荧光定量RT-PCR检测OATP-E基因表达

目的：建立荧光定量RT-PCR检测肿瘤细胞有机阴离子转运多肽E(organic anion transporting polypeptide-E,OATP-E)mRNA的方法，了解乳腺癌细胞株MCF-7和对阿霉素耐药的乳腺癌细胞株MCF-7/ADR中OATP-E mRNA的表达水平。方法：构建重组质粒，绘制荧光定量RT-PCR检测OATP-E mRNA的标准曲线，并运用此方法检测MCF-7/ADR和MCF-7细胞株中OATP-E mRNA的表达。结果：荧光定量RT-PCR检测MCF-7和MCF-7/ADR细胞OATP-E的基因表达，重复10次实验所得结果平均分别为5.47×105拷贝数/μg RNA和2.82×104拷贝数/μg RNA，两者相差约19.4倍，P＜0.05。结论：成功建立了荧光定量RT-PCR检测OATP-E基因表达的方法，检测结果用绝对拷贝数表示，定量准确可靠，并有利于标准的统一。初步应用发现乳腺癌耐药株MCF-7/ADR中OATP-E mRNA的表达量比不耐药株MCF-7减少。     

实时定量PCR检测自然流产患者HLA-G mRNA的表达

目的:检测HLA-G mRNA在自然流产患者绒毛组织中的表达,探讨HLA-G与自然流产的关系。方法:取8例正常妊娠早孕人工流产(对照组)与6例自然流产绒毛组织(实验组),采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)检测对照组和实验组绒毛组织HLA-G mRNA表达水平。结果:自然流产组HLA-G mRNA的相对表达量(0.026±0.012)明显低于正常妊娠早孕人工流产组的HLA-G mRNA的相对表达量(1.883±1.774),差异有统计学意义(P<0.05)。结论:HLA-G mRNA在绒毛组织的表达异常可能与自然流产的发病有关。     

SYBR Green实时定量PCR检测急性髓系白血病患者BAALC基因表达

目的:观察SYBR Green相对定量逆转录聚合酶链反应(RQ-PCR)方法检测急性髓系白血病(AML)患者外周血单个核细胞(PBMC)中脑和急性白血病细胞胞质(BAALC)基因mRNA的表达水平。方法:分离12例初发AML患者和5名健康成年人PBMC,以白血病细胞株K562为阳性对照,提取细胞总RNA并逆转录为cDNA,SYBR Green相对定量RQ-PCR检测BAALC基因表达水平。结果:健康成年人PBMC中检测不到BAALC mRNA的表达,12例AML患者中,有8例BAALC mRNA高表达,与K562比较,其相对值为K562的0.8~5.6倍。结论:用SYBR Green相对定量RQ-PCR可以检测到AML患者PBMC中BAALC基因的表达,该方法稳定、敏感、可靠。     

实时荧光定量PCR检测核糖体蛋白S13基因在NK/T细胞淋巴瘤中的表达

目的应用实时荧光定量PCR技术检测NK／T细胞淋巴瘤核糖体蛋白S13（RPS13）基因的表达。方法提取石蜡包埋NK／T细胞淋巴瘤组织总RNA,逆转录为cDNA。应用实时荧光定量PCR技术检测NK／T细胞淋巴瘤RPS13表达水平。结果20例NK／T细胞淋巴瘤RPS13表达水平明显低于对照．结论RPS13基因表达水平明显低于正常人外周血淋巴细胞,这可能在NK／T细胞淋巴瘤发生、发展中起到一定作用。     

实时定量PCR检测小鼠成熟过程中T淋巴细胞sjTRECs水平

目的:实时定量PCR检测正常小鼠成熟过程中胸腺及脾脏T淋巴细胞的信号结合T细胞受体重排删除DNA环(sjTRECs)含量,从而推测T淋巴细胞中的初始T细胞的数目,评价小鼠成熟过程中的胸腺功能.为胸腺发育和功能研究及胸腺研究模型的建立提供研究依据和方法.方法:实时定量PCR(SYBR Green法)检测T淋巴细胞中sjTRECs含量.结果:1～6 wk的小鼠胸腺中的初始T细胞含量持续增加,9wk时已经开始下降,12 wk时持续下降.而小鼠的外周中初始T细胞的含量则随着周龄增加而增加(1～12wk).结论:在小鼠的成熟过程中,从9wk开始胸腺的生成功能减弱,而胸腺的输出功能持续增加;成功建立和应用实时定量PCR检测小鼠T淋巴细胞中sjTRECs含量,是准确评价小鼠胸腺功能的方法.     

荧光定量PCR法对糖尿病大鼠肾脏BAX基因表达的检测

目的:对单肾切除糖尿病大鼠肾脏中BAX基因mRNA的拷贝数进行精确定量,以探讨糖尿病肾病的发病机制。方法:以SYBRGreenI作为定量检测中荧光染料,采用实时荧光定量PCR法,对单肾切除糖尿病模型组和单肾切除对照组大鼠肾脏中BAX基因的转录水平进行检测。结果:糖尿病模型组中BAX转录拷贝数明显高于对照组。结论:糖尿病大鼠肾脏中存在BAX基因的转录异常,细胞凋亡亢进可能参与糖尿病肾病的发生发展。     

实时荧光定量PCR法检测肾移植术后BK病毒感染及意义

目的检测肾移植患者术后BK病毒DNA并探讨其临床应用价值。方法应用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)对86例同种异体肾移植患者术后血液及尿液标本进行BK病毒DNA检测。结果 86例肾移植患者中,尿BK病毒DNA阳性12例(14.0%),血液BK病毒DNA阳性6例(7.0%)。BK病毒DNA血、尿均为阳性5例患者中有4例经肾脏穿刺病理活检确证为BK病毒相关性肾病(BKVAN)。结论尿液BK病毒检测能够早期发现BK病毒感染,结合血液BK病毒检测为早期诊断、治疗并预防肾移植术后BKVAN提供重要的依据。     

多通道实时荧光定量PCR检测HPVDNA结果分析

目的探讨多通道实时荧光定量PCR检测HPVDNA的效果,并应用于日常检测工作。方法对临床1100例宫颈分泌物标本采用多通道实时荧光定量PCR仪进行8种高危HPVDNA分型及定量检测。8种高危HPV型别为主要高危型HPV16、18、45、31和次要高危型HPV33、52、58、67。结果在1100例标本中排除了14例B球蛋白为阴性的标本,剩余1086例标本总体的内标平均值为3．71×10^6IU／ml。随机重复性试验和对每个型别的各浓度标本进行的重复性试验每次扩增均为阳性,型别符合率为100％。共检测出阳性标本287例,HPV16、HPV18／45、HPV31、次要高危型和合并感染各有46、17、14、146和64例,分别占总阳性标本的16％、6％、5％、51％和22％。所有标本绝对定量值的分布近似于正态分布。结论多通道荧光定量PCR检测HPVDNA灵敏度高、复性好,可用于临床HPV感染的筛查与宫颈病变程度预测以及患者术后疗效观察。     

实时荧光定量PCR检测非小细胞肺癌中cdk4基因表达

肺癌的病死率在我国位于恶性肿瘤的前列.细胞增殖周期调控异常是恶性肿瘤的一个重要特征[1],调控细胞周期进程分子机制的核心是细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependenet kinases,CDK)的活性表达与调控,CDK与细胞周期蛋白 1(cyclin D 1)等相结合而激活蛋白激酶活性推动细胞从G1期向S期过渡[2],启动DNA合成,使细胞从G1期进入S期,使细胞分裂加速.     

实时荧光定量PCR检测糖尿病大鼠视网膜中转化生长因子β受体Ⅰ和受体Ⅱ基因表达

目的:定量检测转化生长因子βⅠ型受体(TβRⅠ)和Ⅱ型受体(TβRⅡ)编码基因在糖尿病大鼠视网膜中的表达,以探讨转化生长因子β及转化生长因子β受体在糖尿病视网膜病变中的作用.方法:选择健康成年SD大鼠28只,随机分为正常对照组和糖尿病组.利用链尿佐菌素(STZ)诱导大鼠糖尿病视网膜病变模型,制备RNA并逆转录,实时荧光定量PCR技术分析TβRⅠ和TβRⅡ在4周、12周时相对于内参照基因18S的相对mRNA含量.结果:正常对照组TβRⅠ在4周、12周时相对于18S mRNA含量分别为0.000 332±0.000 088和0.000 344±0.000 232,TβRⅡ在4周、12周时相对于18S的mR-NA含量分别为0.000 099±0.000 031、0.000 103±0.000 049.糖尿病组TβRⅠ在4周、12周时相对于18S的mRNA含量分别为0.000 493±0.000 133和0.000 608±0.000 232,TβRⅡ在4周、12周时相对于18S的mRNA含量分别为0.000 166±0.000 057和0.000 113±0.000 049;TβRⅠ基因表达水平随着病变进展呈上升趋势,TβRⅡ在4周时表达量较正常增加,到12周时表达量又减少,逐渐恢复到正常水平.结论:TβRⅠ和TβRⅡ基因表达量的改变可能与糖尿病视网膜病变的发生发展有关.     

实时荧光定量PCR检测丙型肝炎病毒

目的探讨实时荧光定量PCR（FQ—PCR）技术检测丙型肝炎病毒（HCV）RNA载量与抗-HCV及丙氨酸氨基转移酶（ALT）异常的相关性。方法用FQ—PCR检测115份疑似HCV感染的病人血清HCV—RNA，ELISA法检测抗-HCV，全自动生化分析仪测定ALT。结果以80拷贝／ml血清为标准，115份标本中HCV—RNA阳性率为54．8％（63／115）；抗-HCV阳性率为53．9％（62／115）；ALT异常率为40．9％（47/115）。HCV—RNA载量与抗-HCV（＋）例数呈正相关（r=0．986，P〈0．01）。HCV—RNA载量与ALT异常例数（r=0．94，P〈0．01）、含量（r=0．624，P〈0．01）呈正相关。结论HCV—RNA载量升高，抗-HCV阳性率相应增加，ALT高于正常值（40U／L）的异常率和浓度也增高，均呈正相关。FQ—PCR法可作为临床检测丙型肝炎的确诊方法之一。     

实时荧光定量测定人B细胞激活因子受体基因表达水平

目的：建立实时荧光定量聚合酶链反应（RFQ-PCR）检测人B细胞激活因子受体（BAFF-R）含量的方法，及探讨其在外周血单个核细胞（PBMC）中BAFF-RmRNA表达的检测价值。方法：在BAFF-R基因高保守区设计特异性引物和荧光探针，用逆转录（RT-PCR）扩增目的片段实时检测产物的荧光强度，根据标准品建立标准曲线，由软件自动计算出待测样本中BAFF-RmRNA含量，并以BAFF-RmRNA和132MmRNA含量的比值进行BAFF-R表达水平评价。结果：RFQ-PCR检测BAFF-R含量的线性范围为10^∧9～10^∧1pg／ml，低浓度样本批内和批间变异系数（CV）分别为12．5％和11．9％，高浓度样本批内和批间CV分别为8．3％和9．3％。30名健康献血员样本的PBMC中，83％（25／30）有BAFF-RmRNA表达，范围为0．14-1．03。结论：RFQ-PCR检测BAFF-mRNA含量的方法，具有较好的检测灵敏度和重复性。     

实时荧光定量PCR检测大鼠耳蜗螺旋神经节神经元NMDA受体亚单位的基因表达

目的了解大鼠耳蜗螺旋神经节神经元(SGN)中NMDA受体亚单位的基因表达水平,为进一步探讨SGN中NMDA受体的功能提供依据。方法利用倍比稀释的出生3 d的大鼠正常脑组织CDNA构建NMDA受体亚单位NR1、NR2(A～D),NR3(A～B)与甘油醛-3磷-酸脱氢酶(GAP-DH)基因的相对标准曲线,通过实验验证NR1、NR2(A～D),NR3(A～B)分别和内参基因GAPDH是否有一致的扩增效率,应用△Ct法对NMDA受体各亚单位的表达进行相对定量。结果 NMDA受体亚单位中由高到低依次为NR2B、NR3A、NR1、NR2D、NR3B、R2A、NR2C;除NR2D与NR3B外,其余各亚单位之间比较均有统计学意义(P<0.01)。结论实时荧光定量PCR可以对SGN中NMDA受体亚单位的表达进行全面定量分析,进一步证实了NMDA受体各亚单位在耳蜗SGN中的表达水平。     

实时荧光定量PCR检测外周血TREC的方法研究

目的建立及优化检测移植后患者外周血TREC拷贝数的实时荧光定量PCR（FQ-PCR）的方法及实验影响条件，为临床研究造血干细胞移植的免疫功能重建机制提供方法学基础。方法在ABI7000 PCR仪上实时扩增检测构建的TREC质粒标准品，摸索最佳扩增条件及建立标准曲线，然后用优化的FQ-PCR方法检测临床样本。结果T3、T4引物和R3、R4引物的扩增效率分别优于T1、T2引物和R1、R2引物。TaqMan-MGB探针比普通的TaqMan探针扩增效率高。金牌热启动Taq酶，比较普通Taq酶而言。提高了PCR的特异性和敏感性。FQ-PCR的反应条件设定：95℃10min后95℃5s，53℃30s，40循环结束。结论通过摸索与优化实验条件，建立了实时荧光定量PCR检测外周血单个核细胞中TREC的方法。     

实时荧光定量聚合酶链反应检测对结核病的诊断价值

目的 探讨实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)(Gene-xpert)检测对结核病的诊断价值.方法 随机选取我中心在2019年4月至2020年2月就诊的结核病患者共100例作为研究对象,将给予涂片抗酸染色法视为对照组,将给予实时荧光定量PCR检测视为研究组,研究观察2组患者的检出率、灵敏度和特异度、实时荧光定量PCR检测...     

实时荧光定量PCR在检测人ANP基因表达的应用

目的 建立心房钠尿肽(ANP)基因mRNA表达水平的实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法进行初步评价.方法 以基因表达产物为模板,建立实时荧光定量PCR检测方法,对样本中的心房钠尿肽含量进行相对定量,比较不同样本组的基因表达水平.结果 所建立的实时荧光定量PCR方法熔解曲线中熔解峰单一.肺癌患者胸腔样本的ANP含量为对照样本的4.68倍,血清样本为对照样本的16.03倍.结论 所建立的ANP实时荧光定量PCR检测方法具有较高的特异性.肺癌患者胸腔液和血清中ANP的含量明显增高.     

实时荧光定量PCR检测不同舌苔黏膜组织中PLOD1基因表达水平

目的应用实时荧光定量PCR检测不同舌苔黏膜组织中赖氨酰羟化酶(PLOD1)基因表达,分析该基因表达量与不同舌苔之间的关系。方法通过RT-PCR逆转录得到正常胎儿和五种病理性舌苔黏膜组织的cDNA,再经实时荧光定量PCR,测定PLOD1基因在不同舌苔黏膜组织的定量表达,观察其表达量的变化趋势。结果检测发现PLOD1基因在病理性舌黏粘膜组织中表达量递减趋势为:白薄苔组>黄薄苔组>黄厚苔组>白厚苔组>无苔组>正常组;其中再与无苔组PLOD1基因拷贝比值倍比分别呈2.97、2.68、2.21、1.50倍。结论PLOD1基因在病理性舌苔黏膜组织表达量的改变,影响舌苔性质。     

HCV-RNA实时荧光定量的临床价值

目的评价实时荧光定量聚合酶链反应(RFQ-RT-PCR)检测丙型肝炎病毒(HCV-RNA)在临床中的应用价值。方法用RFQ-RT-PCR检测325例肝炎病人标本,并同时采用ELISA检测抗-HCV,了解样本中HCV-RNA含量与抗-HCV的相关性。结果325份标本中有15例HCV-RNA含量高于1000拷贝/ml,18例抗-HCV阳性。经统计分析,两者有明显的相关性。结论RFQ-RT-PCR技术检测HCV-RNA特异性强,灵敏度高,具有良好的应用价值。     

实时定量PCR评价小鼠胸腺功能方法的建立

目的建立实时定量PCR检测小鼠胸腺及脾脏T淋巴细胞中信号结合T细胞受体删除环（sjTRECs）水平的方法。推测其中的初始T细胞的数目,评价胸腺功能,从而为胸腺功能研究及胸腺研究模型的建立提供研究依据和方法。方法提取小鼠胸腺和脾脏淋巴细胞基因组DNA,PCR扩增目的片段。纯化构建标准质粒的RAG2片段,构建标准重组质粒并鉴定。优化PCR体系后,实时定量PCR反应建立标准曲线,并检测不同品系（BALB／c和C57BL／6）成年小鼠胸腺及脾脏淋巴细胞sjTRECs含量。结果成功构建标准质粒。确定最适实时定量PCR反应条件后,在实时定量PCR中建立可信度高的标准曲线。建立的方法分析表明,这两个不同品系的sjTRECs含量统计学差异不显著。结论成功建立定量检测小鼠T淋巴细胞中sjTRECs含量从而推测其中的初始T细胞数目的方法。为胸腺功能研究及胸腺研究模型的建立提供研究依据和方法。     

实时荧光定量PCR检测白血病患者WT1基因表达及临床意义

目的 研究白血病患者WT1基因的表达水平及与临床预后的关系.方法 建立实时荧光定量PCR检测WT1基因表达技术,并分析65例白血病患者WT1基因的表达水平及与临床预后的关系.结果 建立的实时荧光定量PCR方法的标准曲线相关系数＞0.99.急性髓性白血病(AML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)患者WT1基因表达水平较正常对照组均显著升高(P=0.001).慢性髓性白血病(CML)急变期患者WT1基因表达水平显著高于慢性期.WT1表达量与急性白血病发病时外周血白细胞计数、血红蛋白、血小板无明显相关关系.AML和ALL患者中WT1基因高表达患者与低表达病例CR率差异无显著性.急性白血病患者治疗缓解后WT1的表达量较治疗前显著下降(P=0.032).随访显示WT1持续高表达或下降后又上升的患者呈现难治及复发.结论 实时荧光定量PCR技术检测急性白血病患者WT1基因表达量可预测难治复发及用于MRD的检测.