应用联合酶建立BALB/c鼠枯否氏细胞体外分离培养方法

目的用作用功效不同的酶联合消化分离BALB/c鼠枯否氏细胞(KC),建立简便易行,产量、活性、纯度较稳定的KC分离培养方法。方法将0.1%型胶原酶、0.2%链霉蛋白酶、0.01%Dnase酶按1∶1∶1比例混合原位灌注和离体消化肝组织,经Percoll梯度离心,贴壁培养纯化细胞,应用荧光显微镜观察、免疫组织化学染色、吞噬功能实验进行鉴定。结果KC获得率为(2~3)×106/鼠肝,细胞存活率达96%,免疫组化和吞噬实验鉴定细胞纯度达92%。KC贴壁后形态大小不规则,呈多角形或星形,免疫组织化学染色显示溶菌酶阳性,胞浆内见吞噬的碳素墨汁颗粒。结论用作用功效不同的酶联合消化KC,经梯度离心和贴壁培养,可获得高产量、高活性、高纯度的BALB/c鼠KC,为进一步研究KC在肝脏疾病中的作用提供可靠的细胞来源。     

Optiprep梯度离心法提取大鼠肝星状细胞的研究

目的探索SD大鼠肝星状细胞(HSCs)的提取方法,观察其生物学特性,为进一步研究它在肝纤维化和免疫应答中的可能机制奠定基础。方法依次采用前灌注液、0.15mg/ml的链霉蛋白酶E和0.5mg/ml的Ⅳ型胶原酶在体原位灌注消化肝脏。肝脏离体剪碎后,在0.3mg/ml链霉蛋白酶E、0.3mg/mlⅣ型胶原酶、0.02mg/ml DNA酶Ⅰ液中37℃振荡消化20min,低速离心(30g,5min)去除残余肝实质细胞,Optiprep密度梯度离心法获得纯化的HSCs。台盼蓝排斥试验评估HSCs细胞存活率;328nm紫外光激发HSCs自发蓝绿色荧光结合光镜鉴定细胞纯度;α-SMA免疫细胞化学方法鉴定HSCs;通过光镜观察HSCs的形态学变化。结果本方法,每只大鼠肝脏HSCs产量约8.2×106个,HSCs存活率在90%以上;原代培养24h后,纯度在85%以上;传1代后,纯度达95%以上。结论本方法简单、经济、实用,可获得较多的大鼠HSCs。     

分离肝星形细胞的简便方法

目的　建立一种简便而可靠的肝星形细胞 (HSC)的分离方法。　方法　雄性 SD大鼠 ,常规门脉穿刺插管 ,蠕动泵灌注不含钙 D- Hanks液后游离肝脏 ,先后用含链霉蛋白酶 E、 型胶原酶消化液 37℃体外灌注消化和振荡消化 ,细胞悬液过滤后 ,经 1 1 % Nycodenz密度梯度离心 (2 730 r/ min× 1 5 m in)分离 HSC,锥虫蓝染色排斥法鉴定细胞活率 ,以 1× 1 0 6 m L- 1 密度混悬后接种在培养瓶。结蛋白免疫细胞化学染色鉴定 HSC纯度。　结果　成功分离 HSC,细胞得率 (1 .2～ 2 .3)× 1 0 6 g- 1 肝组织 ,活率 >90 % ,纯度 >90 % ,可用于实验研究。　结论　链霉蛋白酶E和 型胶原酶体外灌注消化及 1 1 % Nycodenz密度梯度离心是分离大鼠 HSC简便、可靠的方法     

人肝脏星状细胞的一种改良分离方法

目的建立和改良人肝脏星状细胞(human-hepatic stellate cells,hu-HSCs)分离方法,使之适于原代培养和研究。方法在传统分离HSCs方法的基础上,省略链霉蛋白酶和DNA酶,用EGTA液促细胞解离,再用Ⅳ型胶原酶消化,差速离心去除肝实质细胞,最后用Nycodenz密度梯度离心纯化hu-HSCs,台盼蓝染色法计算细胞产量和进行活力评估,α-SMA、desmin免疫荧光染色及油红O脂滴染色鉴定细胞纯度。结果分离得到的原代hu-HSCs数量高达3×106个/克肝脏,纯度达98%;细胞传代后纯度达到100%。结论改良后的方法经济、快捷、高效,细胞得率及纯度大为提高,有利于建立在原代hu-HSCs基础上的研究。     

一种简便又经济的肝脏贮脂细胞分离方法

目的建立一种简便而经济的大鼠肝脏贮脂细胞的分离方法。方法采用链霉蛋白酶和Ⅳ型胶原酶循环灌注大鼠 肝脏后,以１１％Nycodenz密度梯度离心,分离肝脏贮脂细胞。结果细胞得率为２×１０～３×１０个／只,活力在９５％以上, 纯度超过９０％。结论本法简化了肝脏贮脂细胞的分离过程,使之既简便又经济,且细胞得率也较高。     

日本血吸虫感染小鼠肝星状细胞的分离

目的 探索稳定、高效的血吸虫感染小鼠肝星状细胞的分离方法. 方法 采用Ⅳ型胶原酶体外灌注、11.5％ Optiprep密度梯度离心、CD11b磁珠阴性分选方法相结合分离血吸虫感染小鼠肝星状细胞. 结果 11.5％Optiprep密度梯度离心后细胞得率可达到(7.66±2.43)×106个/鼠,存活率为96％～98％.CD11b磁珠阴性分选后肝星状细胞得率可达到(3.9±1.33)×106个/鼠,CD11b、F4/80双阴性细胞纯度为90.8％～95.8％. 结论 本实验建立的血吸虫感染小鼠肝星状细胞分离方法稳定、高效,能够有效去除kupffer细胞的污染,为进一步研究HSC在血吸虫病肝纤维化中的功能提供基础.     

大鼠肝星状细胞简便分离法及鉴定

目的：介绍一种简便、经济、稳定的大鼠肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）分离方法,为肝纤维化的研究提供细胞模型。方法：取符合标准的雄性SD大鼠,体重约400-450g,行肝脏门静脉插管,灌洗肝脏后,先后采用链酶蛋白酶、Ⅳ型胶原酶、DNA酶I灌注,消化肝脏制成细胞悬液,20％Nycodenz密度梯度离心分离得到原代HSC。Desmin及α—SMA抗体免疫组化鉴定纯度。结果：HSC得率2×10^7／每肝,细胞存活率及纯度达95％以上。结论：该法简便、经济,细胞得率和纯度稳定,是一种实用的大鼠HSC分离方法。     

小鼠肝星状细胞分离方法的优化

目的：建立一种高效稳定的小鼠肝星状细胞的分离方法,为进一步研究肝纤维化的机制奠定基础。方法：采用Ⅳ型胶原酶灌注消化法分离肝星状细胞,省略链酶蛋白酶的使用,利用肝星状细胞密度低的特性,使用Nycodenz进行梯度密度离心。结果：同时分离两只小鼠,使得细胞得率大大提高,细胞存活率和活力也能满足后续实验。结论 ：同时分离两只小鼠解决了细胞得率低的难题,建立了一种稳定高效的分离方法。     

大鼠肝星状细胞和枯否细胞的分离与培养方法

目的建立一种可以同时分离大鼠肝星状细胞(HSC)和枯否细胞(KC)的方法。方法选用SD大鼠,经胶原酶和蛋白酶灌注肝脏后,用18%Nycodenz密度梯度离心,分离大鼠HSC和KC,HSC处在界面,KC处在界面下。常规台盼蓝染色行细胞活力鉴定;荧光显微镜下观察自发荧光确定HSC的纯度;KC免疫细胞化学检测。结果成功分离大鼠肝星状细胞和枯否细胞,HSC得率为2×107/肝,KC得率为(3~6)×106/肝,活性>90%,纯度>90%。结论该方法建立的HSC和KC同时分离培养的方法,简单、易行、可靠,细胞纯度高,同时获得的细胞可保持良好的生物学性状。     

大鼠原代肝星状细胞的分离方法研究

目的 探讨分离肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)的有效方法.方法 采用链霉蛋白酶E (pronase E)和胶原酶(collagenase)灌注消化大鼠肝脏,12%Nycodenz密度梯度离心方法分离大鼠原代肝星状细胞.结果 原代肝星状细胞的细胞得率4×107/只大鼠,纯度为95%~98%,存活率96%.结论 肝脏消化酶灌注结合Nycodenz密度梯度离心是一种稳定的分离培养肝星状细胞的方法.