分离出流感病毒33株,分离阳性率为11.67%,其中季节性H1N1亚型31株。2009年5月1日～12月31日,检测鼻咽拭子标本996份,流感核酸检测阳性417份,阳性率为41.86%,其中甲型H1N1337份,季节性H1N1亚型1份。6株季节性H1N1病毒均在多个氨基酸位点上发生变异,与疫苗株A/Brisbane/59/2007(H1N1)比较,有11个位点发生了突变,其中5个位点位于抗原决定簇上;测序成功的6株甲型H1N1病毒在多个氨基酸位点发生变异,与疫苗株A/California/07/2009(H1N1)比较,有6个位点发生突变,其中1个位点位于抗原决定簇的B区。结论 2008～2009年度季节性H1N1为优势株,甲流暴发后,甲型H1N1成为绝对优势毒株。季节性H1N1分离株有多处氨基酸替换,抗原决定簇B区变异频繁;甲型H1N1病毒分离株的基因有变异,但关键位点第222位仍为D(天冬氨酸),与疫苗株相比抗原决定簇的关键位点变化不大。