卵磷脂、多聚赖氨酸和PLA包埋PGA与软骨细胞体外培养的实验研究

组织工程技术中细胞培养支架的选择是研究的焦点之一。以ＰＬＡ包埋的ＰＧＡ无纺网是应用较为广泛的支架之一。但其亲水性差，对细胞吸附力弱，是其不足之处。此实验选择了卵磷脂和多聚赖氨酸来分别和共同包埋ＰＧＡ＋ＰＬＡ，来观察其亲水性和对细胞吸附力的改变，及对细胞功能的影响。本实验证明卵磷脂具有增强支架亲水性作用；而多聚赖氨酸除具有增加支架对细胞的吸附力外，还具有促进细胞功能的作用。以卵磷脂和多聚赖氨酸共同包埋支架使细胞均匀地分布于支架纤维之间和支架表面，充分利用了支架空间，从而更好地发挥细胞的功能。所以本实验将为组织工程技术中细胞培养支架的选择提供一条新的途径。     

卵磷脂,多聚赖氨酸和PLA包埋PGA与软骨细胞体外培养的实验研究

组织工程技术中细胞培养支架的选择是研究的焦点之一，以ＰＬＡ包埋的ＰＧＡ无纺网是应用较为广泛的支架之一。但其亲水性差，对细胞吸附力弱，是其不足之处，此实验选择了卵巢脂和多聚赖氨酸来分别和共同包埋ＰＧＡ＋ＰＬＡ，来观察其亲水性和对细胞吸附力的改变，及对细胞功能的影响，本实验证明卵磷脂具有增强支架亲水性作用，而多聚氨酸除具有增加支架对细胞的吸附力强，还具有促进细胞功能的作用。以卵磷脂和多聚赖氨酸共同包埋     

经胶原包埋、修饰的聚羟基乙酸与软骨细胞体外培养的实验研究

目的：探讨经胶原包埋、修饰后的聚羟基乙酸（poloyglycolic acid简称PGA）作为组织技术中细胞培养支架的可行性；方法：将用胶原包埋的PGA和没有包埋的PGA分别与软骨细胞共同置于二氧化碳培养箱中培养，观察二者的亲水性，对细胞的吸附能力和细胞分泌基质的能力进行比较；结果：以胶原包埋的PGA和没有包埋的PGA亲水性没有明显的差异，二者亲水性均不强，而前者对细胞的吸附能力和细胞在其上面生长、分泌基质的能力明显增强；结论：以胶原包埋、修饰的PGA作为组织工程技术中细胞生长的支架，具有很大的应用前景。     

碱性成纤维细胞生长因子调节兔关节软骨细胞与包埋后聚乳酸体外培养的实验研究

目的 通过碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）调节卵磷脂和多聚赖氨酸共同包埋的聚乳酸三维支架与兔关节软骨细胞的体外培养,观察bFGF对组织工程软骨细胞生长的调节作用,探寻软骨组织工程的适宜方法。方法将体外培养的第3代兔关节软骨细胞种植于卵磷脂和多聚赖氨酸包埋的聚乳酸三维支架,加入bFGF共同培养,行大体、倒置显微镜、扫描电镜及免疫组织化学观察,分析软骨组织的形成,并行统计学分析。结果通过bFGF调节的卵磷脂和多聚赖氨酸共同包埋的聚乳酸三维支架一关节软骨细胞复合物在培养过程中不仅能够保持其初始外形,而且能保持种植细胞稳定的三维均相分布,无细胞脱落现象。同时脆性亦逐渐降低,韧性增加,有弹性,表面湿润、光滑,培养2周后,逐渐形成富含Ⅱ型胶原,具有典型软骨组织结构的成熟工程化软骨。其细胞生长及胶原分泌量明显强于对照组,统计学分析有显著性差异。结论bFGF能够促进组织工程软骨细胞的增殖,并具有增强软骨细胞功能的作用。     

包埋后的几丁质与软骨细胞体外培养的实验研究

目的 探讨几丁质作为组织工程技术中细胞培养支架的可行性。方法 采用聚乳酸、卵磷脂及多聚赖氨酸分别或工同包埋几丁质与软骨细胞体外培养,观察其产亲水性的改变、对细胞吸附力和细胞功能的影响。结果 以聚乳酸包埋的几丁质对细胞的生长有抵制作用;以卵磷脂包埋的几柄质亲水性增强;以多聚赖氨酸包埋的几丁质对细胞吸附力增强;以卵磷脂和多聚赖氨酸共同包埋的几丁质具有良好的亲水性和对细胞吸附力,并可使细胞更好地发挥功能     

改良猪耳郭软骨细胞体外培养的实验研究

目的：为组织工程化软骨修复机体软骨缺损提供实验基础。方法：用消化组织块培养法体外培养猪耳郭软骨细胞,并观察其在Polyglycolicacid（简称PGA）支架上的生长情况。结果：软骨细胞在pH值为7.0,含10%胎牛血清的DMEM培养液中生长良好,可传代10代,细胞数目扩增为原来的400～500倍;软骨细胞在PGA支架上生长良好,分泌基质旺盛。结论：改良消化组织块方法培养软骨细胞是一种可以大量扩增软骨细胞数目的确实可行的方法,PGA是软骨细胞良好的生长支架。     

软骨细胞—支架复合物修复兔耳廓软骨缺损

目的在有免疫力的动物兔体内探索组织工程化软骨对软骨缺损的修复能力。方法软骨细胞种于经不同物质修饰的聚羟基乙酸支架体外培养后修复兔耳廓软骨缺损，与对照组比较，并从大体及组织学进行评价。结果软骨细胞种于经不同物质修饰的聚羟基乙酸支架体外培养后回植到兔耳廓软骨缺损部位，软骨缺损得到修复，但与正常软骨交界处为纤维组织。注射软骨细胞悬液、以聚羟基乙酸支架修复及空白对照组软骨缺损均未修复。结论软骨细胞种于经不同物质修饰的聚羟基乙酸支架体外培养后在有免疫力的动物兔体内可修复耳廓软骨缺损，但存在着界面愈合问题。     

软骨细胞—支架复合物修复兔耳廓软骨缺损

目的在有免疫力的动物兔体内探索组织工程化软骨对软骨缺损的修复能力。方法软骨细胞种于经不同物质修饰的聚羟基乙酸支架体外培养后修复兔耳廓软骨缺损,与对照组比较,并从大体及组织学进行评价。结果软骨细胞种于经不同物质修饰的聚羟基乙酸支架体外培养后回植到兔耳廓软骨缺损部位,软骨缺损得到修复,但与正常软骨交界处为纤维组织。注射软骨细胞悬液、以聚羟基乙酸支架修复及空白对照组软骨缺损均未修复。结论软骨细胞种于经不同物质修饰的聚羟基乙酸支架体外培养后在有免疫力的动物兔体内可修复耳廓软骨缺损,但存在着界面愈合问题。     

软骨细胞植入胶原蛋白重建类软骨组织的体外培养研究

本实验采用鸡胚胎第３８期胸软骨，经酶消化示分离软骨细胞，均匀弥散植入外源性胶原蛋白交联形成的凝胶体内。经过体外培养８天，软骨细胞数目增加约３倍。组织学观察显示：软骨细胞均匀分布于胶原蛋白三维网络之间，细胞分化良好，细胞周围可见类似正常软骨组织之陷窝（Ｌａｃｕｎａ）。胶原网络间有蛋白多糖蓄积现象。组织化学分析提示软骨细胞合成分泌Ⅱ型胶原蛋白。实验结果提示：三维胶原蛋白凝胶构成类似软骨组织的细胞外生存     

软骨细胞体外培养负性相关因素研究进展

软骨细胞体外培养受到众多复杂因素的影响.白介素-1(IL-1)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α),可通过核因子-κB等信号途径干扰软骨细胞的正常代谢,两者具有协同作用;IL-6、IL-17、IL-18经相应途径上调炎症和软骨破坏相关基因,基质金属蛋白酶及其抑制剂的平衡失调是引起软骨退变的重要原因;含钙结晶体能通过两个独立的途径引起关节组织退变;过度的应力刺激、低氧、高渗溶液可不同程度地影响软骨细胞生长;各种因素引起的内质网过度紧张可导致软骨细胞调亡,软骨外植和切碎过程能引起IL-1表达升高.     

骨膜成骨细胞培养与生物活性陶瓷复合的实验研究

将成骨细胞与生物活性陶瓷复合培养，赋于材料以“生命”活性，可能会产生一种新型人工材料。为研究成骨细胞与生物活性陶瓷间的关系，选用新西兰大白兔，取胫骨外骨膜组织，经胰蛋白酶及胶原酶分步消化，分离出成骨细胞，用ＲＰＭＩ－１６４０培养液传代培养１３代。通过对培养细胞碱性磷酸酶活性、体外矿化能力测定以及细胞超微结构观察，证实其为典型的成骨细胞。将培养细胞分别在三种生物活性陶瓷，包括生物活性玻璃陶瓷（ＢＧＣ）、羟基磷灰石（ＨＡ）和双相羟基磷灰石（ＨＡ／ＴＣＰ）中培养４８小时后，利用扫描电镜，３Ｈ－ＴｄＲ，ＸＲＤ，ＲＳ和ＥＤＸＡ等进行综合评价。结果表明：ＨＡ／ＴＣＰ上培养成骨细胞较另两种生物材料上显示出更好的类成骨细胞形态和更高的细胞分化率。对成骨细胞与生物活性陶瓷反应的机制进行了讨论，并分析了影响细胞生长的材料因素，其结果为深入研究有生命的材料提供了依据。     

骨髓间充质干细胞复合消旋聚乳酸/明胶修复兔关节软骨缺损的实验研究

目的 研究骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells，MSCs）复合消旋聚乳酸（poly-L-lacticacid，PLLA）／明胶修复兔膝关节全层软骨缺损的效果。方法 4～6月龄青紫兰兔36只，体重2．5～3．5kg，雌雄不拘。体外分离培养MSCs，取第2代MSCs种植于PLLA／明胶支架体外复合培养。将36只青紫兰兔制备双侧膝关节全层软骨缺损模型，根据修复方法不同随机分为A、B、C3组（n=12）。A组，将MSCs与PLLA／明胶支架材料复合物植入兔双膝缺损处；B组，将单纯PLLA／明胶支架材料植入兔双膝缺损处；C组，缺损处不作任何处理，作为对照。A、B组在植入时均加入25μg／L转化生长因子β（transforming growth factorp1，TGF-β1）0．4ml。分别于术后4、8和12周，取材行大体、组织学及免疫组织化学染色观察，并将12周大体及组织学标本按照O’driscoll等评分标准进行评分。结果大体观察：术后12周，A组修复组织与正常软骨结合处完整，表面光滑，界限模糊；B、C组缺损处修复组织呈纤维组织或无修复，表面不平整或呈虫蚀样改变。组织学观察：A组术后4周，细胞数较多，呈梭形、圆形或椭圆形；8周修复组织与周围软骨大部分结合，细胞呈圆形，以透明软骨样细胞为主，有软骨陷窝，表层有梭形纤维样细胞；12周修复组织细胞为透明软骨样细胞，柱状排列，与周围软骨及软骨下骨整合良好；B组，术后4～8周细胞数较少，细胞层次排列差；12周修复组织菲薄，呈纤维软骨样，基质染色接近正常；C组，术后4～8周缺损组织由薄层纤维组织覆盖；12周缺损区纤维组织进一步增厚，与周围软骨未结合。免疫组织化学染色显示，A组修复组织Ⅱ型胶原染色呈阳性，B组呈弱阳性，C组无表达。术后12周大体观察总评分，A、B及C组分别为2．75±0．89、4．88±1．25和7．38±1．18，A组优于B、C组，B组优于C组，且差异均有统计学意义（P〈0．05）；组织学观察总评分，A、B及C组分别为3．88±1．36、8．38±1．06和13．13±1．96，A组与B、C组以及B组与C组差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论 应用软骨组织工程原理，以PLLA／明胶为支架材料复合自体MSCs移植是一种修复软骨缺损行之有效的方法。     

筋膜软骨细胞修复关节软骨大面积缺损的实验研究

目的　探讨在筋膜上培养软骨细胞修复关节软骨大面积缺损的能力和生物特性。方法　将幼兔关节软骨消化、分离和传代后的软骨细胞在兔筋膜上培养 ,分别用培养后的新鲜、冻存筋膜软骨细胞和游离软骨细胞移植修复关节软骨大面积缺损。术后 6、12及 2 4周取材 ,通过大体标本、光学显微镜、扫描、透射电镜、放射自显影以及一氧化氮含量测定等方法进行观察。结果　分离后的关节软骨细胞在兔筋膜上生长代谢良好 ,冻存后的筋膜软骨细胞生物活性无损伤 ,移植后修复的关节软骨缺损在细胞形态、生物特性与正常关节软骨组织相同。结论　筋膜可以作为软骨细胞移植较为理想的载体 ,用其修复关节软骨大面积缺损是一种有效可行的方法。     

骨髓基质细胞与关节软骨细胞生物学特性的比较研究

目的观察兔骨髓基质细胞(MSCs)诱导和基因修饰后的主要生物学特性,并与关节软骨细胞进行比较. 方法抽取成年雄性新西兰大白兔髂骨骨髓,密度梯度离心获得骨髓基质细胞,培养传至第5代,按处理方法分为常规培养液组(A组)、条件培养液组(B组)及重组缺陷型腺病毒携带肝细胞生长因子cDNA转染组(C组).条件培养液为常规培养液中含转化生长因子-β1(10 ng/ml)、碱性成纤维细胞生长因子(25 ng/ml)和地塞米松(10-7 mol/L).切取兔膝关节软骨,3 mg/ml Ⅱ型胶原酶消化传代培养至第3代(D组).观察原代MSCs及第5代MSCs(体外培养8～10周后)细胞形态,对第5代MSCs及第3代软骨细胞进行Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,MTT法检测细胞增殖情况.阿利新蓝法检测细胞培养上清液中糖胺多糖(GAG)含量.提取各组培养细胞总RNA,RT-PCR检测Ⅰ、Ⅱ型胶原表达. 结果原代MSCs为短梭形、簇状生长,传代细胞呈长梭形、旋涡样生长.A组细胞爬片Ⅰ型胶原免疫组织化学染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阴性,GAG含量低,与D组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).B组细胞爬片Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性,GAG含量升高,与D组比较差异无统计学意义(P＞0.05);C组转染后第4天增殖率降低,与A组比较差异有统计学意义(P＜0.05),其余时间点各组间无统计学意义(P＞0.05).RT-PCR表明A、B、C组均表达Ⅰ型胶原,B、D组可表达Ⅱ型胶原,C组有较弱的Ⅱ型胶原表达. 结论 MSCs体外培养过程中自然转归趋向于成骨.传代后经向成软骨方向诱导,具有向软骨分化的能力;体外传代培养的MSCs具有干细胞自我增殖和定向分化的特性,可作为靶细胞接受外源目的基因转染并能有效表达.     

细胞共培养法诱导兔脂肪来源干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的利用软骨细胞与脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)共培养,观察ADSCs是否能向软骨细胞定向分化。方法 4月龄健康新西兰大白兔8只,雌雄不限,体重2.2～2.7 kg,分离、培养兔软骨细胞和ADSCs,取第2代细胞用于实验。将实验分为两组,实验组各取将1 mL细胞密度为2×104个/mL的软骨细胞和ADSCs分别接种至Transwell小室6孔板上、下层共同培养,对照组单独培养ADSCs。倒置相差显微镜观察两组ADSCs形态变化;培养14 d后行甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,实时荧光定量PCR检测两组ADSCsⅡ型胶原、蛋白聚糖、SOX9 mRNA表达。结果倒置相差显微镜观察示,随培养时间延长,实验组ADSCs逐渐变为软骨样细胞形态,呈圆形;对照组ADSCs仍以梭形为主,呈束状或漩涡状生长。培养14 d,实验组甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色均为阳性;对照组均为阴性;实时荧光定量PCR检测示,实验组Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX9 mRNA相对表达量分别为1.43±0.07、2.13±0.08、1.08±0.08,显著高于对照组(0.04±0.03、0.13±0.04、0.10±0.02),差异均有统计学意义(P<0.05)。结论通过与软骨细胞共同培养,ADSCs可定向分化为软骨细胞。     

自体血清与胎牛血清培养口腔黏膜角质细胞及上皮组织的实验研究

目的探讨自体血清培养人口腔黏膜角质细胞的可行性,为组织工程口腔黏膜用于临床提供理论和技术依据。方法应用自行制备的含10%、20%和30%自体血清的培养液及10%胎牛血清培养液,对人口腔黏膜角质细胞进行培养。对比观察不同浓度自体血清和胎牛血清培养的口腔黏膜角质细胞及上皮组织生长情况,绘制10%自体血清组及10%胎牛血清组细胞生长曲线及计算其倍增时间。并行抗-HLA免疫荧光检测培养上皮。结果各浓度自体血清组和10%胎牛血清组细胞生长及形态无明显差别,10%自体血清组细胞倍增时间为24.02±1.80h,与10%胎牛血清组20.90±0.79h比较,差异无统计学意义(P>0.05)。各组细胞24h克隆形成率比较,差异均无统计学意义(P>0.05);随自体血清浓度升高获得黏膜上皮面积增大,厚度增加,以20%自体血清组最为明显,与10%胎牛血清组培养黏膜上皮比较,差异有统计学意义(P<0.05)。各组培养上皮经抗-HLA免疫荧光检测为阳性。结论制备的自体血清能完全替代胎牛血清对口腔黏膜角质细胞进行培养,且培养的口腔黏膜上皮组织分化优于胎牛血清。     

不同分子量的高纯度透明质酸对猪去全厚皮后伤口愈合的影响

透明质酸（ＨＡ）是一种大分子量的细胞外基质，它可影响伤口愈合。ＨＡ的作用与其分子量大小，以及是否含其它蛋白质有关。在猪去全厚皮伤口局部应用不同分子量的高纯度ＨＡ７天，与中分子量的ＨＡ（１００ｋｕ）和生理盐水对照相比，高分子量的ＨＡ（大于１０００ｋｕ）促进伤口的早期收缩，而低分子量ＨＡ（１０ｋｕ）则对伤口愈合有抑制作用。检测２１天的伤口抗撕裂强度，高、中分子量的ＨＡ有抑制作用，低分子量ＨＡ无作用。用     

聚乳酸凝胶预防硬膜外瘢痕粘连的实验研究

目的 探讨新型生物可吸收材料聚乳酸凝胶(polyactic acid glue，PLA-G)预防椎板切除术后硬膜外瘢痕粘连的作用。方法 切除24只成年日本大耳白兔的L2和L5椎板；在L5外露的硬膜及神经根表面喷涂液态PLA-G形成胶冻膜，为实验组；L2处只做椎板切除，为自身空白对照组。术后2、4、6、8、10及12周随机处死各4只兔，取标本行大体、组织学及超微结构的观察。结果 2周时实验组PLA-G未降解为机械屏障膜，硬膜与外侧瘢痕组织(scartissue，ST)间有明显间隙，光镜下显示间隙内无细胞；对照组为血肿覆盖较易分开，硬膜与ST间有血细胞团块，成纤维细胞(fibroblast，FB)增生活跃。4周时实验组PLA-G部分降解，机械屏障及间隙存在，光镜下ST中FB增多；对照组为较多质脆ST与硬膜广泛粘连，光镜下可见组织细胞浸润间隙，ST内FB明显多于实验组。6周时实验组PLA-G完全降解，少量ST与硬膜无粘连，光镜下FB已减少；对照组有大量质韧难以从硬膜分离的ST，FB继续增生活跃。8、10及12周时实验组ST与硬膜无粘连；对照组ST与硬膜粘连严重，光镜下见ST和硬膜粘连紧密伴毛细血管再造。超微结构观察：4周时实验组FB的粗面内质网较稀疏，分泌胶原纤维少；对照组FB的粗面内质网极丰富，胶原纤维多而成束。结论 PLA-G在实验兔腰椎板切除后的硬膜外能有效地减少瘢痕形成和粘连。     

复温速率对冷冻保存的同种异体血管结构功能的影响

目的比较不同复温速率对冷冻保存的同种异体血管结构和功能的影响。方法取32段新鲜的兔颈总动脉,按照程序降温至-100℃后置于液氮中保存四周。取出后按不同复温速率,分为A组（100℃/min）、B组（30℃/min）、C组（15℃/min）以及未经冷冻的正常组（每组n=8）,通过光镜和电镜观察血管结构变化,采用DNA原位末端标记（TUNEL）比较各组血管壁中细胞的凋亡率。在器官浴槽中测定不同血管的内皮依赖型舒张功能和非内皮依赖型舒张功能。结果光镜和电镜下观察,A组内皮细胞大片脱落,平滑肌细胞变形,胞浆可见大量空泡,而B和C组内皮细胞和平滑肌细胞保存较好。A组血管壁细胞凋亡率高于B、C组（P〈0.05）。血管舒张功能试验结果示,A组最大内皮依赖型舒张力百分比低于B、C组（P〈0.05）,内皮细胞对乙酰胆碱的敏感性也低于B、C组（P〈0.05）。而A组最大非内皮依赖型舒张力百分比低于B、C组（P〈0.05）,但A组平滑肌细胞敏感性较B、C组和正常组没有明显改变。结论逐步缓慢复温对冷冻保存的同种异体血管的结构和功能有一定的保护作用。