流行性出血热病毒在原代地鼠肾单层细胞上的增殖

流行性出血热病毒(EHFV)通常采用非洲绿猴肾传代细胞(Vero-E_6细胞系)或人肺癌的Ⅱ型肺泡上皮细胞的传代细胞(A_(549)细胞系)增殖,但二者均为传代细胞。且A_(549)细胞乃来源于人的肿瘤组织,不宜用来制备疫苗。我们试将EHFV培养于原代地鼠肾单层细胞,获得了成功。 将EHFV76-118株的10％乳鼠脑悬液,按营养液1/10量接种于已长成单层的地鼠肾细胞,37℃吸附2h后,奔去接种浓,加含2％小牛血清的含糖Hank's液为维持液,置37℃温箱中孵育。从第3d开始,每天用直接荧光染色法观察细胞片,持续至接种后第13d,每次检查均能在细胞浆中观察到特异性EHFV抗原。     

陈旧组织切片HE染色方法探讨

目的应用磷酸盐缓冲液(PBS)对陈旧组织切片HE染色,探讨提高染色效果的方法。方法将甲醛固定10年的陈旧睾丸组织标本流水冲洗,0.01M PBS(pH 7.2～7.4)溶液浸泡,经脱水、透明、石蜡包埋、切片3～4μm。将睾丸组织切片分成A、B两组,A组流水冲洗50min,PBS浸泡12h,脱水置55～60℃烤箱中,透明、石蜡包埋、切片、60℃烤箱中烤4h,HE染色(苏木素染液加温到40℃)15min,30～40℃温水蓝化,伊红乙醇溶液加温到45～50℃,脱水透明封片;B无浸泡PBS,常规脱水、透明、切片,HE染色。结果 A组组织不易脱落,细胞核呈蓝色,胞浆呈粉红色,胞核与胞质分界清晰;B组组织容易脱落,部分细胞无着色,细胞核呈浅灰色,胞核与胞质分界不清。结论陈旧性组织用PBS溶液浸泡,脱水和HE染色时加温,能够达到细胞核染色清晰,胞质染色鲜明。     

大鼠心肌细胞低温下微管改变与冷缺血损伤相关性的研究

目的 研究4℃环境下心肌细胞微管的变化与冷缺血损伤之间的关系.方法 常规方法分离SD成年大鼠心肌细胞,随机分成对照组(单纯KB液保存)和实验组(KB液中含紫杉酚,浓度为10-6 M),利用免疫荧光的方法检测各组在4℃条件下,分别保存0.5和3 h后的微管网络结构的变化,同时利用生物化学比色法检测保存液中乳酸脱氢酶(LDH)含量,台盼蓝染色法显示细胞存活百分比.结果 经历4℃保存后,实验组微管平均光密度明显高于对照组,实验组微管网络形态分布比对照组完整,实验组乳酸脱氢酶释放量低于对照组,台盼蓝染色显示实验组细胞存活率高于对照组.结论 4℃环境下微管的解聚与心肌细胞损伤关系密切,稳定微管能减轻冷缺血引起的细胞损伤.     

改良人骨髓间充质干细胞分离方法提高细胞定向分化能力

目的 改良人骨髓间充质干细胞(hBM-MSCs)分离方法,提高细胞定向分化能力.方法 用密度梯度离心法从少量人骨髓中分离得到单个核细胞,贴壁培养3天后换液,实验组换液后72h内每隔12h更换新鲜培养液,传代时胰蛋白酶37℃作用2min后终止消化;对照组未经频繁换液,胰蛋白酶消化3min.镜下观察分离细胞的形态变化.用成骨、脂肪和软骨细胞诱导液诱导两组第3代(P3)细胞分化,碱性磷酸酶钙钴染色法、茜素红染色法和Von Kossa银染色法检测成骨细胞分化;油红O染色法检测脂肪细胞分化;阿尔新蓝染色法检测软骨细胞分化.结果 首次换液72h后,实验组与对照组相比,贴壁细胞数量较少但形态均一性高.不同染色结果显示:诱导分化成骨细胞14天时,实验组95%以上细胞分化,对照组为60%～70%;诱导分化脂肪细胞21天时,实验组50%～60%细胞分化,对照组为40%;诱导分化软骨细胞21天时,实验组90%以上细胞分化,对照组为60%～70%.结论 首次换液72h内频繁更换新鲜培养液和传代时缩短胰蛋白酶消化时间的方法能够提高hBM-MSCs的定向分化能力.     

眼球的HE整体染色石蜡包埋切片法

眼球切片标本的制作 ,传统方法是用火棉胶包埋切片染色法 ,石蜡包埋切片染色法也有许多报道 ,把ＨＥ块染色法[1 ] 应用于全眼球染色 ,用石蜡包埋切片 ,并进行了改进。结果 ;眼球各部结构染色层次清楚。经反复试验 ,效果良好 ,适合大量制作切片标本 ,方法如下。1　材料与方法1 .1　取材与固定处死动物 ,速取其眼球立即投入ＡＧＦＤ眼球固定液 (丙酮 1 0 0ｍＬ、冰醋酸 4ｍＬ、福尔马林 8ｍＬ、蒸馏水 6ｍＬ) ,1Ｗ后 ,将原液倒出一半 ,再加等量丙酮固定 5ｄ。1 .2　固定后处理将眼球从固定液中取出快速按视神经乳头的平行方向从上、下两侧对称…     

不同制备方法对冷沉淀质量的影响

1　材料和方法1.1　材料　选择 2 0～ 40岁无偿献血员 ,性别不限 ,各项体格检查指标合格 ,ACD(acid- citrate- dextrose)保养液抗凝袋及无菌空袋由上海血液中心提供 ,将含有 ACD保存液的 40 0m L全血离心分离血浆 ,并将血浆置于 - 2 0℃冰箱冷冻 ,制备冰冻血浆 .在制备冷沉淀时应用以下 4种方法进行融化 ,即A:将冰冻血浆置 4℃贮藏箱内慢速融化 ;B:置 0℃冰水浴中振摇融化 ;C:置 2 5℃水浴中振摇融化 ;D:冰冻血浆量 - 5℃～ - 10℃放置 10 h软化 ,再于 4℃融化 ,当用上述方法融化至少量冰渣存在时 ,30 0 0 r·min- 1 离心 10 m in,分离…     

三种肝保存液低温保存生物人工肝用C3A细胞的效果比较

目的比较UW液、Celsior液和HTK液4℃常规低温保存生物人工肝用C3A细胞的效果。方法制备好的C3A细胞悬液分以下3组:UW液保存组(UW液组);Celsior液保存组(CS液组);HTK液保存组(HTK液组)。各组细胞于4℃低温保存72 h后,分别测定细胞存活率及死亡率(流式细胞术),丙氨酸氨基转移酶(ALT)及乳酸释放,尿素合成功能及清蛋白分泌功能。结果 UW液及Celsior液比HTK液显著提高了4℃低温保存72 h的C3A细胞的存活率(78.56%±4.67%vs 76.03%±3.53%,60.54%±3.18%,P<0.05);抑制了C3A细胞低温保存时ALT释放及乳酸的释放(P<0.05);更好地维持C3A细胞尿素合成功能[(0.52±0.11)mmol/L vs(0.51±0.06)mmol/L,(0.32±0.05)mmol/L,P<0.05]和清蛋白分泌功能[(1.79±0.26)g/L vs(1.75±0.21)g/L,(1.20±0.17)g/L,P<0.05]。UW液同Celsior液4℃低温保存C3A细胞的效果无差异。结论同HTK液相比,使用UW液或者Celsior液4℃保存C3A细胞可以明显的提高复温后细胞存活率,降低低温损伤引起的ALT释放和乳酸释放,有效的保护肝细胞尿素合成功能和清蛋白分泌功能。     

UW液、Celsior液和HTK液低温保存生物人工肝用L-02细胞的效果比较

目的 比较UW液、Celsior液和HTK液4℃常规低温保存生物人工肝用L-02细胞的效果。方法 制备好的L-02细胞悬液分以下3组：UW液保存组（UW液组）;Celsior液保存组（CS液组）;HTK液保存组（HTK液组）。各组细胞于4℃低温保存72h后,分别测定细胞存活率及死亡率（流式细胞术）,ALT及LDH释放,尿素合成功能及白蛋白分泌功能。结果 UW液较Celsior液和HTK液显著提高了4℃常规低温保存保存72h的L-02细胞的存活率[(60.05 ± 4.23)% vs (50.12 ± 3.99)%、(44.20 ±4.67)%],均P<0.05;降低了细胞死亡率[(39.95±4.23)%vs (49.88 ±3.99)%、(55.80%±4.67)%], 均P<0.05;抑制了ALT、LDH释放(均P <0.05);更好地维持了L-02细胞尿素合成功能[ (1.03 ± 0.23)mmol/L vs (0.80± 0.14)mmol/L、(0.48± 0.05)mmol/L]和白蛋白分泌功能[(8.36 ±1.38 )mg/L vs (6.41±1.25)mg/L、(5.19±0.41)mg/L), 均P<0.05。结论 同Celsior液和HTK液相比,使用UW液4℃常规低温保存L-02肝细胞可以明显的提高复温后细胞存活率,降低低温损伤引起的ALT、LDH释放,有效的保护肝细胞尿素合成功能和白蛋白分泌功能,但保存时间不应超过72h。     

热休克蛋白70在人肝癌细胞SMMC-7721中的表达

1　材料和方法1.1　材料　人肝癌细胞 SMMC- 772 1由本室保存 ;鼠抗人HSP70单抗、FITC标记的羊抗鼠 Ig G购自 BOSTER公司 ;ENVISION HRP标记的羊抗鼠 Ig G(即用型 )为 DAKO公司产品 .1.2　方法　 1细胞的热休克处理 :接种 2× 10 4SMMC- 772 1于置有盖玻片的 2 4孔培养板中 ,37℃培养过夜 ;将培养板置42℃水浴 2 h,分别于休克后 4,8,12 ,16 ,2 4和 48h,收集细胞爬片 ,以甲醇∶丙酮 (V/ V=1/ 1) 4℃固定 15 min,PBS(p H7.4)洗涤后 ,室温干燥备用 .2免疫组化法检测 HSP70在肝癌细胞的表达 :采用 ENVISION(两步法 ) .细…     

离体肺组织切片的制备和孵育

目的建立一种简便有效的离体肺组织切片孵育方法。方法利用肺组织精细切片技术制备肺组织切片 ,以 0 .5mLKrebs Henseleit(K H)缓冲液作为孵育液 ,在 37℃培养箱内分别孵育 1、2、3、4h ,测定肺片的四甲基偶氮唑盐 (MTT)比色、乳酸脱氢酶 (LDH)释放率和三磷酸腺苷 (ATP)含量 ,以反映肺组织活性。结果肺片在 37℃培养箱内孵育 1、2、3、4h后MTT比色、LDH释放率和ATP含量均无统计学差异 (P >0 .0 5 )。结论应用 0 .5mLKrebs Henseleit(K H)缓冲液作为孵育液、在 37℃培养箱对肺片进行孵育时组织活性没有明显变化 ,可作为一种简便有效的孵育方法用于离体肺片研究     

冷丙酮固定剂在骨髓活组织塑料冷包埋切片免疫组化染色中的应用研究

目的:探讨骨髓活组织塑料冷包埋切片免疫组化染色技术在血液系统疾病诊断和治疗中的应用。方法:在不脱钙的骨髓活组织塑料冷包埋切片上,采用经典免疫组化技术SP染色法。结果:冷丙酮固定剂在骨髓活组织塑料冷包埋免疫组化染色中,效果优于Bouin固定液(P<0.05),-20℃操作条件下免疫组化结果优于4℃(P<0.05)。结论:冷丙酮固定骨髓活组织塑料冷包埋免疫组化染色技术,结果稳定,特异性高,敏感性强。     

离体肺组织切片的制备和孵育

目的建立一种简便有效的离体肺组织切片孵育方法.方法利用肺组织精细切片技术制备肺组织切片,以0.5 mL Krebs-Henseleit(K-H)缓冲液作为孵育液,在37 ℃培养箱内分别孵育1、2、3、4 h,测定肺片的四甲基偶氮唑盐(MTT)比色、乳酸脱氢酶(LDH)释放率和三磷酸腺苷(ATP)含量,以反映肺组织活性.结果肺片在37 ℃培养箱内孵育1、2、3、4 h后MTT比色、LDH释放率和ATP含量均无统计学差异(P>0.05).结论应用0.5 mL Krebs-Henseleit(K-H)缓冲液作为孵育液、在37 ℃培养箱对肺片进行孵育时组织活性没有明显变化,可作为一种简便有效的孵育方法用于离体肺片研究.     

快速石蜡包埋切片法代替冰冻切片法的初步体会

近几年来我科采用提高温度的方法 ,进行快速石蜡包埋切片法 ,以替代冰冻切片法。经 10 0多例的病理检验证明 ,结果满意 ,一般 30～ 40分钟可出诊断结果 ,而反复切多块检验约需 40～ 6 0分钟。1　方法要点1 1　试剂　 (1)混合固定液 :含 40 %甲醛液 10ｍｌ,95 %酒精 85ｍｌ,冰乙酸 5ｍｌ,三种药液混合而成 ;(2 )无水乙醇 ;(3)纯丙酮 ;(4)二甲苯。1 2　方法　 (1)试剂置温箱预热温度为 80℃～ 90。℃ ;(2 )标本取材 :①快检手术标本与普通石蜡切片取材大小相似 ,煮沸固定 1分钟 (混合固定液 ) ,取出后修整 (因高温固定 ,组织块变形 )比普通石…     

肾切片制作方法的改进

制作肾切片一般要经过取材、固定、切片、染色等程序 ,传统的方法是将动物致死后取材固定 ,但由于固定液渗透到组织内部需要一定的时间 ,而肾组织又易自溶 ,在固定液未渗透组织深处时 ,其组织结构已经发生了改变、残缺、细胞变形变位 ,所制出的切片效果甚差 ,难以满足教学和科研的需要。笔者对传统的固定方法作了改进 ,采用固定液活体灌注和肾脏表面滴加固定液的方法 ,效果很满意。1　材料与方法(1)将大白鼠进行腹腔麻醉后 ,用Ｚｅｎｋｅｒ液经心脏行灌注固定 ,同时切开腹腔在肾脏表面滴加固定液 ;(2 )灌注完毕后 ,置于 4℃冰箱内保存约 2 0…     

小鼠胚胎玻璃化冷冻保存影响因素的研究

胚胎置玻璃化1液(VS-1)(含10%甘油 20%1.2一丙二醇 20?S的PBS液)中平衡10或17min后装管置4℃或18℃玻璃化2液(VS-2)(含25%甘油 25%1.2一丙二醇 20?S的PBS液)中。随即投入液氮冷冻保存。结果显示:在VS-1液中平衡10min组的胚胎获较高成活率;4℃的VS-2液显著地改善囊胚冷冻后成活率;桑椹胚冷冻效果优于囊胚。将解冻后120枚胚胎移植于12只受体鼠,获36只成活仔鼠。     

表皮生长因子免疫阳性神经元在成年猴中枢神经系统的分布

目的 :探讨表皮生长因子 (EGF)在成年猴中枢神经系统的分布规律及功能 .方法 :健康成年雄性恒河猴 (体重 5kg) 1只 ,肌肉注射麻醉后开胸 ,Zamboni液 (4 %多聚甲醛 - 15 %苦味酸 -PBS ,pH 7 2～ 7 4 )心脏灌注固定后 ,取脊髓及脑组织各部位入Zamboni液后固定 ,再放入 30 %蔗糖溶液至组织块沉底 ,2 0 μm厚连续冰冻切片每10张取 1张 ,漂洗后经 3%H2 O2 处理 30min以封闭内源性过氧化物酶活性 ,0 3%TritonX - 10 0 /0 1%封闭用羊血清 (0 0 1MPBS配 )室温封闭 1h后 ,与一抗EGF特异性抗体 (工作浓度为 1∶10 0 )置 4℃冰箱孵育 2 4h ,…     

巴氏染色与苏木素-伊红染色在液基细胞涂片中应用研究

<正>我院2005年7月开始引进和应用液基薄层细胞制片(TCT)技术,采用新柏液基薄层细胞检测,为了比较苏木素-伊红(HE)染色法与巴氏染色法在液基细胞中的区别,我们对     

神经胶质纤维染色方法改进

神经胶质纤维染色以Ｈｏｌｚｅｒ磷钼酸结晶紫染色法最为常用 ,但该染色法的染色效果不佳 ,影响神经胶质瘤的诊断与鉴别诊断。笔者通过反复摸索实验 ,对神经胶质瘤染色方法进行了改进 ,收到良好的效果。1　方法与结果1 .1　方　法　　神经脑瘤手术标本 ,1 0 %甲醛液固定 ,石蜡包埋 ,切片 (厚 6～ 8μｍ)。常规脱蜡入水 ;0 .4%高锰酸钾水溶液处理 1 0～ 1 2ｍｉｎ ;自来水洗后置入 1 %草酸水溶液处理1ｍｉｎ ;蒸馏水洗涤 3ｍｉｎ ;磷钼酸溶液浸染 4～ 6ｍｉｎ ;将无水乙醇氯仿溶液滴于切片上 ,使切片呈灰白色为止 ;切片保持湿润 ,直接滴加结…     

不同脱钙方式观察牙髓组织切片的效果比较

目的比较乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetra-acetic acid,EDTA)脱钙法和复合酸脱钙法处理的牙齿石蜡切片的牙髓组织学形态特点。方法选用10%EDTA及复合酸(Plank-Rychlo)脱钙液,分别用于牙齿石蜡切片脱钙,通过记录脱钙时间,观察HE染色效果,评价室温下(20～28℃)2种不同脱钙液对切片制作的影响。结果 EDTA脱钙液处理的石蜡切片牙髓细胞、成牙本质细胞、牙本质小管结构清晰,色泽对比鲜明,但脱钙时间较长;Plank-Rychlo脱钙液脱钙速度相对较快,但染色较EDTA脱钙液稍显模糊。结论在制作牙齿石蜡切片观察牙髓组织学形态时,EDTA脱钙液和Plank-Rychlo脱钙液所制切片均能取得良好的染色效果。     

Bouin氏液二次固定时间对家兔肝脏纤维化Masson三色染色的影响

目的:探讨Bouin氏液二次固定时间对Masson三色染色效果的影响,进一步寻找Bouin氏液二次固定的最佳条件。方法:取5例肝纤维化模型家兔肝脏组织(10%中性福尔马林固定)的蜡块,切片、脱蜡后,用Bouin氏液二次固定,固定时间分别为0 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、过夜。进行Masson三色染色并用光镜和统计软件分析比较染色结果。结果:未经二次固定的切片与所有经过二次固定的切片染色评分比较,差异均有统计学意义(P0.05);二次固定过夜的染色效果最好,其与二次固定4 h染色评分比较,差异无统计意义(P0.05)。结论:Bouin氏液二次固定的肝纤维化切片的Masson三色染色效果优于仅经福尔马林固定的切片;二次固定4 h或过夜切片的染色效果最佳。