乙肝病毒X基因对肝癌细胞表达RhoC的影响

目的：探讨X基因对肝癌细胞表达RhoC基因的影响。方法：用定向克隆的方法构建X基因的真核表达载体pcDNA3.1-X，脂质体转染HEPG2细胞;潮霉素选择培养稳定表达X基因的HEPG2-X细胞;免疫组化鉴定HEPG2-X细胞RhoC蛋白表达。结果：构建的真核表达载体pcDNA3.1-X在HEPG2细胞中有稳定表达，HEPG2-X细胞表达RhoC蛋白增强。结论：体外条件下，X基因可促进肝癌HEPG2细胞RhoC表达增强。这可能与肝癌的侵袭、转移有关。     

RhoC基因对肝癌细胞促血管生长因子表达的影响

目的:观察RhoC基因对肝癌HepG2细胞表达促血管生长因子（VEGF，bFGF）的影响。 方法:将pcDNA3.1-RhoC重组质粒和空载体pcDNA3.1转染HepG2细胞，用RT-PCR及免疫组化检测HepG2细胞的RhoC mRNA及RhoC蛋白表达情况;RT-PCR及免疫组化检测HepG2细胞VEGF和bFGFmRNA及蛋白的表达。将转染pcDNA3.1-RhoC重组质粒和空载体pcDNA3.1的HepG2细胞接种裸鼠，观察肿瘤的成瘤率。结果:与转染空载体pcDNA3.1的HepG2细胞相比，转染pcDNA3.1-RhoC重组质粒的细胞表达RhoC mRNA及RhoC 蛋白增强，其表达VEGF和bFGFmRNA及蛋白明显增强（P＜0.01）;重组质粒转染组成瘤率高于空载体组。结论:RhoC表达可促进HepG2细胞表达血管内皮生成因子。RhoC可促进肝癌细胞分泌促血管生长因子，可能是促进肝癌侵袭、转移的机制之一。     

RhoC-siRNA表达载体的构建及其对肝癌细胞体外侵袭能力的影响

目的构建RhoC-siRNA表达载体，研究其对肝癌细胞体外侵袭潜能的影响。方法以脂质体转染法稳定转染人SK-Hepl肝癌细胞株，Western印迹鉴定转染细胞中RhoC蛋白表达的抑制情况，观察转染前后细胞黏附、运动及体外侵袭能力的改变。结果酶切及测序证实RhoC—siRNA真核表达载体构建成功。通过Western印迹检测证实，转染RhoC—siRNA表达载体的肝癌细胞中RhoC蛋白表达抑制达60％，其黏附、移动及体外侵袭能力均降低。结论RhoC—siRNA表达载体能有效抑制RhoC在肝癌细胞株SK—Hepl中的表达，同时抑制细胞的侵袭转移潜能，为肝癌的生物学治疗提供新的方法。     

人RhoC基因正、反义真核表达载体的构建及对肿瘤增殖的影响

目的构建人RhoC基因正、反义真核表达载体，研究RhoC基因对胆管癌QBC939细胞株增殖的影响。方法应用分子克隆技术，用KpnⅠ和BamHⅠ双限制性内切酶从RhoC基因切下所需目的片段，然后将该片段正、反向定向克隆到真核表达载体pcDNA3.1／Hyg（＋）上，构建正、反义RhoC cDNA真核表达载体，以脂质体转染人胆管癌QBC939细胞，检测细胞生长曲线。结果经测序鉴定，将正、反义目的片段成功的连接到pcDNA3.1／Hyg（＋）载体上。结果序列测定证实RhoC基因正、反义.真核表达载体成功构建，反义RhoC基因抑制QBC939细胞增殖，正义RhoC基因促进QBC939细胞增殖。结论成功地将RhoC目的片段正、反向插入到pcDNA3．1／Hyg（＋）中，构建了人RhoC正、反义表达真核载体，RhoC基因调控QBC939细胞增殖。     

MAGE-A3基因过量表达对人肝癌细胞株SMMC7721的作用

目的 观察MAGE-A3基因过量表达对人肝癌细胞株增殖及侵袭能力的影响.方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从肝癌组织中制备出含NheI和KpnI酶切位点的MAGE-A3目的 基因,克隆到pcDNA3.1(-)真核表达载体,并通过酶切鉴定、测序验证.经脂质体法正义瞬时转染肝癌细胞株SMMC7721,通过RT-PCR、Western blot分别检测MAGE-A3 mRNA和蛋白表达产量.以噻唑蓝(MTT)比色法、Boy-den小室实验观察MAGE-A3基因过量表达对人肝癌细胞增殖及侵袭的影响.结果成功扩增出目的 基因;得到重组质粒pcDNA3.1-MAGE-A3,经过酶切鉴定与测序,结果正确;RT-PCR和Western blot检测显示,MAGE-A3基因mRNA及蛋白产物的表达水平明显高于未转染组和空载体组(3组MAGE-A3 mRNA量分别为7838、2847、1557,蛋白量分别为30938、24 088、29 654);转染组细胞数量增多,穿透Matrigel膜的细胞数显著增加,与未转染组和空载体组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 成功构建pcDNA3.1-MAGE-A3真核表达载体,转染人肝癌细胞株SMMC7721后可促进细胞增殖和侵袭能力,提示MAGE-A3基因在肝癌复发和转移中起到重要作用.     

pcDNA3.1(+)-ABCG2真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建人的ABCG2基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-ABCG2,并在ABCG2阴性SMMC7721肝癌细胞中表达.方法 以人的癌细胞为材料提取RNA,经反转录得到cDNA,利用PCR方法,根据人ABCG2基因62526032(NM_004827.2)序列信息设计引物,扩增ABCG2基因的CDS序列,将其克隆到pcDNA3.1+表达载体中.酶切及测序鉴定重组质粒正确后,脂质体介导转染至ABCG2阴性SMMC7721肝癌细胞中.采用Western blot法检测外源基因ABCG2的表达.结果 PCR扩增片段大小与理论片段大小相符,酶切大小与理论大小相符,阳性的克隆测序鉴定正确,表明人ABCG2基因克隆及真核表达载体pcDNA3.1(+)-ABCG2构建成功.在蛋白水平,转染72h后的细胞中外源基因ABCG2表达均明显增加.结论 成功构建重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-ABCG2,并在ABCG2阴性SMMC7721肝癌细胞中进行了表达.     

真核表达载体pcDNA3.1-β淀粉样前体蛋白裂解酶的构建及其在COS-7细胞中瞬时表达

目的 构建β淀粉样前体蛋白裂解酶（β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme，BACE）基因的真核表达载体，为修复阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）损伤神经元奠定基础。方法采用RT-PCR方法，从人的成神经细胞瘤的总cDNA中，扩增出1．5kb的BACE cDNA片段，再用BamHI和XhoI双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中，用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒；以免疫细胞化学法检测BACE基因的表达情况。结果人BACE基因的cDNA已克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1质粒中；经脂质体转染COS-7细胞后，并由潮霉素进行筛选，可见转染细胞胞浆中和胞膜上有较高量的BACE蛋白表达。结论成功构建了pcDNA3．1-BACE的真核表达载体，为研究BACE基因在AD发病机制中的作用及抑制BACE，为治疗AD奠定一定的实验基础。     

bFGF基因修饰雪旺细胞表达的实验研究

目的 利用基因工程技术将外源bFGF基因以质粒pcDNA3.1为载体导入大鼠雪旺细胞,观察外源bFGF基因在雪旺细胞中的表达水平.方法 通过预变性大鼠坐骨神经、混合酶消化法获取高纯度的雪旺细胞;将真核表达质粒pcDNA3.1及外源bFGF基因片段双酶切,酶切片段回收后重组bFGF-pcDNA3.1质粒;通过脂质体转染法将pcDNA3.1-bFGF质粒导入雪旺细胞,用EIASA及RT-PCR方法分别从蛋白质水平及mRNA水平检测bFGF的表达情况.结果 经外源bFGF基因修饰的大鼠雪旺细胞,bFGF的表达水平极大提高(H=126.835,v=2,P=0.000),并且相对持续、稳定.结论 bFGF基因修饰的雪旺细胞能持续稳定高水平地表达分泌bFGF,将bFGF基因与雪旺细胞移植载体相结合治疗脊髓损伤具有独特的优势,为下一步bFGF基因修饰细胞治疗大鼠脊髓损伤的实验研究奠定了基础.     

外源性CC10基因表达对肝癌细胞增殖、 凋亡、迁移和侵袭的影响

目的 探究外源性Clara细胞分泌蛋白10（CC10）的基因表达对肝癌细胞增殖、凋亡、迁移和 侵袭的影响,并探讨其可能的作用机制。方法 采用RT-qPCR和Western blotting检测人正常肝细胞LO2和 肝癌细胞HepG2、Hep3B中CC10的内源表达水平;将HepG2细胞系分为pcDNA 3.1组和pcDNA 3.1-CC10 组,用LipofectionTM分别转染pcDNA 3.1空载体质粒和重组质粒pcDNA 3.1-CC10。用CCK-8法、TUNEL 法和Transwell小室实验分别检测两组细胞增殖、凋亡情况及迁移、侵袭能力。采用RT-qPCR和Western blotting检测两组细胞中CC10和细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）的表达水平。结果 与正常肝细胞LO2相 比,CC10在肝癌细胞HepG2、Hep3B中呈明显低表达（P<0.05）;转染 pcDNA 3.1-CC10后的HepG2细胞内 CC10 mRNA和蛋白水平均显著增高（P<0.05）。与 pcDNA 3.1组相比,pcDNA 3.1-CC10组细胞活力受到抑 制,细胞活力以时间依赖性方式降低（P<0.05）,细胞迁移和侵袭实验中的过膜细胞数均低于pcDNA 3.1组 （P<0.05）,细胞凋亡率高于pcDNA 3.1组（P<0.05）。同时,Cyclin D1的mRNA和蛋白表达水平均明显降低 （P<0.05）。 结论? 外源性CC10基因表达可抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭,促进其凋亡,其机制可能与 下调Cyclin D1表达有关。     

肝癌特异性血管抑制疗法的真核表达载体的构建及其表达

目的构建受甲胎蛋白(AFP)增强子和白蛋白(Alb)启动子调控的含有血管抑制素(angiostatin)K5序列的真核表达载体,通过基因转染,将angiostatinK5基因导入肝癌细胞,观察angiostatinK5的表达。方法用RT-PCR法从正常人真核细胞扩增出angiostatinK5基因,将AFP增强子和Alb启动子调控序列定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1,并将angiostatinK5cDNA置于上述调控序列之下,从而构建得到重组真核表达载体pcDNA3.1-AFAB-angiostatinK5-His。利用细胞培养、脂质体介导的细胞转染,将angiostatinK5基因导入肝癌细胞。利用SDS-PAGE和Westernblot法检测肝癌细胞中angiostatinK5的表达。结果通过酶切鉴定及DNA测序证实目的真核表达载体pcDNA3.1-AFAB-angiostatinK5-His与预期的结果相同。SDS-PAGE及Westernblot分析证明,angiostatinK5在肝癌细胞中得以表达。结论构建的肝癌特异性重组真核表达载体可增加对AFP阳性肝癌细胞的治疗的特异性,并用于实现对肝癌的特异性血管抑制作用。