经Ⅱ型胶原修饰后的PLGA对诱导后的骨髓基质干细胞粘附及分化的影响

目的：了解单纯聚乙醇酸和聚乳酸共聚物(PLGA)以及经Ⅱ型胶原表面修饰后的PLGA，对诱导后的骨髓间充质干细胞(MSC)粘附、增殖及分化的影响。方法：抽取成年兔骨髓，流式细胞仪分离骨髓MSC，以含胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ)及转化生长因子β3(TGF-β3)的无血清F-12培养基诱导培养。取2周后MSC，接种于24孔培养板，其中Ⅱ型胶原修饰PLGA材料的12孔为实验组，对照组为单纯PLGA材料的另12孔。采用RT-PCR、细胞计数、免疫组化、MTT等方法检测细胞生长、粘附及分化情况。结果：诱导后的MSC，表达Ⅱ型前胶原mRNA，且能在经Ⅱ型胶原修饰的PLGA上粘附、增殖，并持续表达Ⅱ型胶原；而单纯PLGA使其脱分化。结论：Ⅱ型胶原能促进经诱导的MSC在PLGA上粘附、增殖并维持软骨细胞表型。     

转化生长因子-β3诱导大鼠前软骨干细胞成软骨分化的量效作用

目的研究转化生长因子-β3（TGF-β3）诱导大鼠前软骨干细胞（PSCs）向软骨方向分化的可行性以及剂量效应关系。方法在体外将分离纯化的大鼠PSCs置于含有不同剂量TGF-β3的诱导培养液中培养,依据其浓度分为5个实验组和1个对照组（不含TGF-β3）,观察细胞生长情况,分别进行Ⅱ型胶原的免疫组织化学检测及逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测Ⅱ型胶原mRNA表达。结果细胞生长良好。免疫组织化学检测对照组Ⅱ型胶原表达阴性,而含TGF-β3的诱导培养液诱导的各组细胞Ⅱ型胶原表达均阳性,其中10μg/L组阳性率最高。RT-PCR半定量检测也显示10μg/L组Ⅱ型胶原mRNA表达量最多,与其它组比较,差异均有显著意义（P〈0.05）。结论TGF-β3在体外能有效诱导PSCs向软骨细胞定向分化。TGF-β3对PSCs促分化作用存在剂量依赖性。     

犬骨髓基质干细胞分离培养与向软骨样细胞诱导分化的研究

【目的】探讨犬骨髓基质干细胞的提取、分离和体外扩增的最佳条件,研究其在体外培养中定向诱导分化为软骨样细胞的可能。【方法】从幼年犬骨髓中分离基质干细胞进行培养扩增,观察其生长特性,体外应用碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）和转化生长因子β1（TGF-β1）对第3代传代细胞诱导分化,并通过细胞的染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴定诱导分化细胞的类型。【结果】原代培养时形成由基质干细胞组成的细胞集落融合周期约6～9d左右。第3代传代细胞经碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）和转化生长因子（TGF-β1）诱导后,传代细胞在形态上呈软骨样改变;甲苯氨蓝异染性、阿新蓝染色阳性;Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性。【结论】犬骨髓基质干细胞在体外培养条件下生长良好和持续扩增,在碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）和转化生长因子（TGF-β1）作用下可被诱导分化为软骨样细胞。     

体外诱导骨髓间充质干细胞构建纤维蛋白胶软骨模块

目的:探讨体外构建骨髓间充质干细胞、改良纤维蛋白胶及生长因子的组织工程软骨模块的可行性。方法:分离兔骨髓间充质干细胞,种植在改良纤维蛋白胶支架内。实验组培养液中加入TGF-β1和BMP-6,对照组未加入诱导因子。体外进行形态组织学观察。1、2、3和4周取材作Masson染色、Ⅱ型胶原染色和扫描电镜观察。结果:细胞在支架上贴附,增殖。实验组中Masson染色可见胞浆及细胞周围有胶原形成;Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。结论:TGF-β1和BMP-6可诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化,在改良纤维蛋白胶支架内体外成功构建组织工程软骨模块。     

兔骨髓间充质干细胞体外软骨向诱导的实验研究

目的:体外分离培养兔骨髓间充质干细胞(MSCs),并定向诱导其向软骨细胞表型分化。方法:抽取兔股骨骨髓,经密度梯度离心与贴壁培养分离得到MSCs。用含有TGF-β、b-FGF、胰岛素、维生素C、转铁蛋白等的DMEM/Ham′s-F12培养基进行软骨向诱导。通过形态学观察,阿辛蓝-PAS特染及Ⅱ型胶原免疫组化染色,鉴定经过诱导后细胞的软骨细胞的表型。结果:兔MSCs原代细胞呈梭形,克隆样生长,经过诱导培养7d后,细胞形态由梭形、多角形变为椭圆形,胞浆丰富,细胞核和核仁清晰可见。阿辛蓝-PAS和Ⅱ型胶原染色阳性。结论:密度梯度离心与贴壁培养两种方法相结合可获得相对高纯度的MSCs,该细胞经诱导后可向软骨细胞分化。     

TGF-β_3诱导大鼠前软骨干细胞向软骨细胞特性方向分化及其在KLD-12自组装肽纳米凝胶中的培养

目的 探讨软骨组织工程方法 中修复软骨缺损理想的种子细胞和支架材料. 方法 免疫磁珠分离纯化新生大鼠前软骨干细胞(PSCs),分别采用KLD-12自组装肽纳米凝胶三维培养(实验组)和普通培养瓶平面培养(对照组),用转化生长因子β3(TGF-β_3)诱导两组PSCs向软骨细胞特性方向分化.利用RT-PCR、免疫组化等方法 测定其向软骨细胞特性方向分化过程中特异性细胞外基质Ⅱ型胶原(collagen Ⅱ)和聚集蛋白聚糖(aggrecan)表达的情况. 结果 RT-PCR和免疫组化检测结果表明KLD-12自组装肽纳米凝胶组细胞在诱导7、14 d后均有collagen Ⅱ和aggrecan表达,且RT-PCR检测结果表明KLD-12自组装肽凝胶组细胞的collagen Ⅱ和aggrecan mRNA表达水平较对照组高,其差异有统计学意义(均P＜0.05). 结论 TGF-β_3诱导后的PSCs可向成软骨方向分化,诱导后的PSCs与KLD-12自组装肽凝胶复合有望构建组织工程化软骨,KLD-12自组装肽纳米凝胶是较好的软骨组织工程细胞支架.     

兔骨髓间充质干细胞定向诱导移植修复关节软骨的实验研究

目的：通过诱导兔骨髓间充质干细胞（MSCs），观察干细胞向软骨细胞的分化效果。方法：纯化兔骨髓间充质干细胞；用含转化生长因子β1的诱导液培养骨髓间充质干细胞；以MTT测定诱导细胞的增殖活性；免疫组化检测Ⅱ型胶原蛋白的表达；诱导后的细胞移植于白兔膝关节内，X线摄片观察软骨修复形成情况。结果：诱导液可有效诱导MSCs向软骨细胞表型转化，且骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化所需的特异性细胞外基质——Ⅱ型胶原明显升高，移植后效果明显。结论：兔骨髓间充质干细胞定向诱导后移植修复关节软骨是有效的。因此骨髓间充质干细胞有可能成为软骨组织工程较理想的种子细胞来源。     

定向诱导骨髓间充质干细胞-藻酸盐复合物构建软骨组织

目的研究骨髓间充质干细胞(M SC s)经向软骨细胞定向诱导后,与藻酸盐复合,构建组织工程软骨的可能性。方法取大鼠股骨骨髓,经梯度离心法和贴壁法分离M SC s,经鉴定后用含转化生长因子1β10 ng/m l、地塞米松1-0 7m o l/L、转铁蛋白3 m g/m l、胰岛素2 m g/m l的诱导因子培养基对M SC s进行诱导,14 d后免疫组化检测Ⅱ型胶原分泌情况,将诱导后和未经诱导的M SC s以1×106/m l细胞密度与藻酸钙复合接种于裸鼠,分别于4周、8周后行组织学检测。结果经诱导的M SC sⅡ型胶原免疫组化阳性,与藻酸盐复合4周,HE染色可见软骨样细胞、软骨陷窝形成,阿辛蓝染色和M asson染色可见新生的软骨细胞和细胞外胶原,8周后软骨细胞明显增多,软骨细胞分泌胶原丰富,而未经诱导的M SC s无明显软骨细胞生成。结论M SC s经定向诱导后,可与藻酸钙复合在体内形成软骨样组织,可能发展为临床修补软骨缺损的一条有效途径。     

兔骨髓基质干细胞体外定向分化为软骨细胞

目的体外诱导兔骨髓基质干细胞（BMSC）向软骨细胞定向分化，并对分化后的细胞进行鉴定。方法选用16周新西兰大白兔，于胫骨或股骨抽取骨髓，经梯度离心、培养、扩增，取第3代BMSC按一定比例种植于6孔板中，并加入含有转化生长因子β1、地塞米松和维生素C的培养液、于不同时间点取材固定，甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴别、结果诱导的软骨样细胞甲苯氨蓝异染性；II型胶原免疫组化阳性。结论在本实验条件下，获取的兔BMSC生长稳定、增殖快，并成功地诱导其向软骨细胞表型转化。     

胎儿骨髓间充质干细胞在体外无支架下向软骨组织分化的探讨

目的　探讨骨髓间充质干细胞 (mesenchymalstemcells,MSCs)无支架条件下在体外向软骨组织定向分化的条件。方法　取引产胎儿骨髓悬液 ,经Percoll密度梯度离心 ,获取单个核细胞 ,细胞贴壁、扩增后 ,再以高糖DMEM(TGF β15ng/ml)进行成软骨细胞预诱导 ,4～ 7d后获得成纤维样单层贴壁的MSCs。以此MSCs为种子细胞 ,2× 10 6个细胞离心成团 ,在TGF β1与IGF Ⅰ及其它辅助成分的协同作用下 ,体外培养 3wk后形成组织团块。经固定、包埋、切片后行甲苯氨蓝染色 ,免疫组化方法测定特异性Ⅱ型胶原。通过图象分析软件检测组织块蛋白多糖和Ⅱ型胶原表达强度 ,并与胎儿正常软骨比较。结果　胎儿骨髓单个核细胞经过预诱导 ,细胞表达特异性Ⅱ型胶原 ,甲苯氨蓝染色蓝染明显增强 ;再经离心成团、体外诱导培养后形成有光泽软骨样组织块 ,其甲苯氨蓝染色呈蓝染 ,特异性Ⅱ型胶原为阳性表达 ,图象分析表明其蛋白多糖及Ⅱ型胶原表达强度与胎儿正常软骨相似。结论　胎儿骨髓间充质干细胞经高糖DMEM预诱导后可向软骨细胞分化 ;离心成团后 ,在TGF β1与IGF Ⅰ及其它辅助成分的协同作用下具有形成类软骨组织的能力 ,本实验建立的定向诱导培养系统在无支架条件下可使MSCs向软骨样组织分化。     

造血干细胞移植后免疫重建及其意义的研究进展

本文对造血干细胞移植后的免疫重建及其意义的研究进展作一综述,着重介绍移植后宿主体内T细胞、自然杀伤(NK)细胞及树突细胞(DC)数量和功能的变化。     

细胞培养技术的研究进展

随着现代科学的发展,体外细胞培养技术已成为多个领域必不可少的研究工具,并且其新技术和方法也在不断涌现。本文就细胞培养技术的发展、支架材料以及细胞培养的影响因素作一综述。     

人成纤维细胞产生的抑制因子对肿瘤和转化细胞增殖与分化的影响

对人成纤维细胞产生的抑制因子(HFDI)的细胞生长抑制效应进行研究,发现HFDI对肿瘤细胞~3H—TdR掺入抑制是由于使细胞变性坏死或促使细胞有限分化所致;并证明HFDI对PHA刺激的淋巴细胞转化的抑制,也是由于使转化细胞变性坏死或促使细胞向成熟方向发展所致。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

利用无血清培养和细胞克隆技术从孕鼠(14d)胚胎中分离出神经干细胞，并进行传代培养，采用免疫细胞化学技术检测神经巢蛋白和成熟脑细胞特异性抗原神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达，同时采用H-E染色法鉴定神经细胞类型。证实从大鼠胚胎大脑皮质分离出的细胞具有连续的克隆能力，并表达神经巢蛋白，分化的细胞表达神经元和神经胶质细胞的特异性抗原，为中枢神经系统的干细胞。     

EPCs在MSCs向肝样细胞转化中作用的初步探讨

目的：探讨内皮前体细胞(endothelial precursor cells, EPCs)在间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向肝样细胞转化中的作用。方法：分离培养SD大鼠MSCs和EPCs,取第3代MSCs向肝样细胞转化培养,培养过EPCs的无血清及因子的培养基(endothelial progenitor cell-conditioned medium, EPCs-CM)、无血清的α-最低必需培养基(alpha minimal essential medium, α-MEM)分别与肝细胞转化培养基按1∶1比例配置,作为实验组和模型对照组,正常α-MEM培养基为空白对照组,分别观察细胞形态及数量变化;在培养3、5、7、9 d时应用免疫荧光检测甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)、清蛋白(albumin, ALB)的表达。结果：空白对照组MSCs形态无明显变化;实验组与模型对照组细胞均出现肝样细胞形态。空白对照组未见AFP、ALB表达,模型对照组和实验组在3、5、7、9 d AFP、ALB表达水平均增高,其中实验组比模型对照组AFP、ALB水平增高明显。结论：EPCs在MSCs向肝样细胞转化中可能起一定的促进作用。     

Culture and Identification of Human Amniotic Mesenchymal Stem Cells

Objective To establish the method of isolation, purification, and identification of human amniotic mesenchymal stem cells （hAMSCs）. Methods hAMSCs were isolated from human amniotic membrane by trypsin-collagenase digestion, and cultured in Dulbecco＇s modified Eagle＇s medinm/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum. Phenotypic characteristics of these cells were analyzed by means of immunocytochemistry and flow cytometry. Results The cells successfully isolated from human amniotic membrane expressed representative mesenchymal cell surface markers CD44, CD90, and vimentin, but not CD45. Conclusions This study establishes a potential method for isolation of hAMSCs from human amnion, in vitro culture, and identification. The isolated cells show phenotypic characteristics of mesenchymal stem cells.     

大鼠胃壁细胞的分离及培养

目的　完成胃壁细胞分离及纯化 ,建立原代培养胃壁细胞的方法 .方法　制备大鼠翻转的胃囊用含链霉蛋白酶E的消化液注入胃囊内孵育 ,并用磁力搅拌器轻轻搅拌而制备单个的胃底腺细胞 ,Percoll梯度离心富集胃壁细胞 ,用含10 0 m L· L- 1 血清的 PBS或培养液 ,时差贴壁去除成纤维细胞 ,然后 ,将壁细胞接种于培养板中 ,培养液用无血清的 1∶ 1Harm's F- 12 / DMEM培养 ,内含胰岛素 5 mg· L- 1 ,氢化可地松 4μg· L- 1 ,转铁蛋白 5 mg· L- 1 ,硒酸钠 5μg· L- 1 ,牛血清白蛋白 2 g· L- 1 ,表皮生长因子 2 5 μg· L- 1 ,葡萄糖 1.98g· L- 1持续培养可达 1wk以上 .结果　获得的壁细胞经吖啶橙 (acridine orange,AO)鉴定纯度达 80 %以上 ,原代培养经HE染色可见壁细胞呈分散小组式生长 ,且生长状态良好 .结论　此方法适宜于大鼠胃壁细胞的分离及体外培养 ,为体外进一步研究壁细胞的功能打下基础 .     

新生豚鼠神经干细胞的分离培养、鉴定及标记

目的 从新生豚鼠海马中分离培养神经干细胞，为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋的实验研究创造条件。方法 分离新生豚鼠海马组织，用含碱性成纤维生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）无血清培养技术培养神经干细胞，免疫组化技术检测其巢蛋白（Nestin）的表达。采用荧光染料DAPI标记神经干细胞。结果 从新生豚鼠海马组织分离出的细胞中可获得呈集落样生长的神经干细胞团，并能表达Nestin；荧光染料的标记效率可达93．4％，细胞传代8次后荧光亮度仍无明显衰减。结论 从新生豚鼠海马分离的细胞具有明显的增殖能力，荧光染料的标记可获得较高的标记效率，可作为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋实验研究的供体细胞。     

睾丸支持细胞与骨髓间充质干细胞共培养的初步研究

目的 观察睾丸支持细胞(sertoli cells,SCs)与骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)共培养时SCs对MSCs扩增的影响. 方法 取雄性SD大鼠睾丸,分离出SCs,取SD大鼠,分离出骨髓MSCs,将两种细胞用"三明治"式的方法共培养7 d. 结果 共培养组的MSCs前四天生长较对照组快,第5天无明显差异,第6和第7天细胞数量迅速减少. 结论 在体外共培养的早期,SCs可以显著促进MSCs的生长,但在后期则反而抑制MSCs的生长,具体原因有待进一步研究.     

成人血源性间充质干细胞的分离和鉴定

目的建立一种分离、培养扩增成人血源性间充质干细胞(MSCs)的方法进行鉴定,并与骨髓源性MSCs比较生物学特性。方法30名成年志愿者随机平分为二组,一组直接抽静脉血,并细分为全血细胞法组和外周血密度梯度离心法组,同时抽骨髓为骨髓密度梯度离心法组;另一组为血细胞分离机法组。各组进行细胞存活率、集落形成率、形态学、流式表型分析、胶原染色等研究。结果外周血密度梯度离心法分离成人静脉血后培养,贴壁细胞呈梭形,集落形成率为(0.12±0.08)/106单个核细胞,传代扩增到第5代时每份平均细胞数达51.4674×106,表达CD44、CD54、CD105和CD166,不表达CD14、CD34、CD45和CD31,细胞分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原。全血细胞法和血细胞分离机法获得的细胞不能连续多次传代。结论外周血密度梯度离心法比全血细胞法和血细胞分离机法简单,贴壁细胞培养扩增容易,获得的血源性MSCs与骨髓源性MSCs的生物学特性相似。