含人γ-干扰素基因真核表达载体的构建及其在肝癌细胞中的表达

目的 构建含人γ-干扰素（IFN-γ）基因的真核表达载体（pcDNA3-IFN-γ),并观察其在肝癌细胞株中的表达情况。方法 将IFN-γ的cDNA亚克隆于哺乳动物载体（pcDNA3）上，经脂质体介导将pcDNA3-IFN-γ导入人肝癌细胞株SMMC-7721和QGY-7701中，通过高剂量G418选择培养得出抗性克隆。RT-PCR检测IFN-γ基因在转染细胞内有无转录，ELISA法检测转染细胞内IFN-γ的表达水平。结果 IFN-γ基因在转染细胞内有无转录，ELISA法检测转染细胞内IFN-γ的表达水平。结果 IFN-γ基因的mRNA仅存在于pcDNA3-IFN-γ导入的肝癌细胞内。其细胞培养上清液存在高水平的IFN-γ。结论 含IFN-γ基因的真核表达载体能在肝癌细胞中稳定表达。     

人PAX8与PPARγ的融合基因（PPFP）的克隆及其重组质粒的构建

目的 探讨人PAX8/FPARγ融合基因(PPFP)表达质粒在甲状腺上皮细胞中的表达及作用.方法 从含有PAX8基因和PPARγ基因的质粒克隆模板PAX8-pOTB7及PPARγ-pCMV-SPORT6中,利用PCR方法 调取目的 基因PAX8和PPARγ,将PAX8和PPARγ定向连接后克隆到pEGFP-C1载体上,构建融合基因的真核表达质粒pEGFP-C1-PAX8/PPARγ,在大肠杆菌E.coli DH5α中转化并提取质粒,通过PCR和测序、分析比对验证PPFP融合基因后,将真核表达载体pEGFP-C1-PAX8/PPARγ的质粒用脂质体包合并转染人正常甲状腺上皮细胞Nthy ori 3-1,通过RT-PCR和Western blot鉴定PPFP融合基因于靶细胞内在mRNA和蛋白水平上的表达.结果 构建的质粒通过鉴定证实正确;该质粒转染人正常甲状腺上皮细胞Nthy ori 3-1后,经验证显示PPFP融合基因在mRNA和蛋白水平上顺利表达.结论 成功克隆了PPFP融合基因并构建其重组质粒pEGFP-C1-PAX8/PPARγ;该质粒转染人正常甲状腺上皮细胞Nthy ori 3-1后可顺利表达PPFP蛋白,为进一步研究PPFP基因致瘤作用的分子机制提供了实验基础.     

人IFN-γ cDNA逆转录病毒载体的构建及其在人膀肤癌细胞中的表达

用逆转录病毒载体介导转移人干扰素γ(hIFN-γ)基因在人膀胱癌细胞EJ中稳定表达。应用基因重组技术构建含hIFN-γ基因的逆转录病毒载体pZip-hIFN-γ,采用脂质体介导法转染包装细胞Ψ-2和PA 317,然后用高病毒滴度的PA 317细胞培养上清感染EJ细胞。经G 418筛选培养得到一株能稳定分泌hIFN-γ(210IU/ml)的EJ克隆,Southern印迹证实hIFN-γ基因已插入EJ基因组中。逆转录病毒载体pZip-hIFN-γ能有效地介导基因转移,并能使目的基因在靶细胞稳定表达,这为人膀胱癌转hIFN-γ基因瘤苗的应用研究打下了基础。     

新型的病毒-基因治疗系统CNHK500-hγ的构建

目的研制出一种新的基因-病毒治疗系统。方法通过基因操作技术将主要晚期启动子(MLP)调控的人干扰素-γ基因插入腺病毒E1A基因受hTERT启动子调控、E1B基因受HRE启动子调控的增殖病毒载体质粒PXC70-HRE-TP的E1A上游,得到腺病毒质粒pSG500-hγ。通过pSG500-hγ与质粒pBHGE3在293细胞中同源重组得到重组病毒CNHK500-hγ。用TCID50方法测定病毒滴度。通过增殖实验观察重组病毒的选择性增殖能力。利用ELISA法检测人干扰素-γ抗癌基因的表达。结果CNHK500-hγ的病毒滴度为4×109pfu/ml,增殖实验结果证实CNHK500-hγ可以选择性地在端粒酶阳性的肝癌细胞中增殖,CNHK500-hγ所携带的人干扰素-γ基因在肝癌细胞株中的表达量(442μg/L)明显高于携带该基因的非增殖型腺病毒载体(120μg/L)Ad-hγ(P<0.005)。结论CNHK500-hγ是一种具备治疗肝癌潜力的新型基因-病毒治疗系统。     

脂质体-γ-干扰素DNA复合物肝内直接注射对大鼠肝纤维化的影响

目的　探讨脂质体 γ干扰素(γIFN )DNA复合物肝纤维化肝脏内直接注射后的表达及对肝纤维化的影响。方法　用阳离子脂质体包裹人γIFNDNA ,并直接注射入肝纤维化大鼠的肝实质内,3周后,用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血内γIFN水平并评估肝纤维化程度变化。结果　肝内注射脂质体 γIFNDNA复合物的大鼠下腔静脉血中检测到了γIFN的表达(6.6±1.7)mg/L ,而对照组却未检出;行γIFN基因肝内注射的大鼠在基因转导前后,肝纤维化分期、Ⅳ型胶原染色及肝纤维化的Chevallier评分无明显改变(P >0 .0 5 ) ,且均显著轻于对照组(P <0 .0 5 )。结论　脂质体 DNA复合物进行肝实质内注射是一条肝纤维化肝内直接基因转导的有效途径,外源γIFN基因肝内直接注射具有预防或改善肝纤维化的作用     

AP-1反义寡聚脱氧核苷酸逆转人膀胱癌耐药细胞多药耐药的实验研究

目的 观察以激活剂蛋白-1(AP-1)位点为靶序列的特异性反义寡聚脱氧核苷酸(a-sODNs)对人膀胱癌耐药细胞株多药耐药性的逆转作用。方法 设计针对谷胱甘肽(GSH)生物合成的限速酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因启动子区域AP-1序列的特异性asODNs，用阳离子脂质体包被后转染人膀胱癌细胞株BIU87及其多药耐药(MDR)亚株BIU87／A，然后分别用定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法[以β-肌动蛋白(β-actin)为内参照]、荧光分光光度法、MTT法等检测AP-1-asODNs对两株细胞γ-GCSmRNA表达、细胞内GSH水平及其对6种抗癌药物肿瘤细胞抑制率的变化。结果 AP-1-asODNs转染72h后，BIU87和BIU87／A细胞的γ-GCS mRNA的表达和细胞内GSH的水平均出现下降。同时6种抗癌药物对反义转染后的两株细胞的抑制率大部分都有所提高。结论 γ-GCS特异的AP-1-asODNs可通过降低细胞内的GSH水平增强膀胱癌细胞对化疗的敏感性，逆转肿瘤细胞的耐药。     

人γ-干扰素基因修饰的结肠癌细胞瘤苗的抗肿瘤作用

目的研究人γ-干扰素(human interferon-γ,huIFN-γ)基因修饰的结肠癌细胞瘤苗的成瘤性及抗肿瘤作用。方法用逆转录病毒质粒pL(IFN-γ)SN将人IFN-γ基因转导入鼠结肠癌细胞株CT26中,用G418进行筛选,得到抗性克隆CT26／IFN-γ,比较CT26／IFN-γ与野生型CT26的成瘤性,评价CT26／IFN-γ对野生型CT26细胞肝转移模型的治疗作用。结果CT26／IFN-γ能在含0．6 g·L-1 G418的培养液中稳定生长;RT-PCR证实IFN-γ基因在CT26／IFN-γ中表达;CT26／IFN-γ细胞能分泌人IFN-γ,体外培养体系中产量为3．5 fg·cell-1·d-1;CT26／IFN-γ的成瘤性比野生型CT26差[Balb／c小鼠肿瘤体积分别为(480±138)mm3与(991±176)mm3,F=31．29,P=0．000]; CT26／IFN-γ对野生型CT26的肝转移亦有明显抑制作用,荷瘤小鼠存活期明显延长(P=0．000)。结论人IFN-γ基因修饰的结肠癌细胞瘤苗有一定的抗肿瘤作用,值得进行深入研究。     

转染干扰素-γ诱导蛋白-10基因构建树突状细胞前列腺癌瘤苗及其抗肿瘤免疫作用的检测

目的 将小鼠前列腺癌细胞株RM-1裂解产物加载树突状细胞(DC)后，转染干扰素-γ诱导蛋白-10(IP-10)基因构建DC瘤苗，探讨该瘤苗对小鼠抗肿瘤免疫反应的诱导作用。方法 将RM-1细胞的裂解产物作为肿瘤抗原加载小鼠骨髓来源的DC，并通过脂质体法转染IP-10基因，构建DC瘤苗；检测DC瘤苗的抗前列腺癌免疫治疗作用和免疫保护作用。结果 转染DC强表达IP-10，其上清对淋巴细胞有较强的趋化作用；构建的DC瘤苗能诱导特异性抗前列腺癌免疫反应，经瘤苗处理的荷瘤小鼠瘤体生长减慢，存活期延长；瘤苗还具有明显的免疫保护作用。结论 构建的前列腺癌DC瘤苗在体内能有效诱导抗肿瘤免疫反应和免疫保护功能。     

β-葡萄糖醛酸苷酶基因对人膀胱癌T24细胞的转染及表达

目的：探讨β-葡萄糖醛酸苷酶（βG）基因对人膀胱癌T24细胞的转染及表达的可行性。方法：采用基因工程技术构建带βG基因的真核表达载体，利用脂质体介导法在体外将βG基因导入人膀胱癌T24细胞，利用mRNA打点杂交、原位杂交、免疫组织化学、Western bloting 方法检测βG基因的转录和表达情况。结果：成功克隆出含人βG基因全长的真核表达载体pcDNA3.1-βG，以阳离子脂质体LipofectAMINE为载体将βG基因转染T24细胞后，经400mg/L的G418筛选后可形成抗性克隆；βG基因打点杂交和原位杂交结果显示转基因细胞中有βGmRNA的高表达；免疫组织化学和Western bloting证实转基因细胞中有βG蛋白的强阳性高表达。结论：βG基因可被成功转染入人膀胱癌细胞并能有效表达。     

γ-干扰素对前列腺癌细胞粘附和侵袭能力影响的初步研究

目的：探讨γ-干扰素对前列腺癌细胞粘附和侵袭行为的影响。方法：用纤维粘连蛋白和层粘连蛋白处理细胞培养板，检测γ-干扰素对前列腺癌细胞系LNCaP和PC-3粘附作用的影响；用Transwell小室，以Matrigel和纤维粘连蛋白构建基底膜，检测γ-干扰素对前列腺癌细胞侵袭人工基底膜能力的影响；应用Western-blot法检测γ-干扰素对前列腺癌细胞膜粘连蛋白-2（annexin-2）表达的影响。结果：γ-干扰素未处理的两种人前列腺癌细胞系细胞LNCaP、PC-3粘附率分别为46％和40％，γ-干扰素处理的两种细胞系细胞LNCaP、PC-3粘附率分别为21％和23％，同种细胞系γ-干扰素处理组与未处理组间差异有显著性（P均〈0．05）。在相同细胞系γ-干扰素处理组较未处理组前列腺癌细胞24h侵袭能力明显降低（P均〈0．05）。Western印迹结果表明γ-干扰素可显著抑制annexin-2蛋白的表达（P〈0．05）。结论：γ-干扰素可能通过下调annexin-2的表达来抑制前列腺癌细胞的粘附和侵袭。     

γ-干扰素对前列腺癌细胞粘附和侵袭能力影响的初步研究

目的：探讨γ-干扰素对前列腺癌细胞粘附和侵袭行为的影响。方法：用纤维粘连蛋白和层粘连蛋白处理细胞培养板，检测γ-干扰素对前列腺癌细胞系LNCaP和PC-3粘附作用的影响；用Transwell小室，以Matrigel和纤维粘连蛋白构建基底膜，检测γ-干扰素对前列腺癌细胞侵袭人工基底膜能力的影响；应用Western-blot法检测γ-干扰素对前列腺癌细胞膜粘连蛋白-2（annexin-2）表达的影响。结果：γ-干扰素未处理的两种人前列腺癌细胞系细胞LNCaP、PC-3粘附率分别为46％和40％，γ-干扰素处理的两种细胞系细胞LNCaP、PC-3粘附率分别为21％和23％，同种细胞系γ-干扰素处理组与未处理组间差异有显著性（P均〈0．05）。在相同细胞系γ-干扰素处理组较未处理组前列腺癌细胞24h侵袭能力明显降低（P均〈0．05）。Western印迹结果表明γ-干扰素可显著抑制annexin-2蛋白的表达（P〈0．05）。结论：γ-干扰素可能通过下调annexin-2的表达来抑制前列腺癌细胞的粘附和侵袭。     

转肝细胞生长因子基因肝细胞模型的建立

目的：利用脂质体介导法在体外建立转肝细胞生长因子（HGF）基因的人肝细胞模型。方法：建立HGF真核细胞表达载体，利用脂质体介导法在体外将HGF基因转染入人肝细胞，利用荧光显微镜观察、免疫组织化学、原位杂交方法检测HGF真核细胞表达载体的转录和表达情况。结果：以阳离子脂质体LipofectAMINE为载体将HGF基因转染人肝细胞后，经400mg/L的G418筛选后可形成抗性克隆；Neo基因原位杂交结果显示转染基因的细胞有阳性表达；荧光显微镜下观察到有绿色荧光；免疫组织化学证实转染HGF基因的肝细胞有HGF蛋白的表达。结论：HGF基因可被成功转染入人肝细胞并能有效表达，这可能为肝病的基因治疗提供一种新途径。     

丁酸钠通过信号转导和转录激活因子1抑制肝癌细胞吲哚胺2,3-双加氧酶的表达

目的 观察丁酸钠(NaB)对干扰素-γ(IFN-γ)诱导的人肝癌细胞HepG2内吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)表达的影响.方法 利用低浓度(10、20、30、40 mmol/L)的NaB作用于人肝癌细胞HepG2 24 h,通过噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞的增殖;利用蛋白印迹法及细胞免疫化学法检测NaB对HepG2细胞内IDO表达的影响;蛋白印迹法检测NaB对IDO基因表达的关键性干扰素应答因子1 (IRF-1)及信号转导和转录激活因子1(STAT1)的影响.结果 低浓度NaB对人肝癌细胞HepG2的增殖具有1％～20％的抑制作用;3 mmol/L的NaB能完全抑制IFN-γ诱导的IDO的表达;这种抑制作用通过抑制STAT-1701位的酪氨酸磷酸化实现.结论 NaB通过抑制STAT1的磷酸化而抑制肝癌细胞HepG2中IDO的表达.     

Survivin反义寡核苷酸诱导肝癌细胞凋亡及细胞结构的变化

目的采用反义寡核苷酸封闭肝癌细胞中Survivin基因的表达，研究其诱导细胞凋亡过程中对细胞超微结构与细胞骨架的作用及其机理。方法采用脂质体介导Survivin反义寡核苷酸转染人肝癌细胞株SMMC-7721细胞，Western—blot及原位杂交方法检测Survivin蛋白及mRNA表达，流式细胞仪检测细胞凋亡比率，透射电子显微镜观察细胞超微结构变化，激光共聚焦显微镜观察细胞骨架微丝系统变化，激酶活性检测方法测定细胞内Caspase-3活性变化。结果脂质体介导Survivin反义寡核苷酸转染肝癌细胞后Survivin蛋白及mRNA表达分别由69．59及75．60降低至10．71及22．90，Caspase-3活性由0．0153升高至0．0992，同时细胞结构呈典型凋亡改变，细胞内微丝形态结构破坏，细胞凋亡比率由0．7％增加至31．4％。结论脂质体介导转染Survivin反义寡核苷酸可以有效降低细胞内Survivin基因的表达，并激活Caspase-3。活化的Caspase-3可以切割破坏细胞内骨架微丝系统的结构，进而诱导细胞凋亡。     

干扰素-γ在肾间质纤维化中的作用

近年的体内外研究中 ,干扰素的抗纤维化作用得到了初步证实 ,其中干扰素 -γ的特点在于 :与干扰素α/ β相比 ,它具有更强大的抗纤维化的作用。在许多细胞系中 ,干扰素 -γ能抑制细胞生长 ,增殖 ,转分化 ,下调胶原合成。干扰素 -γ抗肝纤维化作用已在体外和动物实验研究中取得了较大的进展 ,据此推测它在治疗肾脏纤维化方面可能具有潜在的应用前景。本文就干扰素 -γ的抗肾脏纤维化作用及影响其作用的因素展开综述。　　 1　干扰素 -γ的基因和蛋白质特点1.1　干扰素 -γ的基因特点　人干扰素按细胞来源分为α、β、γ三个亚型。干扰素 -α…     

γ干扰素抑制血管平滑肌细胞增殖

血管平滑肌细胞增殖除了受局部生长因子的调控外，还受细胞因子的作用，其中γ干扰素具有独特的效应。离体实验证实，γ干扰素有明显的抑制平滑肌细胞增殖和分化作用，促进细胞内诱导型ＮＯ合酶和ＮＯ的生成及表达，使ＤＮＡ集聚受抑，发挥细胞毒作用。在体研究表明，外源性γ干扰素亦能抑制血管平滑肌细胞增殖。     

靶向PPARγ基因siRNA载体的构建及沉默效应

目的构建靶向过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（peroxisome proliferator—activated receptor-γ，PPARγ）基因的小干涉RNA（small interfering RNA，siRNA）载体，转染骨髓基质细胞（marrow stromal cells，MSCs）后观察其对PPARγmRNA的抑制作用。方法根据siRNA设计原则，在PPARγmRNA序列中选择2个特异性靶序列（677-695和497-515）及同时设计1条无关对照序列；体外合成对应发卡样DNA片段，经退火后，将其定向克隆入siRNA载体pRNAT—U6．2，将重组siRNA载体pRNAT—U6．2-PPARγ用脂质体包裹转染入MSCs后，采用RT—PCR检测PPARγ基因mRNA表达水平的变化。结果得到阳性重组克隆pRNAT—U6．2-SPPARγ，经过PCR鉴定与测序，结果正确；RT—PCR检测转染MSCs显示，PPARγ基因的表达水平明显降低。结论成功构建靶向PPARγ基因的siRNA载体pRNAT—U6．2-SPPARγ，转染MSCs可以有效抑制PPARγmRNA的表达，这为预防酒精性股骨头坏死发生的研究奠定了可靠基础。     

脂质体介导的单纯疱疹胸苷激酶基因在人前列腺癌细胞中的表达

目的：提取并鉴定已构建的EB病毒表达载体pDR2-TK，利用脂质体介导的基因转染技术将pDR2-TK转染人前列腺癌细胞并对单纯疱疹胸苷激酶（HSV－TK）表达状况进行检测。方法：采用DNA大量制备及纯化系统提取pDR2-TK，酶切和DNA测序进行鉴定，采用阳离子脂质体法将pDR2-TK导入激素非依赖性人前列腺癌细胞系PC－3m，逆转录PCR（RT－PCR）法和SABC免疫组化法检测TK mRNA和蛋白的表达。结果：扩增提取的质粒经PstⅠ和EcoR Ⅴ酶切后各获得4个及2个片段，与原基因酶切图谱一致；所提取质粒PCR产物经DNA测序，与NCBI公布的HSV－TK基因序列对照，证实所提取质粒含目的基因序,旨质体法转染PC－3m细胞后，mRNA和蛋白均有HSV－TK的表达，其蛋白表达率约为22％。结论：pDR2-TK质粒含有目的的基因HSV－TK，阳离子脂质体法可将pDR2-TK导入人前列腺癌细胞并获得较高效率的表达。     

γ-干扰素对胆管癌细胞Fas/FasL系统调控作用的研究

目的 探索γ-干扰素（Interferon gamma,IFN-γ)对胆管癌细胞Fas/FasL系统的调控作用。方法 应用RT－PCR、Western blot、免疫组织化学、流式细胞仪和细胞培养技术，检测人胆管癌细胞株QBC939的Fas、FasL表达及相关功能，并研究IFN－γ对之的影响。结果 胆管癌细胞表达Fas、FasL基因及蛋白，并能致共同培养的Jurkat细胞发生凋亡；而IFN－γ可上调Fas、FasL基因（P＜0.01)及蛋白的表达，且调节作用呈剂量和时间依赖趋势；并能下调胆管癌细胞致Jurkat细胞凋亡的能力，在其剂量达500U／ml后更为明显。结论 IFN－γ可调控胆管癌细胞Fas/FasL系统的表达从而降低其发生免疫逃逸的能力；这为胆管癌的免疫治疗研究提供了新的资料。     

人α-肿瘤坏死因子基因在胆管癌细胞中的表达研究

我们利用阳离子脂质体、逆转录病毒载体介导人TNF-α基因转染进入胆管癌细胞，并实现了表达。