卵巢癌抗独特型单链抗体 6B11ScFv 与鼠 HSP70 融合蛋白的构建、表达及鉴定

 目的 构建卵巢癌抗独特型单链抗体 6B11ScFv 与小鼠热休克蛋白 70（mHSP70）融合蛋白 6B11ScFv/mHSP70,并初步鉴定其免疫活性。 方法 根据 Genebank 上已发表的 mHSP70 基因序列（NM_010478）合成引物行 PCR 扩增,以扩增所得 mHSP70 基因插入 pET30a（+）-6B11ScFv 质粒后转化入 E.coli DH5α,获得 pET30a（+）-6B11ScFv/mHSP70 重组质粒。将鉴定正确的 pET30a（+）-6B11ScFv/mHSP70 重组质粒转化入 E.coli BL21（DE3）,获得 E.coli BL21（DE3）[pET30a（+）-6B11ScFv/mHSP70]重组菌株。以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达并行 SDS-PAGE 分析,对表达产物进行复性和 Ni2+-NTA 柱亲和层析纯化后,采用蛋白质印迹法和 ELISA 方法进行鉴定和免疫活性检测。 结果 6B11ScFv/mHSP70 融合基因测序结果基本与理论序列相符。SDS-PAGE 分析显示,重组菌株表达产物相对分子质量与预期相符。复性、亲和层析纯化后的蛋白复性率达 20.9%,蛋白纯度达 95% 以上。蛋白质印迹分析证实 6B11ScFv/mHSP70 融合蛋白相对分子质量为 104 000,ELISA 检测表明其具有 6B11ScFv 和 mHSP70 的免疫 活性。 结论 构建表达的 6B11ScFv/mHSP70 融合蛋白具有良好的免疫活性,为进一步研究其体内外抗卵巢癌活性奠定了基础。     

卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv/mGM-CSF融合蛋白的构建、表达及活性测定

目的　构建卵巢癌抗独特型单链抗体 6 B11Sc Fv和鼠 GM- CSF融合蛋白 (6 B11m GM) ,以观察其在动物体内诱导的特异性免疫反应 ,为卵巢癌抗独特型疫苗应用于临床提供依据。　方法　用 DNA重组技术 ,将m GM- CSF连于单链抗体 6 B11Sc Fv羧基末端 ,构建重组质粒 p ET30 - 6 B11m GM,转化大肠杆菌 BL2 1(DE3) ,IPTG诱导 ,以包涵体形式获高效表达 ,超声破碎细菌细胞获得包涵体 ,用 8mol.L- 1尿素溶解包涵体后直接稀释复性 ,SDS- PAGE分析蛋白纯度 ,EL ISA分析技术和细胞增殖实验测定融合蛋白的抗体和细胞因子活性。　结果　复性蛋白纯度达 90 %以上。采用氧化型谷胱甘肽 (GSSG)浓度为 1mm ol.L- 1 ,还原型谷胱甘肽 (GSH)浓度为 5 m mol.L- 1 ,10℃复性 48h,复性率达 36 %。表达的融合蛋白分别能与 COC16 6 - 9单抗和大鼠抗小鼠 GM- CSF单抗特异结合 ,并能刺激 m GM- CSF依赖株 NFS- 6 0细胞增殖。　结论　以包涵体表达的融合蛋白 6 B11m GM保留了两种蛋白的活性 ,为研究融合蛋白在体内的免疫功能提供了基础     

人细胞色素P4502B6的GST融合蛋白及其抗体的制备

目的：获得纯化抗原用于制备ＣＹＰ２Ｂ６多克隆抗体方法：ＰＣＲ扩增目的基因片段,亚克隆入融合蛋白表达载体ＰＧＥＸ－３ｂ,构建了重组质粒ＰＧＥＸ／２Ｂ６。然后将该重组质粒转化大肠杆菌ＤＨ５α,ＩＰＴＧ诱导表达,ＳＤＳ＿ＰＡＧＥ分离,获纯化融合蛋白ＧＳＴ－２Ｂ６。用ＧＳＴ－３Ｂ２免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠,自腹水中获取ＣＹＰ２Ｂ６多克隆抗体。结果：融合蛋白ＧＳＴ－２Ｂ６（ＣＹＰ２Ｂ６２０２￣３５２ａａ）,并获     

单链抗体与力达霉素融合蛋白在链霉菌中的表达

 目的 构建可表达力达霉素（LDM）辅基蛋白基因与抗 IV型胶原酶单链抗体（scFv）融合蛋白的重组菌株，获得既具有靶向性、又具有抗肿瘤活性的 scFV-LDM。方法 以大肠埃希菌-链霉菌穿梭质粒 pBS03 为基础构建同源双交换质粒 pBS-scFv，利用接合转移将该质粒转入球孢链霉菌（S. globisporus）C-1027，根据抗性差异筛选获得重组菌株。用 PCR、DNA 印迹法对重组菌株进行验证。用 SDS-PAGE 检测重组菌株中目的融合蛋白的表达。用抑菌圈试验检测重组菌株发酵液的抑菌活性。 结果 经同源重组得到重组菌株 S. globisporus C-1027- scFv。PCR 显示重组菌株扩增产物与预期一致，DNA 印迹分析显示重组菌株得到与预期吻合的杂交片段，表明 scFv-LDM 融合蛋白基因已经成功取代 LDM 辅基蛋白基因。SDS-PAGE 结果显示重组菌株不再产生辅基蛋白。抑菌圈试验显示重组菌株发酵液在第 5 天能够检测到抑菌活性。初步结果表明，重组菌株可产生 scFv-LDM 融合蛋白。 结论 成功构建了可产生 scFv-LDM 融合蛋白且具有分泌活性的重组菌株。这对改造和研发新型单抗导向药物有实际意义。     

热应激蛋白70及其抗体在中暑病人血浆中水平改变的观察研究

探讨中暑发生的病理过程中热应激蛋白７０（ＨＳＰ７０）水平及其抗体滴度水平的变化和相互关系。应用Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ法测定血浆ＨＳＰ７０水平；应用免包被的酶联免疫吸附分析法经倍比稀释测定血浆ＨＳＰ７０抗体滴度。     

杨絮热休克蛋白70(HSP70)结构域蛋白的生物信息学分析、原核表达及生物学活性鉴定

目的 揭示杨絮热休克蛋白70(HSP70)结构域蛋白生物信息学特征,并探索该类蛋白外源表达方法及生物学活性.方法 通过生物信息学软件对已获得的3个含HSP70结构域蛋白的理化性质进行分析,利用免疫表位数据库和分析资源(IEDB)对该类蛋白的T、B细胞表位进行预测;根据Uniprot数据库提供的氨基酸序列合成相关基因并克...     

大肠杆菌表达的人源性抗CTLA4单链抗体三种复性方法比较

比较表达于大肠杆菌中的人源性抗细胞毒性T淋巴细胞抗原4单链抗体(A n ti-CTLA 4 scFv)的三种体外复性方法的复性效率。稀释、透析和亲和柱上三种复性方式复性A n ti-CTLA 4 scFv,采用B rad ford法分析蛋白复性得率,采用间接细胞EL ISA法检测所得蛋白的活性。透析复性蛋白得率最高,稀释复性蛋白得率其次,亲和柱上复性蛋白得率最低;透析复性所得蛋白结合活性是稀释复性的1.95倍,是亲和柱上复性所得蛋白活性的4.13倍(无谷胱甘肽氧化还原对G SH/G SSH)及3.63倍(有G SH/G SSH)。结论:采用含0.15 m o l/L N aC、l1 mm o l/L G SSH和3 mm o l/L G SH的50 mm o l/L T ris-HC l(pH 8.0)缓冲液作为A n ti-CTLA 4 scFv的复性液,4℃下透析复性48 h,可获得较高复性得率和结合活性。     

烫伤早期大鼠肾脏HSP70表达的研究

目的探索大鼠烫伤早期肾脏内HSP70的表达规律及临床意义。方法将30只健康Wistar大鼠分为6组：烫伤后2h，8h，24h，3d，7d和正常对照组。各组大鼠取肾脏标本，用HE染色观察组织结构变化，免疫组化染色结合图像分析测定肾组织内HSP70的表达的阳性细胞计数。结果烫伤后各组HSP70在肾脏的表达的阳性细胞计数内较正常组高，差异均有统计学意义（P〈0．05）；大鼠烫伤后3d内HSP70在肾组织的表达主要定位在细胞核，到第7天核，浆表达基本一致；烫伤后HSP70的表达以肾髓质表达最高。结论大鼠烫伤早期HSP70被诱导表达对组织器官有明显的保护作用；大鼠烫伤后肾脏髓质部分较皮质部分更易损伤。     

新基因MAGE-n表位肽与人HSP70融合基因的构建及表达纯化

目的构建MAGE-n159-167(QLVFGIEVV)表位肽与人热休克蛋白70(HSP70)的融合基因并表达纯化。方法应用PCR方法,将QLVFGIEVV的cDNA序列融合到人HSP70基因的3'端,将融合基因克隆入原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a(+)QLVFGIEVV-HSP70;采用双酶切(Sac Ⅰ、Hind Ⅲ)及PCR鉴定后测序;转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),用IPTG诱导表达,Ni Sepharose6FF亲和填料进行分离纯化,SDS-PAGE检测表达及纯化结果。结果经PCR扩增成功获得约2.0kb的目的片段,重组体经Sac Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切分析及PCR结果与预期结果一致,测序正确。转入重组质粒的E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导、SDS-PAGE分析得到71kD左右的目的蛋白条带。用Ni Sepharose6FF亲和填料分离纯化,获得了纯化的融合蛋白。结论成功构建原核表达载体pET-28a(+)QLVFGIEVV-HSP70,并获得纯化的融合蛋白,为基于MAGE-n的肿瘤疫苗研制提供良好的抗原奠定了实验基础。     

过敏性紫癜患儿热休克蛋白70抗体检测的意义

目的探讨热休克蛋白70在过敏性紫癜发病机制中的作用。方法采用蛋白质免疫印迹酶联免疫吸附法（Western blot ELISA）测定37例病例组与35例对照组血浆中热休克蛋白70（HSP70）抗体。结果过敏性紫癜组中HSP70抗体检测阳性率（70．3％）明显高于对照组（17．1％）,两者相比差异有显著性（P〈0．01）;过敏性紫癜肾炎型HSP70抗体阳性率（80％）高于非肾炎型（63．6％）,两者相比差异有显著性（P〈0．05）。结论HSP70参与了过敏性紫癜的发病过程,且可反应肾脏是否受累。     

TRAIL和EGFR配体寡肽与力达霉素辅基蛋白融合蛋白制备过程的优化

目的对以包涵体形式表达的TRAIL和EGFR配体寡肽与力达霉素辅基蛋白融合蛋白Ec-LDP-TRAIL的制备过程进行优化。方法对大肠杆菌原核表达Ec-LDP-TRAIL目的蛋白的温度、诱导物浓度、起始菌体密度及时间等条件进行优化;在Ni2+亲和层析纯化蛋白过程中对样品预处理以及纯化缓冲液成分进行优化;对纯化后蛋白的分步透析复性过程进行一系列优化,并通过基于ELISA的结合活性实验分析Ec-LDP-TRAIL与肿瘤细胞的结合能力。结果经过工艺优化后,纯化后的融合蛋白Ec-LDP-TRAIL纯度达95%以上,复性后LB培养基活性蛋白收率约为2.2 mg/L,与初始复性条件相比提高近2倍。复性后融合蛋白Ec-LDP-TRAIL显示出能够与人表皮癌A431和人大细胞肺癌H460细胞的结合活性。结论融合蛋白Ec-LDP-TRAIL制备过程的优化为后续研发和生产奠定了实验基础,同时也为其他以包涵体形式表达的基于TRAIL的抗肿瘤蛋白药物的制备提供借鉴。     

乳腺癌特异性转导小肽融合表达载体的构建以及目的蛋白的表达

目的构建乳腺癌特异性转导小肽PI-增强型绿色荧光蛋白融合蛋白的原核表达载体,并进行目的蛋白的表达、分离和纯化。方法合成PI的DNA序列,将其定向插入到p EGFPN2中,经双酶切获取PI-EGFP的核苷酸序列,再将其克隆入原核表达质粒pET-28a(+),构建出pET-28a(+)-PI-EGFP的原核表达载体;重组质粒转化BL21(DE3)pLysS感受态细胞,经IPTG诱导表达,利用His-tag对蛋白进行分离纯化,SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹免疫分析(Western blot)鉴定纯化蛋白质。结果成功构建了pET-28a(+)-PI-EGFP的原核表达载体;其经诱导后,在大肠杆菌中高效表达,目的蛋白以可溶性形式存在;SDS-PAGE分析显示,在相对分子量约33kD的位置出现目的蛋白条带,与理论值相符;经His TALONTM Cartridge亲和层析纯化获得了高纯度的重组的PI-EGFP融合蛋白,Western blot鉴定结果显示获得了目的蛋白。结论成功构建出乳腺癌特异性转导小肽PI-增强型绿色荧光蛋白融合蛋白原核表达载体,并能够表达出PI-EGFP的融合蛋白,为进一步研究小肽的乳腺癌特异性转导功能奠定基础。     

幽门螺杆菌UreB与大肠杆菌LTB基因融合及表达的研究

目的　构建和表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位 (UreB)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位 (LTB)的重组融合蛋白 ,并对其基本的生物学及免疫学特性进行研究。方法　采用PCR技术从幽门螺杆菌染色体DNA中扩增出 1713bp的ureB基因 ,并克隆至pFS2 .2载体中与ltB基因融合 ,将ltB ureB融合基因插入改造后的原核表达载体PinPointTMXa Ⅱ ,并在工程菌E .coliJM10 9中诱导表达。结果　经序列分析 ,ltB ureB融合基因由 2 10 3个碱基组成 ,为编码 70 1个氨基酸残基的多肽。SDS PAGE和Westernblot检测发现 ,融合蛋白的相对分子质量 (Mr)约为 75× 10 3 ,并与幽门螺杆菌感染的阳性血清发生抗原抗体反应 ,ELISA检测显示 ,融合蛋白中存在LTB组分。同时发现所表达的融合蛋白无尿素酶活性 ,但保持与LT受体 神经节苷脂GM1结合的活性。结论　LTB UreB融合蛋白有可能用于幽门螺杆菌基因工程疫苗的研究     

人乳头瘤病毒58型L1壳蛋白在原核细胞中的高效表达及抗体制备

目的 人乳头瘤病毒58型（HPV58）是重要的高度致瘤性病毒之一。用原核细胞表达HPV58L1主要壳蛋白（McP）,并制备相应抗体血清,为基因工程疫苗研制打下基础。方法 用聚合酶链反应(PCR）扩增HPV58L1完整编码区基因,并克隆、测序。构建原核表达载体pRSETB58L1,表达的L1蛋白经SDS－PAGE纯化,免疫BALB／c小鼠。结果 在原核细胞中表达了HPV58L1壳蛋白,该壳蛋白的相对分子质量为60000,此蛋白与HPV16L1抗有交叉反应。获得抗HPV58L1壳蛋白特异性抗体,抗体滴度为1：80,并用该抗体屯昆虫细胞中表达的HPV58L1壳蛋白。结论 HPV58壳蛋白在原核细胞中获得的有效表达,纯化免疫小鼠后能产生抗HPV58L1特异性抗体,此抗体可用于鉴定真核细胞表达的HPV58L1壳蛋白。