HCV定量RT—PCR竞争性参比标准的构建

将克隆的ＨＣＶ５‘ＮＣＲ序列反向插入ｐＳＰ７２的Ｅｃｏ ＲＶ切点，构建一种能转录ＨＣＶ－ＲＮＡ的质粒ｐＳｎｃ－２。以ＲＴ－ＰＣＲ从抗ＨＥＶ ＩｇＭ阳性病人血浆中扩增一段２３８ｂｐ的ＨＣＶ－ｃＤＮＡ反向插入ｐＳｎｃ－２中克隆的５’ＮＣＲ序列的ＮｃｏＩ切点，构建插入突变型ＨＣＶ－ｃＤＮＡ重组体ｐＳｎｃ－ｅ。     

用原位 PCR 研究石蜡包埋肝组织中微量 HCV RNA

为定位分析石蜡包埋肝组织中微量ＨＣＶＲＮＡ，改良建立了原位ＰＣＲ检测技术，并对１７例丙型肝炎相关的肝细胞癌患者癌组织和癌周肝组织石蜡包埋切片进行检测。结果显示：该技术的特异性可靠，敏感性高于原位杂交法；两种组织切片ＨＣＶＲＮＡ阳性率分别为４１．２％和７０．６％，阳性信号主要呈胞浆型分布；在癌细胞中核型和核膜型分布比例较癌周肝组织明显增高，提示ＨＣＶ可能与宿主细胞基因存在着相互作用。     

PCR循环测序法检测K-ras和HCV 5'非编码区基因变异

目的：建立一种简单、快速、可靠的ＤＮＡ序列分析方法，并利用此方法分析Ｋｒａｓ基因和ＨＣＶ５′非编码区基因的变异情况。方法：ＰＣＲ循环测序法是将ＰＣＲ扩增与核酸序列分析相结合的一种研究方法。根据此技术原理，建立了以ＰＣＲ扩增引物为测序引物，利用ＴａｑＤＮＡ聚合酶、荧光标记的２′，３′双脱氧核苷三磷酸（ｄｄＮＴＰ）直接进行ＰＣＲ扩增产物序列分析的方法。应用该方法对人肺癌组织中的Ｋｒａｓ癌基因和丙型肝炎病毒５′非编码区（ＨＣＶ５′ＮＴＲ）进行了序列测定。结果：肺癌组织中的Ｋｒａｓ基因第１外显子第３５位碱基发生点突变（ＧＧＴ→ＧＡＴ）；属于高度保守区的ＨＣＶ５′ＮＴＲ存在基因变异。结论：ＰＣＲ循环测序法具有简单、快速、结果可靠等特点，为基因突变的检测和病原体的核酸序列分析提供了一个快速实用的方法。     

HCV5’－NCR序列克隆和转录重组质粒构建

选取ＩＶ基因型ＨＣＶ及中国和台湾代表株ＨＣＶ的５’ＮＣＲ区保守序列合成引物，以ＲＴ－ＰＣＲ从输血后非甲非乙型肝炎病人血浆中扩增一段３００ｂｐ的ｃＤＮＡ片段作目的基因，钝端插入ｐＵＣ１９的ＳｍａＩ切点，构建了ｐＵＨＣＶ－ＮＣ重组质粒。对ｐＵＨＣＶ－ＮＣ分别或混合应用ＨＣＶ序列特异的内外引物和载体序列特异的通用引物进行ＰＣＲ扩增，所用产物分子量均同预期相符；酶切分析查出ＨＣＶ基因所带有和克隆位点融合所产生的两个外源ＮｃｏＩ切点也存在；证实ｐＵＨＣＶ－ＮＣ中克隆基因是ＨＣＶ的５’ＮＣＲ序列且插入方向为反向。应用ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双切出克隆ＨＣＶ基因，粘端插入ｐＳＰ７２的多克隆位点，均建了ｐＳＨＣＶ－ＮＣ转录重组体，对之进行了ＰＣＲ和酶切鉴定。     

定量聚合酶链反应检测血清中HCV RNA^＋

目的：探讨定量聚合酶链反应用于检测丙型肝炎病毒HCV含量变化的意义。方法：用信号引物能量转移定量聚合酶链反应（PCR），检测68例丙型肝炎患者血清HCVRNA水平。结果：其HCVRNA含量范围103～1011拷贝／ml，急性丙肝106.83±3.72拷贝／ml，慢性丙肝106.54±2.67拷贝／ml，而无症状携带者104.95±2.16拷贝／ml。血清HCVRNA水平同ALT水平呈相关。结论：丙肝病毒感染后HCV复制水平与肝损害相关，定量检测HCVRNA的水平变化是预测和评价干扰素疗效的重要指标。     

定量PCR分析HBsAg阳性肝癌患者手术前后血清HBVDNA变化

目的：明确外科手术对ＨＢｓＡｇ阳性肝癌患者乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）复制的影响。方法：以常规聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法检测了２０例ＨＢＶ血清学标志阳性肝癌患者血清中的ＨＢＶＤＮＡ；应用荧光能量转移定量聚合酶链反应（ＱＰＣＲ）测定肝癌手术切除前后病人血清中ＨＢＶＤＮＡ量的变化情况。结果：在部分肝癌病人（４０％）血清中可以检测到ＨＢＶＤＮＡ；外科手术后较手术前病人血清ＨＢＶＤＮＡ拷贝数增高（Ｐ＜０．０１）。结论：乙型肝炎病毒仍然在大部分肝癌病人体内进行着活跃的复制；外科干预在部分病人中引起病毒复制增加。     

HCV 5‘—NCR序列克隆和转录重组质粒构建

选取ＩＶ基因型ＨＣＶ及中国和台湾代表株ＨＣＶ的５’ＮＣＲ区保守序列合成引物，以ＲＴ－ＰＣＲ从输血后非甲非乙型肝炎病人血浆中扩增一段３００ｂｐ的ｃＤＮＡ片段作目的基因，钝端插入ｐＵＣ１９的Ｓｍａ１切点，构建了ｐＵＨＣＶ－ＮＣ重组质粒。对ｐＵＨＣＶ－ＮＣ分别或混合应用ＨＣＶ序列特异的内外引物和载体序列特异的通用引物进行ＰＣＲ扩增，所得产物分子阳均同预期相符；酶切分析查出ＨＣＶ基因所带和克隆位点融合所产     

HCV 广东株5’NCRc DNA的克隆及序列测定

从广东省１例慢性丙型肝炎病人血清中提取ＨＣＶＲＮＡ，随机引物逆转录为ｃＤＮＡ后用ＨＣＶ５’端非编码区（５’ＮＣＲ）特异引物进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）。扩增产物３０２ｂｐ，经补齐和提纯后插入ｐＵＣ１９质粒，获得的重组质粒ｐＵＮ采用双脱氧链终止法测定核苷酸序列，与国内外多个株比较，核苷酸同源性介乎９２．６９％～１００％，其中与ＨＣＶⅡ（１ｂ）型的同源性最大。本文的测序结果可为引物设计提供依据。获得的ＨＣＶｃＤＮＡ在常规ＰＣＲ步骤中用于设立有效的模板对照，对消除假阴性及评估试剂有重要意义。     

丙型肝炎病毒Ns_3基因区部分序列的PCR克隆和鉴定

选取HCV－1、HCV－J、HCV－BK、台湾株HCV、中国河北株HCV序列的同源性部分，设计Ns3区部分序列的PCR引物．应用RT－PCR技术，从丙型肝炎患者血浆中扩增一长为448bp的cDNA片段作为目的基因，与经过限制性酶切的pUcI9载体连接，构建重组质粒pUHCV－Ns3．分别或混合应用HCV序列特异的引物和载作序列特异的通用引物，以PCR扩增重组质粒，结果扩增产物的分子量均与预期大小一致．限制性酶切位点分析结果也证实，克隆的基因是HCV的Ns3区部分序列的目的基因．克隆序列的特异性和插入方向同时得到了鉴定．     

116例血清中HCV RNA定量检测与抗-HCV结果对比分析

目的探讨丙型肝炎病毒抗体(抗-HCV)和HCVRNA定量检测阳性结果对丙型肝炎诊断治疗的临床意义。方法采用第三代ELISA夹心法检测抗-HCV，荧光定量PCR法检测HCVRNA检测116例血清抗-HCV或HCVRNA阳性标本。结果在116例标本中，抗-HCV( )／HCVRNA( )双阳性者83例，抗-HCV( )／HCVRNA(-)者12例，抗-HCV(-)／HCVRNA( )者21例)。两者阳性符合率为71．6％(83／116)。在HCVRNA定量阳性结果中，则有104例为HCV感染，其中抗-HCV的阳性检出率为80．0％(83／104)。随着血清HCVRNA滴度的增高，抗-HCV的阳性率也增加，两者变化趋势一致。结论抗-HCV检测，HCVRNA荧光定量PCR法检测均有一定的局限性，同时应用抗-HCV和HCVRNA检测对临床上完善HCV诊断、评价抗病毒疗效更为准确。     

庚型肝炎病毒RT—PCR检测

目的：调查石家庄地区庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）的感染状况。方法：用聚合酶链反应（ＰＣＲ）法对５８例病毒性肝炎进行了ＨＧＶ－ＲＮＡ检测。结果：证实了石家庄地区有ＨＧＶ感染存在，在非甲型￣戊型肝炎中，ＨＧＶ－ＲＮＡ的阳性率为２０％。在乙型、丙型肝炎病毒所致的慢性肝炎、肝炎肝硬化中，分别有１６．６７％、１４．２９％的病例重叠有ＨＧＶ感染。结论：严格掌握输血指征，筛查献血员，杜绝医源性感染，将对控制ＨＧＶ感染     

单管中进行反转录－PCR检测肠道病毒RNA

采用改进的异硫氰酸胍－酚－氯仿一步抽提法提取肠道病毒ＲＮＡ，通过反复试验，建立了单管一ＲＴ一ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）反应体系。结果表明，此法较常规的分步法简便快速、可靠，为临床检测和流行病学研究提供了较理想的方法。     

HBVDNA与HCVRNA同步扩增技术的建立与应用

同一份血清中的ＨＢＶＤＮＡ与ＨＣＶＲＮＡ经热变性直接法一步裂解，先用针对ＨＣＶ特异的外引物将ＨＣＶＲＮＡ逆转录为ｃＤＮＡ，然后采用ＨＢＶ，ＨＣＶ各自特异的２套引物进行ＰＣＲ同步扩增。结果按预定大小，ＰＣＲ产物出现２条带。分别为４２８ｂｐ，１４４ｂｐ。将产物转移至尼龙膜上，经α－３２ＰｄＣＴＰ标记ＨＣＶ探针及地高辛素标记ＨＢＶ探针进行重复杂交，证明１４４ｂｐ为ＨＣＶ所特有，４２８ｂｐ为ＨＢＶ特有。用该方法对３０份单独检测证实ＨＢＶ，ＨＣＶ核酸均阳性血清测验，其结果完全吻合、该二联技术可明显缩短检测时间，具有简便、快速、敏感的特点。     

干扰素治疗慢性乙型肝炎病人HBV-DNA的实时FQ-PCR检测及其意义

①目的 探讨实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）定量检测乙型肝炎病毒DNA（HBV-DNA）对干扰素（IFN）治疗慢性乙型肝炎（CHB）疗效预测及评价的价值。②方法 21例CHB病人，在治疗前、治疗过程中第1～6个月、疗程结束后随访6和12个月共9个时间点分别取血，用FQ-PCR定量检测HBV-DNA、放免法定量检测HBeAg。③结果 用药后第1～5个月，HBV-DNA载量逐月下降（H=137．50，q=4．68～14．04，P均〈0．01）;其后不再下降。治疗前血清HBV-DNA与HBeAg和谷丙转氨酶（ALT）呈高度正相关（r=0．719、0．492，P〈0．05），治疗期间及随访过程中各时间点HBV-DNA与ALT呈负相关（r=-0．259～-0．057，P〈0．05），与HBeAg呈低度正相关（r=0．014～O．138，P％0．05）。④结论 FQ-PCR以其高度的敏感性及简便、快速、准确而成为目前HBV-DNA定量检测的首选方法；在应用IFN治疗CHB前，应根据血清HBV-DNA拷贝数和其他预测因子慎重选择病例，可以明显提高疗效。     

应用荧光定量PCR检测血清中HCV RNA

目的 :探讨荧光定量PCR(FQ PCR)法检测血清中丙型肝炎病毒 (HCV)含量的敏感性、特异性。方法 :采用FQ PCR和逆转录巢式PCR同步检测 76份HCV抗体阳性血清标本 ,并对两种方法的检测结果进行对照比较。结果 :FQ PCR定量HCVRNA拷贝数在 10 2 ～10 6拷贝·μl-1,其中低于 10 3 拷贝·μl-1占 2 0 .93 % ,10 3 ～ 10 5拷贝·μl-1占 60 .47% ,高于 10 5拷贝·μl-1占 18.60 %。 76份HCV抗体阳性血清中 ,巢式PCR检测阳性为 45份 ,FQ PCR检测阳性为 43份 ,二者相对符合率为 97.3 7%。结论 :FQ PCR检测HCVRNA与常规定性巢式PCR特异性、敏感性基本一致。     

白血病 BCR-ABL 融合基因逆转录 PCR 检测中的实验因素探讨

建立白血病中费城（Ｐｈ）染色体上独特的ｂｃｒ－ａｂｌ融合基因的逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）快速检测方法。利用正交设计原理优化逆转录反应条件，探讨该法中引物设计和嵌套式ＰＣＲ对检测灵敏度的影响，利用扩增产物所含限制性酶切位点进行产物特异性鉴定。运用此法检测１２例慢性粒细胞白血病，除１例阴性外，其余１１例阳性标本含不同类型（ｂ３ａ２，ｂ２ａ２，Ｂ１ａ２）ｂｃｒ－ａｂｌｍＲＮＡ。讨论了用于临床标本检测中应考虑的问题。     

用高度保守区引物和套式PCR扩增丙型肝炎病毒

采用套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法，以具有高度保守性的丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＲＮＡ５＇端非编码区引物对，扩增１０例输血后肝炎血清，８例（８０％）阳性。并将逆转录与第一轮ＰＣＲ结合连续进行，使操作简便有效。间接证明了ＨＣＶ上海株与世界若干地区ＨＣＶ株５＇端非编码区核酸序列具有高度同源性和保守性。     

山东省HCV分离株C 区及NS5 区核苷酸序列分析

①目的 探讨山东省丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）分离株Ｃ区、ＮＳ５区的核苷酸序列及其基因型别。②方法 以ＲＴ－ｎｅｓｔ－ＰＣＲ方法从１例临床ＨＣＶ感染者血清中分别扩增出ＨＣＶＣ区（４３２ｂｐ）及ＮＳ５区（３１９ｂｐ）的基因片段,将其克隆于Ｔ载体上,以双脱氧末端终止法自动测序并进行序列分析。③结果 该分离株与ＧｅｎＢａｎｋ中５０多个１ｂ型分离株同源性均在９０％以上,其中Ｃ区与中国北京的１ｂ型株ＨＣＵ６３３７     

用三种逆转录PCR扩增系统检测丙型肝炎病毒RNA的比较

目的：比较常用的三种（ＭＭＬＶ／Ｔａｑ，ＡＭＶ／Ｔａｑ和Ｔｔｈ单酶）逆转录ＰＣＲ扩增系统的效果。方法：利用这三个系统对丙型肝炎病毒不同稀释度ＲＮＡ进行逆转录ＰＣＲ扩增，比较其检测灵敏度。结果：ＡＭＶ／Ｔａｑ系统最佳，ＭＭＬＶ／Ｔａｑ系统次之，Ｔｔｈ单酶系统最差，ＡＭＶ／Ｔａｑ系统的检测灵敏度比Ｔｒｈ单酶系统高１００００倍，比ＭＭＬＶ／Ｔａｑ系统高１００倍。结论：建议使用ＡＭＶ／Ｔａｑ酶的逆转录ＰＣＲ扩增系统以提高丙型肝炎病毒的检测灵敏度，减少假阴性的出现。