EBV全基因组基因芯片构建与初步验证

目的:鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)高发于中国南方,是一种恶性度较高的肿瘤,与EB病毒关系非常密切。本研究利用前期已经设计和克隆好的EB病毒(EBV)已知和预计的编码基因作为cDNA探针,用于研制EBV微阵列。利用能高产EBV病毒颗粒的B95-8细胞作为检测对象,观测基因芯片检测的效果,已确定是否将来用于临床检测。方法:87个EBV基因探针通过一对设计于载体多克隆两端的引物进行PCR扩增。产物纯化后,探针被打印在Corning玻片上。通过与Cy3标记的B95-8细胞cDNA进行杂交反应,检测B95-8细胞内EBV基因表达。RT-PCR验证检测。结果:利用构建的EBV芯片,成功地在B95-8细胞中检测到了几乎所有的EBV潜伏基因的表达,随后RT-PCR验证了该结果。结论:我们成功地构建了EBV微阵列,且设计的EBV探针检测是有效的。但EBV微阵列是否可以用于鼻咽癌标本的检测还有待进一步证实。     

EBV病毒全基因组cDNA探针的设计与制备

目的设计和克隆所有EB病毒(EBV)已知和预计的编码基因作为cDNA探针用于构建EBV微阵列,以促进研究EBV在其相关疾病中的发病学作用.方法cDNA探针首先由Oligo6.0,Blast和Primer Primier软件设计和筛选全 EBV基因组探针,它们的长度被定在300～600 mer并且具有高度特异性.从B95-8细胞和NPC组织的基因组DNA和 RNA中,通过PCR和RT-PCR方法扩增这些探针,之后克隆入T/A克隆载体.所有的探针被测序鉴定.结果除LF1和LF3基因在B95-8细胞的EBV基因组中不存在外,其余85个基因片段(BWRFl基因有7个重复阅读框架)和两个EBERs基因被成功克隆.结论EBV cDNA探针的设计和克隆为制备EBV微阵列和进一步研究EBV基因组在其相关疾病中的作用奠定了基础.     

EBV病毒全基因组cDNA探针的设计与制备

目的 设计和克隆所有EB病毒(EBV)已知和预计的编码基因作为cDNA探针用于构建EBV微阵列,以促进研究EBV在其相关疾病中的发病学作用。方法 cDNA探针首先由Oligo6.0,Blast和Primer Primier软件设计和筛选全EBV基因组探针,它们的长度被定在300~600 mer并且具有高度特异性。从B95-8细胞和NPC组织的基因组DNA和RNA中,通过PCR和RT-PCR方法扩增这些探针,之后克隆入T/A克隆载体。所有的探针被测序鉴定。结果 除LF1和LF3基因在B95-8细胞的EBV基因组中不存在外,其余85个基因片段(BWRF1基因有7个重复阅读框架)和两个EBERs基因被成功克隆。结论 EBVcDNA探针的设计和克隆为制备EBV微阵列和进一步研究EBV基因组在其相关疾病中的作用奠定了基础。     

血管形成抑制剂Canstatin在鼻咽癌中表达鉴定及基因克隆

目的 检测Canstatin基因在鼻咽癌发病过程中的表达变化及克隆其编码序列.方法 利用半定量RT-PCR方法检测Canstatin在鼻咽癌组织、鼻咽癌细胞和正常鼻咽组织中的表达,比较它们之间的表达差异.设计含酶切位点的PCR引物,利用RT-PCR方法从相对正常鼻咽组织中获取Can-statin蛋白编码序列,T/A克隆入Pmd18载体中.利用PCR和酶切鉴定获得阳性重组子.重组子最后经测序证实.结果 与相对正常鼻咽组织相比,Canstatin在鼻咽癌组织和细胞中表达下调或缺失.RT-PCR法成功获得Canstatin基因编码区全长Cdna序列.重组克隆质粒插入片段经DNA测序后与Gen-Bank中Canstatin基因相应序列比较,100%同源.结论 Canstatin在鼻咽癌组织和细胞中表达下调或缺失.采用T/A技术成功克隆鼻咽组织中Canstatin基因,为Canstatin亚克隆入真核表达载体Pegfp-N1,探索其在鼻咽癌生长和转移中的作用奠定了基础.     

EB病毒编码基因BARF1对鼻咽癌细胞增殖和迁移影响

目的 探讨EB病毒(EBV)编码基因BARF1对鼻咽癌细胞增殖和迁移的影响。方法 构建BARF1基因慢病毒表达载体,转染EBV阴性鼻咽癌细胞系CNE,杀稻瘟菌素筛选稳定感染细胞克隆,RT-PCR鉴定目的基因表达。以不含目的基因的慢病毒感染细胞为对照,进行MTT细胞增殖实验、细胞周期检测和细胞迁移实验。结果 与对照组比较,转染BARF1基因的细胞增殖能力和增殖指数无明显变化(P>0.05),但是迁移能力显著增强(t=9.71,P<0.05)。结论 EBV BARF1基因可通过增强鼻咽癌细胞迁移能力而增强其肿瘤原性。     

Cycl慢病毒干扰载体的构建及在鼻咽癌细胞中干扰效率检测

目的 检测Cycl在鼻咽癌中的表达.构建稳定干扰Cycl慢病毒载体及检测其在鼻咽癌细胞中的干扰效率.方法 应用基因芯片技术检测Cycl基因在鼻咽癌组织中的表达.Real-time PCR确证Cycl基因在鼻咽癌组织和细胞中高表达.构建重组靶向Cycl的shRNA慢病毒质粒pLentiU6/Cycl-shRNA.建立稳定干扰Cycl基因的鼻咽癌细胞系,荧光定量PCR检测干扰效率.结果 基因芯片检测显示,Cycl基因在鼻咽癌组织中高表达.qRT-PCR确证了墓因芯片结果的可靠性.在8个鼻咽癌细胞株中,Cyc1基因基本上都显示了高表达,其中最高的为鼻咽癌5-8F细胞.测序验证pLentiU6/Cycl-shRNA重组质粒构建成功.重组质粒能明显稳定地抑制Cycl基因在鼻咽癌细胞中的表达.结论 Cycl 基因在鼻咽癌中高表达.构建的靶向Cycl基因的慢病毒载体能明显抑制其表达.这为研究Cycl基因在鼻咽癌中的功能及分子机制奠定了基础.     

EB病毒潜伏膜蛋白2A胞外区重组基因在大肠杆菌中的表达及其在血清学检测中的应用

目的:构建EB病毒潜伏膜蛋白2A(LMP2A)胞外区重组基因的表达载体在大肠杆菌中表达,并将表达的蛋白用于EB病毒相关鼻咽癌(NPC)患者的血清学检测.方法:用BamHⅠ和EcoRⅠ将含LMP2A胞外区重组基因的质粒pEC2A双酶切后,克隆到pET32a中.重组质粒经PCR、酶切鉴定、核酸序列分析后转化大肠杆菌(E.coli)BL21,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,表达的蛋白经镍柱亲和层析纯化,并用Western blot法检测其抗原活性.用纯化的蛋白进行鼻咽癌患者血清学检测.结果:重组表达质粒经PCR及酶切鉴定为阳性,核酸序列分析正确.SDS-PAGE和Western blot结果显示表达的重组蛋白分子质量约为40 ku.以此为抗原能在鼻咽癌患者血清中检测到特异性的抗体.结论:成功获得了LMP2A胞外区重组基因表达的蛋白,纯化的蛋白可用于EBV相关鼻咽癌患者的血清学检测.     

纯化鼻咽组织全基因组表达谱在筛选鼻咽癌相关靶基因中的应用

目的:通过全基因组寡核苷酸基因芯片构建鼻咽部纯化组织基因表达谱,筛选鼻咽癌相关靶基因。方法:采用RNA保护技术保护组织标本,显微切割纯化分离鼻咽癌组织标本中的癌细胞、鼻咽部非癌组织标本中的黏膜上皮细胞,提取每一例纯化组织标本RNA,线性扩增获得足量aRNA,标记探针后与HG-U133. Plus 2. 0杂交,构建每一例鼻咽部纯化组织标本基因表达谱,通过组间信息比对筛选鼻咽癌相关靶基因。结果:鼻咽癌组与非鼻咽癌组基因表达谱比对,筛选出了与鼻咽癌发病相关的候选靶基因。通过鼻咽癌标本中颈部转移组和非颈部转移组表达谱比对,找出了与鼻咽癌颈部淋巴结转移相关的候选靶基因。结论:利用全基因组基因芯片构建基因表达谱,可准确、高效地筛选出鼻咽癌相关的候选靶基因。     

人鼻咽癌组织中转录因子相关基因的差异表达分析

目的 用cDNA微阵列膜比较鼻咽癌组织及正常组织的基因表达谱,研究鼻咽癌组织中转录因子相关基因的差异表达,为进一步探讨差异表达基因的调控机制奠定基础.方法 24例鼻咽癌组织总RNA和正常对照总RNA(24例正常鼻咽组织RNA等质量混合)分别经逆转录探针标记与微阵列膜杂交.然后用Pathway4.0软件分析杂交结果,并用RT-PCR反应验证微阵列杂交结果.结果 在1625个鼻咽癌差异表达基因中,共有转录因子相关基因35个,12个基因表达上调,23个基因表达下调.结论 在鼻咽癌组织中,多个转录因子相关基因的表达水平发生了变化,这些转录因子在鼻咽癌组织的基因表达调控中发挥重要作用.     

人鼻咽癌不同部位组织相关基因表达谱的研究

目的：筛选鼻咽癌癌变发生过程中的重要基因。方法：应用显微切割和荧光标记探针基因芯片杂交技术，检测鼻咽癌、癌周组织、癌旁组织及鼻咽炎症组织的基因差异表达，扫描仪扫描荧光芯片，图象处理软件分析结果。结果：在检测的3组标本中，存在大量差异表达基因，涉及基因包括信号与蛋白传递、癌基因与原癌基因、免疫相关基因、凋亡基因，以及DNA结合转录和转录因子等范围。结论：鼻咽癌癌变过程中有多个多种类基因参与，说明鼻咽癌癌变过程是一个复杂、多通路的过程。