携带萤光素酶报告基因细胞筛选靶向RAC1的含氮取代甲酰胺蒽醌修饰物

目的:采用携带RAC1启动子基因片段及萤光素酶报告基因的肺癌细胞株A549-RAC1-Luc2,筛选靶向抑制RAC1表达的含氮取代甲酰胺蒽醌修饰物.方法:运用分子对接软件MOE分析含氮取代甲酰胺蒽醌修饰物与RAC1结合能力.采用MTT法检测目标化合物对肺癌A549细胞生长活性的抑制作用;以无细胞毒浓度的含氮取代甲酰胺蒽...     

含人DNA聚合酶β基因启动子萤光素酶报告载体的构建

目的:构建含人DNA聚合酶B(DNA polymerase beta,polβ)基因启动子的萤光素酶报告基因表达载体pGL3polβ/promoter.方法:利用PCR技术扩增人类polβ基因启动子的核心片段,克隆至含新霉素抗性的萤光素酶表达载体pGL3-Neo-enhancer,构建含DNA polβ启动子的萤光素酶表达载体pGLpolβ/promoter,重组子经双酶切、PCR及测序鉴定.将构建的载体用脂质体转染体外培养的食管癌EC-1细胞株,应用萤光素酶测定系统检测萤光素酶的表达活性.结果:测序结果表明,克隆获得的polβ基因启动子序列与GenBank报道的一致,且插入方向正确.pGL3polβ/promoter组萤光素酶的表达活性(2 207 348.000±71 626.763)与空白组(451.670±23.347)和pGL3.Neo-enhancer组(4 884.330±1 623.047)相比,差异有统计学意义(F=5 681.596,P<0.05).结论:成功构建了含人DNA polβ基因启动子的萤光素酶报告基因表达载体pGL3polβ/promoter.     

孕烷X受体应答元件萤光素酶报告基因的构建及活性检测

目的建立孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)应答元件萤光素酶报告基因,并检测其活性。方法利用化学合成方法得到五聚体PXR应答元件(everted repeat elelment-6,ER-6元件)5和(direct repeat element-3,DR-3)5序列;将五聚体PXR应答元件序列(ER6或DR3)克隆至p GL3-Promoter载体上;利用萤光素酶报告基因系统检测PXR应答元件报告基因的活性。结果 PXR应答元件萤光素酶报告基因具有明确的活性。PXR激动剂茴香霉素能够剂量依赖地诱导ER6-Luc(R2=0.95;P=0.002 2)和DR3-Luc(R2=0.96;P=0.000 91)报告基因的活性,其EC50值分别为(0.11±0.04)μmol/L和(0.13±0.06)μmol/L;PXR拮抗剂酮康唑能够剂量依赖地降低茴香霉素诱导的ER6-Luc(R2=0.97;P=0.000 85)和DR3-Luc(R2=0.98;P=0.000 11)的活性,IC50值分别为(0.71±0.11)μmol/L和(1.73±0.15)μmol/L。结论成功构建了PXR应答元件报告基因,建立了PXR转录活性的检测方法。     

ssp411基因siRNA表达载体的构建与有效干扰质粒的筛选

目的 为探索精子细胞特异表达的新基因ssp411在受精及早胚发育中的功能,设计并构建了以ssp411基因为靶点的RNA干扰表达载体siRNA-ssp411s,筛选其中对ssp411基因有显著干扰作用的表达质粒.方法 根据已知的ssp411 mRNA序列,选择设计三条带发卡结构的核苷酸序列,克隆到含有U6启动子的载体pRNAT-U6.1中并测序分析.用脂质体转染的方法将干扰质粒与表达质粒ssp411-pDsRed共转染293T细胞,24h后,荧光倒置显微镜观察转染效率,并收集细胞,通过实时定量PCR方法检测不同干扰质粒对ssp411 mRNA的干扰效果.结果 3个ssp411的siRNA片断被成功克隆到pRNAT-U6.1质粒载体中,插入片段测序结果与设计的序列完全一致.实时定量PCR结果表明,针对ssp411基因蛋白编码区3-22序列构建的干扰质粒效果最好,干扰效率可达71%.结论 成功构建了能表达ssp411 shRNA(small hairpin RNA)的重组质粒,同时通过共转染技术,筛选到一个干扰效果达70%以上的干扰片断,为建立转基因RNA干扰小鼠模型,在体内研究ssp411基因及蛋白的生殖生物学功能打好基础.     

特异性抑制单核细胞中EMMPRIN基因表达的siRNA筛选和鉴定

目的设计合成干扰细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)基因表达的不同小型干扰RNA(siRNA),筛选出能高效抑制单核/巨噬细胞中EMMPRIN表达的siRNA。方法根据人源EMMPRIN mRNA的序列,设计合成3对不同的且能干扰EMMPRIN基因表达的siRNA,将其转染THP-1单核细胞株,采用荧光定量PCR和蛋白印迹法评价基因表达情况。结果设计合成的3对siRNA中的2对siRNA可以特异性抑制单核细胞中EMMPRIN mRNA和蛋白表达(分别减少70%和50%,P<0.05)。结论成功设计合成了针对EMMPRIN基因的siRNA,并从中筛选出能特异且高效阻断EMMPRIN表达的siRNA,为进一步研究EMMPRIN基因对动脉粥样硬化形成的影响及其临床应用奠定了基础。     

特异性抑制单核细胞中EMMPRIN基因表达的siRNA筛选和鉴定

目的 设计合成干扰细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)基因表达的不同小型干扰RNA(siRNA),筛选出能高效抑制单核/巨噬细胞中EMMPRIN表达的siRNA.方法 根据人源EMMPRIN mRNA的序列,设计合成3对不同的且能干扰EMMPRIN基因表达的siRNA,将其转染THP-1单核细胞株,采用荧光定量PCR和蛋白印迹法评价基因表达情况.结果 设计合成的3对siRNA中的2对siRNA可以特异性抑制单核细胞中EMMPRIN mRNA和蛋白表达(分别减少70%和50%,P＜0.05).结论 成功设计合成了针对EMMPRIN基因的siRNA,并从中筛选出能特异且高效阻断EMMPRIN表达的siRNA,为进一步研究EMMPRIN基因对动脉粥样硬化形成的影响及其临床应用奠定了基础.     

带新霉素抗性的萤光素酶报告载体的构建

目的:构建带新霉素抗性的萤光素酶报告载体.方法:设计扩增新霉素抗性基闪neo,克隆人萤光素酶报告载体pGL3,得到pGL3-neo.分别比较pGL3、pGL3-CMV promoter瞬时转染组和经G418筛选的pGL3-neo、pGL3-neo-CMV promoter稳定转染组细胞萤光素酶活性.结果:PCR扩增出neo表达单元;酶切和DNA测序分析鉴定得到带新霉素抗性的萤光索酶报告质粒pGL3-neo.G418筛选可获得稳定转染pGL3-neO)细胞株和稳定转染pGL3-neo-CMV promoter的细胞株.荧光检测显示:瞬时转染pGL3组、pGL3-CMV promoter组及稳定转染pGL3-neo组、pGL3-neo-CMV promoter组萤光素酶活性值分别为1 047±86、1 504±107和34 819±l 479、456 109 4±15 791,稳定转染组萤光素酶活性均高于瞬时转染组,P<0.05.结论:成功构建了带新霉素抗性的萤光素酶报告基因载体,使报告基因检测数据的敏感性和可靠性显著提高.     

构建RNA干扰载体特异性抑制绿色荧光蛋白表达的研究

目的:利用PCR构建RNA干扰质粒载体的方法,促进RNA干扰技术的广泛开展.方法:PCR方法获得小鼠U6 27启动子序列,以及干扰绿色荧光蛋白(EGFP)表达的siRNA的相应DNA模板序列.将其序列克隆入pUC19,获得RNA干扰载体pU6-siEGFP.将pU6-siEGFP及pcDNA3.1/EGFP共转导COS-7细胞,观察EGFP表达情况.结果:所构建的pU6-siEGFP能够成功干扰COS-7细胞中EGFP的表达.结论:PCR方法成功构建了RNA干扰载体,为RNA干扰技术在更多实验室的广泛开展奠定基础.     

Mpl基因RNA干扰载体的构建及荧光显微镜筛选

目的:建立荧光显微镜快速筛选对血小板生成素受体(Mpl)基因RNA干扰片段的方法.方法:通过体外重组技术将Mpl与绿色荧光蛋白(GFP)构建成融合基因,克隆进pDs载体中产生pDs-Mpl-GFP载体,将人U6启动子及5个Mpl shRNA发夹结构(shMpl-A,shMpl-B,shMpl-C,shMpl-D,shMpl-E)分别克隆至pDs-Mpl-GFP真核载体中,构建出针对Mpl 5个不同位点的RNA干扰载体,然后将获得的上述干扰载体通过脂质体方法转染至293T细胞中,用荧光显微镜观察293T细胞的荧光发光强度及荧光细胞数,判定构建的RNA干扰载体对靶基因RNA的干扰效果.结果:构建的5个干扰载体都能对转染的293T细胞中的Mpl-GFP融合基因进行有效的基因敲减作用,在pDs-Mpl-GFP-TK-U6-shMpl-A、pDs-Mpl-GFP-TK-U6-shMpl-B与pDs-Mpl-GFP-TK-U6-shMpl-E的干扰作用下,293T细胞中的荧光强度及发荧光细胞数目变得更少和更弱,干扰效果较好,而其它两个效果较差;在这三个较好的干扰载体中,pDs-Mpl-GFP-TK-U6-shMpl-A的干扰效果最好.结论:成功构建Mpl基因的真核RNA干扰载体,并筛选出有效的RNA干扰片段.     

靶向MSTN基因shRNA表达载体的构建与鉴定

目的 旨在构建靶向MSTN基因的短发夹RNA (shRNA) 真核表达载体,并鉴定其在小鼠体内的抑制效果。方法根据MSTN基因的mRNA序列(NM_010834.3)设计siRNA,并挑选出3条可能具有良好干扰效果的siRNA,设计合成shRNA,构建pSIREN-MSTN-shRNA表达载体。通过肌内注射法将载体递送至小鼠体内,利用实时荧光定量PCR和Western blot法检测干扰后小鼠肌肉组织中MSTN的mRNA表达量和蛋白质表达水平。结果 测序鉴定表明pSIREN-MSTN-shRNA表达载体构建成功,3个重组质粒均能够明显降低肌肉组织中MSTN的mRNA和蛋白质水平,其中pSIREN-M819表达载体干扰效果最好,与对照组比较,MSTN的mRNA表达量降低了71%,蛋白水平也明显降低。结论 成功构建了pSIREN-MSTN-shRNA表达载体,并在小鼠体内能够有效抑制MSTN基因的表达。     

一种方便酶切鉴定的shRNA表达载体改建方法

目的 建立一种用单限制性内切酶酶切来快速筛选重组小发夹RNA(shRNA)表达载体的方法.方法 制备包含单一限制性内切酶Cta Ⅰ识别序列的双链DNA插入片段(Cla Ⅰ位点两侧碱基序列不互补).与BamH Ⅰ和Hind Ⅲ线性化的shRNA表达载体pSilencer-4.1(不含Cla Ⅰ识别序列)构建载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ.用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,将酶切产物与表达绿色荧光蛋白(GFP)shRNA的DNA模板(不含Cla Ⅰ识别序列)做连接反应.构建GFP shRNA表达质粒.提取阳性克隆质粒DNA,行Cla Ⅰ单酶切鉴定,对未被Cla Ⅰ线性化的质粒行DNA测序鉴定.结果 DNA测序表明正确构建了shRNA表达载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,以pSilencer-4.1-Cla Ⅰ为载体构建的GFPshRNA候选重组子中,不能被Cla Ⅰ线性化的均为GFP shRNA表达质粒.结论 构建了可用于制备shRNA表达质粒的通用载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,所引入的单一的Cla Ⅰ识别位点可以用来快速地筛选重组shRNA表达质粒.     

小鼠CCL20 mRNA实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的:建立检测小鼠脂肪组织中趋化因子CCL20(CC chemokine ligand 20)mRNA的实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)的方法。方法:分离小鼠脂肪组织细胞,经PMA和离子霉素刺激4 h后收集细胞提取总RNA并逆转录为cDNA。采用qRT-PCR方法检测趋化因子CCL20 mRNA的表达水平。评价该方法的特异性,同时应用该方法检测小鼠脂肪组织中趋化因子CCL20mRNA相对表达水平。结果:建立了小鼠脂肪组织中趋化因子CCL20的SYBR Green实时荧光定量PCR检测方法,结果显示该方法的熔解曲线为单峰,同时核酸电泳显示一条特异性条带。检测结果表明高脂饮食诱导的肥胖小鼠脂肪组织中趋化因子CCL20的相对表达水平明显高于正常饮食对照组(t=3.02,P<0.05)。结论:建立了检测小鼠脂肪组织中趋化因子CCL20 mRNA的实时荧光定量PCR方法,特异性好、灵敏性强,为进一步研究小鼠CCL20的生物学功能提供了实验基础。     

CAR菌TaqMan MGB探针法实时荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用研究

目的 建立特异、敏感、快速检测CAR菌的TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法。方法 针对CAR菌16S rRNA基因序列设计特异性引物和探针,建立MGB探针荧光定量PCR方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性。对2008~2012年期间采集的1344份临床标本中的CAR菌进行检测,同时进行普通PCR检测作为对照。结果 CAR菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有高度特异性,与肺炎支原体、侵肺巴斯德菌、支气管鲍特杆菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希氏菌、肺炎链球菌间无交叉反应,检测灵敏度达2.7拷贝。标准曲线显示各浓度范围内具有良好线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.22,TaqMan MGB探针荧光定量PCR效率为104.432%。对1344份标本进行检测,结果TaqMan MGB探针荧光定量PCR检出510份CAR菌阳性样本。TaqMan MGB探针荧光定量PCR能够直接从标本中检出CAR菌DNA,检测时间仅为40分钟。结论 TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有可靠、特异、敏感的特点,适用于CAR菌的快速检测。