fat-1转基因小鼠的构建与鉴定

目的构建和鉴定携带有外源fat-1基因的转基因小鼠。方法将fat-1基因的cDNA与动物表达载体pEF—neo连接,构建pEF-fat-1重组质粒,酶切、测序鉴定正确后,以显微注射法把线性化重组质粒注射到小鼠受精卵的雄原核中,并将受精卵移植到受体鼠的输卵管中产出转基因小鼠,通过PCR、Southern blot杂交等方法确立阳性整合有目的基因的G0代小鼠。结果成功构建了pEF-fat-1重组质粒,将其显微注射到小鼠受精卵中,得到G0代小鼠,PCR、Southern blot杂交确立了4只整合有fat-1基因的首建鼠。结论fat-1基因可整合到小鼠体内,得到的转基因小鼠为研究fat-1基因的生物学功能提供了动物模型。     

GLUT4-Cre转基因模型建立与Cre酶特异性表达

目的：建立骨骼肌和脂肪组织特异性表达Cre重组酶基因的转基因小鼠，以期在上述组织细胞中实现相关基因的条件性剔除。方法：选择人葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)基因的启动子驱动Cre重组酶的特异性表达，利用基因重组技术，构建GLUT4-Cre转基因表达质粒。通过显微注射法将该质粒导入小鼠受精卵细胞核，获得的新生鼠经PCR和Southern杂交方法进行基因型的分析鉴定，常规方法培育、传代转基因鼠。用RT-PCR和免疫组化法对Cre酶在阳性转基因鼠体内mRNA和蛋白表达水平进行检测。结果：获得5只阳性转基因首建鼠，其中3只已建系并稳定传代。在脑、脂肪组织中检测到Cre基因表达，而心肌、骨骼肌及肝脏组织中未检出转基因表达。结论：成功构建了在脑、脂肪组织中特异性表达Cre的转基因鼠，为研究与2型糖尿病、胰岛素抵抗等相关的条件性基因剔除小鼠模型的建立奠定了基础。     

可诱导心肌特异性表达TRX蛋白转基因小鼠模型的建立

目的建立心肌特异性、高效表达鼠源硫氧还蛋白-1（Thioredoxin1,Trx-1）的转基因小鼠模型。方法将TRE-Tight-1h-1与能够控制TRE-Tight下游基因在心肌特异性表达的a-MHC-rtTA-hGH转基因载体分别显微注射入C57BL／6小鼠受精卵细胞中得到的分别含有-段转基因载体的转基因小鼠,再将这两种转基因小鼠进行交配,获得同时含有TRE-Tight．Trx-1和α-MHC-rtTA-hGH这两段基因的双阳性子代转基因小鼠。使用强力霉素（Dox）持续诱导6周龄双阳性小鼠6周,再用Westernblot方法检测转基因小鼠心肌细胞中Trx-1表达量。结果与野生型c57BL/6小鼠比较,经过强力霉素诱导的双阳转基因小鼠心肌细胞中Trx-l有高表达量（P〈O．05）。结论我们得到了可诱导、高效表达rIh-1的转基因小鼠系,为心肌肥大疾病的研究和治疗提供新的研究思路。     

GLUT4-Cre转基因模型建立与Cre酶特异性表达

目的建立骨骼肌和脂肪组织特异性表达Cre重组酶基因的转基因小鼠,以期在上述组织细胞中实现相关基因的条件性剔除.方法选择人葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)基因的启动子驱动Cre重组酶的特异性表达,利用基因重组技术,构建GLUT4-Cre转基因表达质粒.通过显微注射法将该质粒导入小鼠受精卵细胞核,获得的新生鼠经PCR和Southern杂交方法进行基因型的分析鉴定,常规方法培育、传代转基因鼠.用RT-PCR和免疫组化法对Cre酶在阳性转基因鼠体内mRNA和蛋白表达水平进行检测.结果获得5只阳性转基因首建鼠,其中3只已建系并稳定传代.在脑、脂肪组织中检测到Cre基因表达,而心肌、骨骼肌及肝脏组织中未检出转基因表达.结论成功构建了在脑、脂肪组织中特异性表达Cre的转基因鼠,为研究与2型糖尿病、胰岛素抵抗等相关的条件性基因剔除小鼠模型的建立奠定了基础.     

潮霉素抗性转基因BDF1小鼠模型的建立

目的建立具有潮霉素（hygromycin）抗性转基因BDF1小鼠，用于制备携有hygromycin抗性筛选标志ES阳性细胞克隆的饲养层。方法通过显微注射的方法，将含有潮霉素B磷酸转移酶基因片段（5.1kb）导入BDF1受精卵雄原核中，共注射169枚受精卵，然后将129枚受精卵细胞植入同期受孕的受体母鼠输卵管内。结果共产生37只转基因小鼠，经PCR和Southern检测获得9只阳性小鼠，对一只子代鼠进行RT-PCR检测证明hyg基因已经在肾、肌肉、脾内表达。结论成功的建立具有潮霉素抗性的BDF1转基因鼠，该模型动物可以为基因敲除研究提供良好的基础条件。     

采用CRISPR/Cas9技术构建新品系HBeAg转基因小鼠

目的培育一种HBeAg转基因小鼠新品系。方法克隆乙型肝炎病毒HBeAg基因;采用CRISPR/Cas9技术,通过同源重 组的方式分别在Rosa26基因位点定点插入pliver-HBeAg表达框,获得含有HBeAg基因的表达载体pliver-HBeAg,经酶切得到 含有HBeAg基因的线性DNA 片段,将Cas9 mRNA、gRNA和donor vector显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,再将其移植 入C57BL/6J雌性代孕小鼠子宫,获得F0代建系小鼠;采用长片段PCR对出生小鼠进行鉴定,共获得HBeAg基因正确同源重组 的F0代建系小鼠;F0代阳性小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配,繁育获得F1代小鼠,经PCR鉴定及测序确认阳性F1代小鼠;将 携带HBeAg基因的F1代转基因小鼠再次回交,对子代小鼠进行PCR基因型鉴定,直至获得纯合子子代转基因小鼠;采用全自 动化学发光免疫分析仪、胶体金法和免疫组织化学方法分别检测HBeAg转基因鼠血浆和肝组织中HBeAg和HBeAb的表达。 结果采用CRISPR/Cas9技术共获得56只F0代小鼠,其中2只为正确同源重组的F0代小鼠;F1代小鼠中6只阳性F1代小鼠。 截至目前,共获得22只F2代纯合子和29只杂合子HBeAg转基因小鼠。所有HBeAg转基因小鼠外周血中均可检出高浓度的 HBeAg蛋白,但未检出HBeAb的表达。而且免疫组化结果显示HBeAg转基因小鼠肝脏肝细胞中可特异性表达HBeAg蛋白。 结论采用CRISPR/Cas9技术成功构建了能在肝脏肝细胞中稳定表达HBeAg蛋白且对HBeAg免疫耐受的新品系HBeAg转基 因小鼠,为HBV的研究提供了新的实验动物模型。     

CRISPR/Cas9介导的小鼠BRCA1/BRCA2/CDH1基因乳腺特异性修饰研究

目的应用CRISPR/Cas9系统构建BRCA1、BRCA2和CDH1三基因乳腺特异性修饰小鼠模型。方法针对小鼠BRCA1、BRCA2和CDH1基因分别设计并合成sgRNA,构建p X330-sp Cas9-U6-gRNA共表达载体,将共表达载体中CBh启动子替换为乳腺组织特异性启动子WAP。利用小鼠受精卵原核注射的方法制备转基因小鼠。结果共注射受精卵190枚,得到活性受精卵130枚,移植4只受体鼠。产下F0代仔鼠42只,鉴定出11只转基因阳性小鼠,阳性率为26.19%。F0代阳性鼠繁育后得到39只F1代仔鼠,其中9只为F1代转基因阳性鼠。结论通过构建乳腺组织特异表达Cas9载体成功制备了转基因阳性鼠。     

角质细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的研制

本研究采用转基因技术中最常用的受精卵原核显微注射法，制备角质细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠。我们将经过超排处理的供体雌鼠拉颈处死，从其输卵管壶腹部取出卵丘细胞团，用透明质酸酶消化、清洗，得到形态饱满、极体和双原核明显的受精卵培养。将构建好的包括角质细胞特异性角质素5（K5）启动子、Cre重组酶基因和人生长激素（hGH）polyA的转基因载体pK5-Cre-hGH制备成一定浓度的注射片段，通过显微注射的方法将4．2kb的转基因片段引入小鼠受精卵的雄原核。共注射了720枚受精卵，移植至29只假孕母鼠的输卵管中发育，获得子代小鼠48只，经PCR鉴定有12只小鼠在基因组上整合有Cre基因，整合率为25％。此结果通过Southern杂交得到进一步证实。     

乙型肝炎病毒x基因转基因小鼠模型的建立及培育

目的：建立可表达乙型肝炎病毒X蛋白的HBx基因（adr亚型）转基因小鼠模型，以研究x基因的功能。方法：采用基因重组技术构建含有CMV启动子和HBx基因（adr亚型）开放阅读框（ORF）的真核表达载体pcDNA3-HBx。该载体经Sal I限制性内切酶线性化后，琼脂糖电泳回收目的的片段，用原核显微注射法将其注射入雄原核，制备转基因小鼠。复合PCR法在基因组水平筛选HBx基因转基因小鼠founder；免疫组织化学法在蛋白水平检测X蛋白在这些小鼠中的表达情况。结果：成功构建了HBx基因真核表达载体pcDNA3-HBx。经原核显微注射法将目的片段注射入受精卵雄原核后，出生并存活了11只新生鼠，经PCR检测后获得5只founder转基因小鼠，命名为C57－TgN(HBx)SMMU。免疫组织化学检测发现5只PCR阳性小鼠的肝细胞质中均有X蛋白的表达。将这5只转基因小鼠与正常同系异性小鼠交配，进行传代培育，复合PCR法筛选阳性转基因小鼠，目前已传至F4代。结论：本研究成功地产生了稳定遗传HBx基因并表达X蛋白的转基因小鼠C57－TgN（HBx)SMMU，它将有利于体内研究HBx基因在肝细胞癌发生中的作用。     

建立转bcl-xL基因小鼠的研究

目的 建立转bcl—xL基因小鼠，继而传代建系，用于缺血性脑血管疾病的研究。方法 采用显微注射法，将人bcl—xL基因注入民明小白鼠受精卵获得子代鼠，然后作PCR、Southern—blot、mRNA、Western—blot检测以获得阳性鼠。结果 实验中注射受精卵1654枚，移植卵数1448枚，受体鼠49只，怀孕鼠7只，子代鼠13只，整合4只并均有表达。注射受精卵的存活率87．54％，受精卵的总存活率0．78％，受体鼠的怀孕率14．28％，整合效率30．77％，总有效率为0．24％。结论 获得了转bcl—xL基因小鼠，但转基因的效率较低，表达不稳定。