针对CTGF的siRNA对高糖诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的 探讨针对结缔组织生长因子（CTGF）基因的siRNA对高糖条件培养下的人肾小管上皮细胞株HK-2细胞向间充质细胞转分化（EMT）的影响。方法 将体外培养的HK-2细胞分为6组：(1)正常对照组,培养基含D-葡萄糖1g/L;(2)等渗对照组,培养基含D-葡萄糖1g/L,甘露醇3.5g/L;(3)高糖组组,培养基含D-葡萄糖4.5g/L;(4) 高糖+空白对照组：细胞转染空白质粒后于高糖培养基中培养;(5) 高糖+阴性对照组：细胞转染含无关序列的重组质粒后于高糖培养基中培养;(6) 高糖+干扰组：细胞转染针对CTGF的 siRNA表达质粒后于高糖培养基中培养。应用RT-PCR检测CTGF mRNA水平,Western blot法检测CTGF、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）蛋白水平。结果 高糖刺激可上调HK-2细胞的CTGF mRNA及蛋白水平,并呈时间依赖性降低HK-2细胞的E-cadherin蛋白表达水平,升高α-SMA蛋白表达水平。而通过特异性siRNA抑制CTGF mRNA表达后,细胞的CTGF蛋白表达随时间延长进行性降低,同时伴有细胞E-cadherin蛋白表达升高,α-SMA蛋白表达水平降低。结论 证实了CTGF是高糖诱导HK-2细胞EMT的重要介质。针对CTGF的siRNA能明显改善高糖诱导的肾小管上皮细胞EMT,为进一步寻找DN防治的靶点提供了新的实验依据。     

siRNA沉默CTGF表达对高糖诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的探讨针对结缔组织生长因子(CTGF)基因的siRNA对高糖条件培养下的人肾小管上皮细胞株HK-2细胞向间充质细胞转分化(EMT)的影响。方法将体外培养的HK-2细胞分为6组:(1)正常对照组,培养基含D-葡萄糖1g/L;(2)等渗对照组,培养基含D-葡萄糖1g/L,甘露醇3.5 g/L;(3)高糖组,培养基含D-葡萄糖4.5 g/L;(4)高糖+空白对照组:细胞转染空白质粒后于高糖培养基中培养;(5)高糖+阴性对照组:细胞转染含无关序列的重组质粒后于高糖培养基中培养;(6)高糖+干扰组:细胞转染针对CTGF的siR-NA表达质粒后于高糖培养基中培养。应用RT-PCR检测CTGF mRNA水平,Western blot法检测CTGF、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白水平。结果高糖刺激可上调HK-2细胞的CTGFmRNA及蛋白水平,并呈时间依赖性降低HK-2细胞的E-cadherin蛋白表达水平,升高α-SMA蛋白表达水平。而通过特异性siRNA抑制CTGF mRNA表达后,细胞的CTGF蛋白表达随时间延长进行性降低,同时伴有细胞E-cadherin蛋白表达升高,α-...     

结缔组织生长因子介导高糖诱导肾小管 上皮细胞肥大的机制

 【目的】 研究高糖诱导肾小管上皮细胞肥大的作用途径及可能机制｡【方法】 HK-2细胞分正常对照组(培养基含葡萄糖1 g/L),等渗对照组(葡萄糖1 g/L + 甘露醇3.5 g/L)和高糖组(葡萄糖4.5 g/L)培养｡收集各组培养至24 h,48 h,96 h的细胞,检测结缔组织生长因子(CTGF)､p27kip的mRNA水平､CTGF､p27kip的蛋白水平､细胞增殖活力､细胞周期分布及细胞总蛋白含量｡另外检测各组培养30 min､1 h､24 h､48 h时的磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(p-ERK1/2)水平｡每个检测指标设3个重复样本｡ 【结果】 高糖刺激可引起HK-2细胞的CTGF､p27kip的mRNA及蛋白表达水平显著升高,ERK1/2磷酸化激活,阻滞于G1期的细胞显著增多,细胞增殖活力受抑制,细胞肥大主要指标胞内蛋白总含量进行性增高｡ 【结论】 证实了高糖可通过上调CTGF激活ERK1/2信号转导,从转录水平上调p27kip,从而使增殖细胞阻滞于G1期诱导细胞肥大｡     

转化生长因子β1诱导人肾小管上皮细胞表达结缔组织生长因子

目的　研究转化生长因子 β1(transforminggrowthfactorβ1,TGFβ1)对人肾小管上皮细胞 (humanproximaltubularep ithelialcells ,HTECs)表达结缔组织生长因子 (connectivetissuegrowthfactor ,CTGF)的影响。方法　体外培养的HTEC被根据随机数字表分为 3组 :对照组 (C组 ) :无血清培养基 (freeserummedium ,FSM)培养 ;TGFβ1a和TGFβ1b组 (Ta 组和Tb 组 ) :分别用含不同浓度TGFβ1(Ta 组 :2 0ng/ml,Tb 组 :40ng/ml)的FSM培养 ,96h后 ,分别用RT PCR和免疫组化方法检测HTEC表达CT GFmRNA和蛋白。结果　①C组 :CTGFmRNA和蛋白表达为阴性 ;②Tb 组和Ta 组 :CTGFmRNA和蛋白表达皆呈阳性。Tb 组和Ta 组相比 ,CTGF的mRNA和蛋白表达量皆显著增加 (P <0 .0 1)。结论　TGFβ1能呈剂量依赖性地诱导HTEC合成CTGF。     

肝细胞生长因子对高糖及结缔组织生长因子培养的肾小管上皮细胞纤维化的影响

目的：探讨肝细胞生长因子（HGF）对高糖及结缔组织生长因子（CTGF）诱导肾小管上皮细胞（HKC）纤维化的影响.方法：体外培养HKC,分别在高糖及CTGF环境下加入不同浓度人重组肝细胞生长因子（rhHGF）,以RT-PCR检测转化生长因子β1（TGF-β1）、CTGF、以及纤维化指标Ⅳ型胶原（COL4A1）、纤连蛋白（FN）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）等的基因表达.结果：高糖及CTGF刺激下,细胞因子和纤维化指标表达均不同程度增加,其中,CTGF作用下,COL4A1表达明显低于高糖组（P＜0.01）.高糖及CTGF环境下加入rhHGF后,纤维化指标显著降低（P＜0.01）,其中高糖＋rhHGF组,CTGF表达减少,TGF-β1表达无明显改变（P＞0.05）.结论：HGF可通过抑制TGF-β下游因子CTGF的表达,发挥抗肾小管上皮细胞纤维化作用,但CTGF并不是其惟一的阻断途径.     

结缔组织生长因子对人肾小管上皮细胞株生物学特性的影响

目的:观察重组人结缔组织生长因子(rhCTGF)对人肾小管上皮细胞株(HK-2)的作用.方法:将体外培养的人肾小管上皮细胞分为三组:对照组、rhCTGF 5.0 ng/ml, rhCTGF 10.0 ng/ml.应用MTT法检测CTGF对HK-2增殖的影响;倒置显微镜观察细胞形态学的变化;间接酶标免疫组织化学方法检测E-钙粘蛋白(E-Cadherin),α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达;流式细胞术检测α-SMA阳性的HK-2细胞百分数.结果:在一定的浓度范围内,CTGF能促进HK-2细胞的增殖, CTGF促使HK-2细胞由椭圆形转变为梭形状,可下调E-Cadherin,上调α-SMA, 流式细胞测得三组细胞阳性百分率依次为1.54%,10.24%,25.8%(P＜0.05).结论:CTGF在体外促进HK-2转分化的同时促进HK-2的生长.     

高糖诱导大鼠近端肾小管上皮细胞肥大

目的 观察高糖培养对大鼠近端肾小管上皮细胞肥大的影响.方法 SD大鼠,麻醉下,无菌分离单根近球小管并培养,以免疫细胞化学方法鉴定体外培养的肾小管上皮细胞.不同浓度糖(10 mM,20 mM,30mM)培养肾小管上皮细胞,72小时后检测细胞体积、3H-亮氨酸掺入量以及蛋白质含量,以观察细胞肥大情况.结果 高糖(20 mM,30mM)培养72小时,导致肾小管上皮细胞体积明显增大,3H-亮氨酸掺入量及细胞内蛋白质含量明显增加.结论 高糖培养可诱导肾小管上皮细胞肥大.     

针对CTGF的siRNA对高糖诱导小鼠足细胞nephrin、podocin减少的影响

目的 探讨结缔组织生长因子(CTGF)在高糖诱导小鼠足细胞nephrin、podocin表达减少中的作用,及针对CTGF基因的siRNA对其影响.方法 将体外培养的小鼠足细胞分为6组:(1)正常对照组,1640培养基含D-葡萄糖1 g/L;(2)等渗对照组,1640培养基合D-葡萄糖lg/L,甘露醇3.5 g,L;(3)高糖组,1640培养基含D.葡萄糖4.5 g,L;(4)高糖+空白对照组:细胞转染空白质粒后于舍D-葡萄糖4.5 g/L中的1640培养基中培养;(5)高糖+阴性对照组:细胞转染含无关序列的重组质粒后于含D-葡萄糖4.5 g/L中的1640培养基中培养;(6)高糖+干扰组:细胞转染针对CTGF的siRNA表达质粒后于含D-葡萄糖4.5g/L中的1640培养基中培养.应用Reahime PCR检测nephrin、podocin、CTGFmRNA水平,Western blot检测CTGF,nephrin、podocin蛋白表达水平.结果 高糖可诱导CTGF mRNA及蛋白表达增加,下调足细胞的nephrin、podocin mRNA及蛋白水平,而通过特异性siRNA抑制CTGFmRNA表达后,CTGF表达减少,同时伴有细胞nephrin、podocin表达升高.结论 CTGF是高糖诱导小鼠足细胞损伤的重要介质,高糖可通过CTGF诱导nephrin,podocin表达减少.针对CTGF的siRNA能明显改善这种损伤,为DN发病机制的研究提供新的实验依据.     

高糖通过结缔组织生长因子诱导足细胞减少podocalyxin的表达

摘要：目的探讨高糖对小鼠足细胞podocalyxin表达的影响及结缔组织生长因子（CTGF）参与其损伤的可能机制。方法
构建针对CTGF基因的特异性siRNA质粒并转染至小鼠足细胞。将体外培养的足细胞分为6组( 1)正常对照组,正常足细
胞其培养基含D-葡萄糖1 g/L;(2)等渗对照组,正常足细胞其培养基含D-葡萄糖1 g /L,甘露醇3.5 g/L;(3)高糖组,正常足
细胞其培养基含D-葡萄糖4.5 g/L;(4)高糖+空白对照组：足细胞转染空白质粒后于高糖培养基中培养;(5)高糖+阴性对照
组：足细胞转染含无关序列的重组质粒后于高糖培养基中培养;(6)高糖+干扰组：足细胞转染针对CTGF的siRNA表达质
粒后于高糖培养基中培养。Western blot 方法检测小鼠足细胞Podocalyxin、CTGF 蛋白表达及细胞外信号调节激酶
（ERK1/2）磷酸化水平。结果高糖培养足细胞24、48 h时均可下调其Podocalyxin蛋白表达量（P<0.05）,并可诱导CTGF
蛋白表达增加（P<0.05）。同时高糖可以活化足细胞ERK1/2信号途径,在高糖刺激30 min时开始活化,持续活化至24 h。
特异性siRNA干扰CTGF合成后,ERK1/2活化减少,并且足细胞Podocalyxin表达升高。结论CTGF是高糖诱导小鼠足
细胞损伤的重要介质,可通过ERK1/2途径诱导podocalyxin表达下降,针对CTGF的siRNA能明显改善podocalyxin表达
量,为DN的治疗提供新的思路。     

结缔组织生长因子反义寡核苷酸抑制TGFβ1诱导人肾小管上皮细胞转分化

目的探讨转化生长因子β-1(TGFβ1)诱导人肾小管上皮-肌成纤维细胞转分化(TEMT)过程中结缔组织生长因子(CTGF)的表达和作用.方法在用MTT比色、荧光分析证明阳离子脂质体(DOTAP)介导CTGF反义寡核苷酸(AS)转染HKC可行的基础上,将培养的HKC分为4组正常对照组(C组);TGFβ1组(T组);TGFβ1加AS组(T+AS组);4、TGFβ1加CTGF错义寡核苷酸组(T+SC组).分组处理96h后,分别采用免疫组化、Western blot和RT-PCR技术检测各组CTGF、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,并分析CTGF和α-SMA表达量的相关性.结果C组CTGF和α-SMA表达阴性;T组CTGF和α-SMA表达阳性;T+AS组CTGF和α-SMA表达阳性,但皆显著低于T组(P＜0.01)T+SC组CTGF和α-SMA表达皆和T组无显著差异(P＞0.05).相关分析CTGF和α-SMA在表达量上皆呈较强的线性相关性.结论CTGF的AS能有效地抑制TGFβ1所诱导的TEMT,提示CTGF是TGF β1诱导TEMT所必需的成份.     

Inhibition effect of small interfering RNA of connective tissue growth factor on the expression of vascular endothelial growth factor and connective tissue growth factor in cultured human peritoneal mesothelial cells

Background The peritoneum response to peritoneal dialysis can lead to fibrosis. The transforming growth factor β1 （TGF-β1 ） plays a key role in regulating tissue repair and remodelling after injury. Connective tissue growth factor （CTGF）, a downstream mediator of TGF-β1 inducing fibrosis, has been implicated in peritoneal fibrosis. Vascular endothelial growth factor （VEGF） plays a key role in angiogenesis that can hasten peritoneal fibrosis. In this study, we investigated the effect of small interfering RNA （siRNA） of CTGF by pRETRO-SUPER （PRS） retrovirus vector on the expression of CTGF and VEGF in human peritoneal mesothelial cells. Methods Retrovirus producing CTGF siRNA were constructed from the inverted oligonucleotides and transferred into packaging cell line PT67 with lipofectamine, and the virus supernatant was used to infect human peritoneal mesothelial cell （HPMC）. The cells were divided into seven groups： low glucose DMEM, low glucose DMEM ＋ TGF-β1 5 ng/ml, low glucose DMEM ＋ TGF-β1 5 ng/ml ＋ PRS-CTGF-siRNA1-4 and low glucose DMEM ＋ TGF-β1 5 ng/ml ＋ PRS. The expression of CTGF and VEGF were measured by semiquantitative RT-PCR and Western blot. Results Low levels of CTGF and VEGF were detected in confluent HPMCs. Following stimulation with TGF-β1 , the levels of CTGF and VEGF were significantly upregulated （P〈0.01）. Introduction of PRS-CTGF-siRNA1-4 resulted in the significant reduction of CTGF mRNA and protein, and VEGF mRNA （P〈0.01）, especially in groups PRS-CTGF-siRNA, and PRS-CTGF-siRNA4. The introduction of PRS void vector did not have these effects （P〉0.05）. Conclusions The expression of CTGF siRNA mediated by PRS retrovirus vector can effectively reduce the level of CTGF and VEGF induced by TGF-β1 in cultured HPMCs. This study may provide potential therapeutic strategies to prevent the peritoneal fibrosis.     

The Effect of Connective Tissue Growth Factor on Human Renal Tubular Epithelial Cell Transdifferentiation

Summary To investigate the role of connective tissue growth factor (CTGF) in transdifferentiation of human renal tubular epithelial cell (HKC),in vitro cultured HKC cells were divided into 3 groups: negtive control, low dose CTGF-treated group (rh CTGF, 2.5 ng/ml) and high dose CTGF-treated (rhCTGF, 5. 0 ng/ml). Then the expression of α-smooth muscle actin (α-SMA) were assessed by indirect immuno-fluorescence, and the percentage of α-SMA positive cells were assessed by flow cytometry. RT-PCR were also performed to examine the mRNA level of α-SMA. Upon the stimulation of different concentrations of rhCTGF, the expression of α-SMA were markedly stronger than that in negative controls. The percentages of α-SMA positive cells were significantly higher in the stimulated groups than that of negative controls (38.9%, 65.5% vs 2.4%,P<0.01). α-SMA mRNA levels were also up-regulated by the stimulation of rhCTGF (P<0.01). These results suggest that CTGF can promote the transdifferentiation of human renal tubular epithelial cells towards myofibroblast (Myo-F). ZHANG Chun, male, born in 1977, M. D., Ph. D. This work was supported by a grant from the Science & Technology Foundation of Hubei Province (No. 2003AA301C14).     

针对CTGF的shRNA抑制TGFβ1诱导人肾小管上皮细胞合成胶原

目的研究针对结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)对转化生长因子β1(TGFβ1)诱导人肾小管上皮细胞株(human renal tubular epithelial cell,HKC)合成胶原的抑制作用.方法设计和构建带有U6启动子的能产生针对CTGF的shRNA的RNA干扰表达质粒,转染至受TGF β1刺激的HKC,以RT-pCR和Western blot检测HKC转染前后CTGF表达,以3H脯氨酸掺入法检测总胶原合成量.结果和仅受TGFβ1刺激组相比,转染了RNA干扰表达质粒的受TGFβ1刺激的HKC CTGFmRNA和蛋白表达明显减弱,总胶原合成量下降(P＜0.01).结论针对CTGF的短发夹RNA能明显抑制TGF β1诱导HKC合成胶原.     

Role of Connective Tissue Growth Factor in Extracellular Matrix Degradation in Renal Tubular Epithelial Cells

In order to investigate the effects of connective tissue growth factor (CTGF) antisense oligodeoxynucleotide (ODN) on plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) expression in renal tubular cells induced by transforming growth factor β1 (TGF-β1) and to explore the role of CTGF in the degradation of renal extracellular matrix (ECM), a human proximal tubular epithelial cell line (HKC) was cultured in vitro. Cationic lipid-mediated CTGF antisense ODN was transfected into HKC. After HKC were stimulated with TGF-β1 (5 μg/L), the mRNA level of PAI-1 was detected by RT-PCR. In-tracellular PAI-1 protein synthesis was assessed by flow cytometry. The secreted PAI-1 in the media was determined by Western blot. The results showed that TGF-β1 could induce tubular CTGF and PAI-1 mRNA expression. The PAI-1 mRNA expression induced by TGF-β1 was significantly inhib-ited by CTGF antisense ODN. CTGF antisense ODN also inhibited intracellular PAI-1 protein syn-thesis and lowered the levels of PAI-1 protein secreted into the media. It was concluded that CTGF might play a crucial role in the degradation of excessive ECM during tubulointerstitial fibrosis, and blocking the biological effect of CTGF may be a novel way in preventing renal fibrosis.     

外源性结缔组织生长因子对人肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质合成的作用

目的:探讨外源性结缔组织生长因子(CTGF)在人肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质合成中的作用.方法:将体外培养的人肾小管上皮细胞HK2分为三组:对照组;CT-GF小剂量组(终浓度为2.5 μg/L);CTGF大剂量组(终浓度为20 μg/L).用倒置显微镜观察细胞形态学变化;噻唑蓝(MTr)法检测细胞增殖活性;RT-PCR检测HK2细胞E-钙黏蛋白(E-cadherin),α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),纤连蛋白(FN)和胶原ⅠαmRNA水平的变化;免疫组织化学方法观察HK2细胞FN和胶原Ⅰ的表达.结果:CTGF刺激使HK2细胞由椭圆形变为梭形,同时促进HK2细胞增殖.不同浓度的CTGF作用于HK2细胞48 h后,α-SMA和FN mRNA水平显著升高(P＜0.05),E-钙黏蛋白mRNA的表达显著下降(P＜0.05);大剂量CTGF刺激HK2细胞48 h后胶原ⅠαmRNA水平显著升高(P＜0.05).小剂量CTGF组HK2细胞胞质FN表达水平显著增加(P＜0.05),大剂量CTGF组HK2细胞胞质表达FN和胶原Ⅰ均显著增加(P＜0.05).结论:CTGF在体外能够诱导人肾小管上皮细胞转分化,并促进FN的合成,大剂量的CTGF可以增加其胶原Ⅰ的合成.     

siRNA沉默结缔组织生长因子对鼠肝星状细胞生物学

目的研究化学合成的小干扰RNA(483 siRNA)对大鼠原代肝星状细胞(HSCs)结缔组织生长因子(CTGF)蛋白表达及细胞生物学特性的影响。方法以胶原酶原位灌注消化、密度梯度离心分离大鼠原代HSCs,以脂质体Oligofectamine包裹483siRNA转染培养72 h的原代HSCs作为转染组,并设空白对照组。收集孵育96 h的HSCs及培养上清液,采用Western blotting、免疫细胞化学染色、MTT和RT-PCR法分别检测细胞CTGF蛋白表达、α-SMA表达、细胞增殖和Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达;放射免疫法检测培养上清液中透明质酸及Ⅲ型前胶原含量。结果与对照组比较,转染组HSCs的CTGF蛋白表达下调(92±5)%,α-SMA染色阳性细胞减少(58±6)%,细胞增殖活性下调(18±5)%,Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达分别下调(53±6)%和(41±7)%;培养上清中透明质酸和Ⅲ型前胶原含量分别降低(48±5)%和(33±8)%。结论483 siRNA能显著下调原代HSCsCTGF蛋白表达,并由此抑制细胞活化、增殖及细胞外基质的合成和分泌。提示针对CTGF靶位的siRNA可能具有防治肝纤维化的潜力。     

结缔组织生长因子特异性小分子干扰RNA的筛选及其在抗肝纤维化中的作用

目的:设计和合成针对抗肝纤维化关键基因结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)的特异性小干扰RNA( siRNA),并筛选高效的CTGFsiRNA抗肝纤维化序列,探讨其通过尾静脉注射是否具有抗大鼠肝纤维化作用.方法:①筛选高效的CTGF siRNA序列.②干预肝纤维化模型大鼠.选取雄性SD大鼠30只,随机分成5组,分别为空白对照组尾静脉注射生理盐水8周;模型组腹腔注射40％ CCl4(3 ml/kg)及尾静脉注射生理盐水,1次/3d,连续8周;预防组腹腔注射40％ CCl4及尾静脉注射CTGF siRNA(0.1 mg/kg),1次/3d,连续8周;2周治疗组腹腔注射40％ CCl4 2周,后给予CTGF siRNA及CCl4 6周;4周治疗组腹腔注射40％ CCl4 4周,后给予CTGFsiRNA及CCl4 4周.于最后一次CC14注射3天后取血及组织标本,检测肝纤维化指标,应用Real-Time PCR及Western印迹法检测CTGF mRNA及蛋白质在大鼠肝组织表达,应用Masson染色检测肝组织纤维化.结果:与模型组(0.544±0.019)相比,预防组(0.105±0.003)及治疗组(0.190±0.006)大鼠肝组织CTGF mRNA和蛋白质表达显著下调(P＜0.05),肝组织炎症和坏死及纤维化明显减轻,肝纤维化指标显著降低(P＜0.05).4周治疗组与模型组相比各指标降低,与预防组及2周治疗组相比各指标相对升高(P＜0.05).结论:成功筛选出高效的CTGF siRNA,且经尾静脉注射CTGF siRNA能显著抑制大鼠体内肝脏CTGF基因表达,并能有效防治大鼠肝纤维化,对于病程较长的肝纤维化也有一定的治疗作用,提示CTGF siRNA在抗肝纤维化治疗中有重要作用.