RNAi抑制HIF-1α基因逆转卵巢癌多药耐药的实验研究

目的 探讨靶向缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)载体表达的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)逆转卵巢癌细胞多药耐药的可行性.方法 构建靶向HIF-1α短发夹状siRNA 基因表达载体,脂质体介导转染人卵巢癌COC1/DDP细胞.Western blot法检测HIF-1α蛋白和P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的表达;实时定量PCR(real time PCR)检测HIF-1α和多耐药基因1(mdr-1)mRNA的表达;MTT法检测COC1/DDP细胞对化疗药物顺铂的抗性.结果 转染HIF-1α短发夹状siRNA真核表达载体的COC1/DDP细胞,低氧条件下HIF-1α蛋白及mRNA表达水平下降,同时mdr-1基因的mRNA及其编码的P-gp蛋白水平也明显下降,对顺铂的药物敏感性增加.结论 HIF-1α短发夹状siRNA真核表达载体可有效地抑制卵巢癌COC1/DDP细胞HIF-1α和mdr-1基因的表达,逆转卵巢癌细胞的多药耐药.     

过表达HIF-1α和VEGF蛋白与垂体腺瘤侵袭行为的关系

目的:探讨缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和血管内皮生长因子(VEGF)在垂体腺瘤中的表达及与垂体腺瘤侵袭性的关系。方法:收集的32例垂体腺瘤标本中侵袭性垂体腺瘤20例,非侵袭性垂体腺瘤12例,应用免疫组化染色检测HIF-1α和VEGF蛋白的表达。并对侵袭组与非侵袭组的HIF-1α和VEGF蛋白表达及不同大小肿瘤HIF-1α和VEGF蛋白表达进行分析比较。结果:非侵袭组垂体腺瘤中HIF-1α和VEGF蛋白表达阳性率与侵袭组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;垂体腺瘤直径大于30 mm者HIF-1α和VEGF蛋白表达阳性率与直径10~30 mm者比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论:HIF-1α和VEGF蛋白在侵袭性垂体腺瘤中的表达明显增加,并且与垂体腺瘤侵袭行为密切相关。     

RSUME与垂体腺瘤侵袭性的分子机制研究进展

垂体腺瘤为颅内良性肿瘤，但却是成年人脑肿瘤的第三大常见肿瘤，仅次于神经胶质瘤和脑膜瘤。垂体腺瘤定义为良性肿瘤，但部分垂体腺瘤可对周围组织有侵袭性，手术难以切除，术后易复发。RWD结构修饰增强子（RWD containing sumoylation enhancer，RSUME），可在垂体腺瘤中通过小泛素化（small ubiquitin related modifiers，SUMO）稳定缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）以及抑制分子kappaB（inhibitor kappaB，IκB）的活性，促进垂体腺瘤的侵袭作用。RSUME对体腺瘤的侵袭性起着重要的作用，但RSUME的作用与垂体腺瘤侵袭的相关性尚未明确。本文就RSUME对垂体腺瘤侵袭作用中HIF-1α/VEGF信号通路以及IκB/NF-κB复合体的作用进行综述。      

HIF-1α基因干扰对大鼠CBRH-7919肝癌细胞HIF-1α与VEGF表达影响的研究

目的:探讨沉默缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对肝癌细胞在缺氧状态下表达HIF-1α及血管内皮生长因子(VEGF)的影响.方法:选用大鼠CBRH-7919肝癌细胞株作为研究对象,利用氯化钴(CoCl2)模拟缺氧状态,构建3组特异性较强的HIF-1α siRNA表达载体,采用小分子RNA干扰技术沉默细胞HIF-1α的基因表达,分别利用real time RT-PCR和蛋白质印迹法检测肝癌细胞HIF-1α和VEGF在mRNA及蛋白水平的表达变化.结果:在不同浓度CoCl2模拟缺氧条件下,随着CoCl2浓度的增高及时间的推移,肝癌细胞HIF-1α和VEGF的表达(mRNA及蛋白水平)较常氧对照组(0 μmol/L CoCl2)显著增多,差异均有统计学意义,P＜0.05.应用3组不同HIF-1α和siRNA表达载体转染缺氧条件下的肝癌细胞后,细胞的HIF-1α和VEGF的基因(mRNA)表达量与未转染HIF-1α siRNA表达载体对照组相比较明显减少,同步检测两者的蛋白表达亦明显减少,与对照组差异均有统计学意义,P＜0.05.结论:缺氧可以诱导肝癌细胞HIF-1α和VEGF的表达,siRNA沉默HIF-1α能显著抑制缺氧状态下诱导的VEGF表达.     

CD147 siRNA对乳腺癌细胞HIF-1α、MMP-2与VEGF表达及细胞凋亡的影响

目的:探讨CD147 siRNA对乳腺癌细胞VEGF、MMP-2和HIF-1αmRNA表达及细胞凋亡的影响。方法:对乳腺癌细胞株MDA-MB-435转染CD147 siRNA真核表达载体,实时定量PCR法及Western blot检测VEGF、MMP-2和HIF-1αmRNA与蛋白表达的变化,流式细胞仪检测细胞的早期凋亡率。结果:转染CD147 siRNA沉默CD147基因后,乳腺癌细胞VEGF、MMP-2和HIF-1α蛋白与mRNA表达均明显下降(P<0.05),而细胞的早期凋亡率则显著增高(3.32%vs 15.21%,P<0.05)。结论:CD147作为一种重要的调控分子,可以下调乳腺癌细胞HIF-1α、MMP-2及VEGF的表达,从而参与了乳腺癌的增殖、转移等过程。     

HIF-1α对非霍奇金淋巴瘤细胞凋亡作用机制的探讨

目的:研究HIF-1α对常氧状态下培养的人非霍奇金淋巴瘤(NHL)细胞凋亡的作用及其调控机制.方法:以HIF-1α抑制剂Echinomycin(EC)处理人NHL细胞,采用Annexin-V染色方法检测肿瘤凋亡水平的变化,采用蛋白质印迹法检测各细胞系中Survivin及凋亡相关蛋白Bcl-2和caspase-3的表达水平;进一步应用HIF-1α反义质粒转染肿瘤细胞,检测转染后Survivin蛋白表达水平.结果:HIF-1α抑制剂EC能够诱导NHL细胞的凋亡(P<0.05),具有时间和剂量依赖性.抑制HIF-1α的表达明显抑制了肿瘤细胞中Survivin蛋白表达水平,同时,凋亡相关蛋白Bcl-2表达减低而Caspase-3蛋白表达增加,与对照组相比差异均具有统计学意义,P<0.05.转染反义HIF-1α siRNA后肿瘤细胞中Survivin蛋白表达水平明显下降(P<0.05).结论:抑制HIF-1α能够诱导NHL细胞凋亡,其机制可能与下调Survivin蛋白表达水平有关.     

基因沉默HIF-1α在结直肠癌SW480细胞的缺氧与上皮-间质转化中的作用

目的通过基因沉默缺氧诱导因子-1α(HIF-1α),研究其对结直肠癌SW480细胞的生长增殖、侵袭迁移能力,及对锌指转录因子(Snail)与上皮钙黏蛋白(E-cadherin)表达的影响和作用。方法利用氯化钴(CoCl2)化学诱导建立结直肠癌SW480细胞的缺氧模型,设计合成HIF-1α的小干扰RNA(HIF-1α-siRNA)并将其转染入细胞内。通过四甲基偶氮唑兰(MTT)法检测细胞的体外生长增殖活性,体外侵袭实验(Transwell法)检测细胞的体外侵袭迁移力,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫蛋白印迹(Western blot)检测细胞中HIF-1α、Snail及E-cadherinmRNA与蛋白的表达情况。结果 MTT法检测结果显示,缺氧条件下,基因干扰组的OD值及细胞存活率均降低(P<0.05);体外侵袭实验结果显示,基因干扰组侵袭迁移率降低(P<0.05);RT-PCR与Western blot检测结果显示,基因干扰组中HIF-1α和Snail mRNA和蛋白的表达明显降低,E-cadherin mRNA和蛋白的表达明显增强(P<0.05),对3种因子进行相关性分析,结果显示HIF-1α和Snail的表达呈正相关,HIF-1α和Snail均与E-cadherin的表达呈负相关(P<0.05)。结论 RNA干扰沉默HIF-1α基因可抑制结直肠癌SW480细胞的体外生长增殖和体外侵袭迁移能力,其机制可能是由于基因沉默HIF-1α导致细胞中Snail低表达,E-cadherin高表达,抑制了EMT发生、发展所致。     

低氧诱导因子-1αRNAi表达质粒对卵巢癌细胞影响的实验研究

目的:探讨人HIF-1α短发夹(sh)RNA表达质粒对卵巢癌SKOV3细胞HIF-1α基因的表达及对紫杉醇敏感性的影响.方法:构建HIF-1α(sh)RNA表达质粒,脂质体法转染,RT-PCR和Western blot检测癌细胞HIF-1α mRNA和蛋白表达水平,MTT法检测癌细胞对紫杉醇的敏感性.结果:转染质粒48 h后,H质粒转染组SKOV3细胞紫杉醇作用24 h的IC50值明显降低(P<0.05),同时P-糖蛋白表达水平显著降低,差异有统计学意义(F=7.24,P=0.01).结论:针对HIF-1α的RNAi表达质粒可下调低氧培养的卵巢癌细胞SKOV3 HIF-1α基因mRNA和蛋白及P-gp的表达,从而提高癌细胞对紫杉醇的敏感性.     

RNA干扰HIF-1α对低氧状态下食管鳞癌Eca109细胞放射敏感性的影响

目的:观察低氧状态下食管鳞癌Eca109细胞中低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)及表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的表达,探讨HIF-1α对Eca109细胞放射敏感性的影响及其可能的分子机制。方法:以常氧组为对照。氯化钴(cobalt chloride,CoCl_2)模拟肿瘤低氧微环境,用RT-PCR检测体外低氧状态下Eca109细胞中HIF-1α和EGFR mRNA表达水平,免疫细胞化学法检测HIF-1α和EGFR蛋白表达水平。Western blot检测RNAi沉默HIF-1α对EGFR蛋白表达的影响、采用流式细胞术检测HIF-1α沉默后,Eca109细胞经放射线照射后的凋亡情况,评价其放射敏感性的变化。结果:与常氧组比较,低氧状态下,Eca109细胞中HIF-1αmRNA表达无明显变化(P0.05),HIF-1α蛋白表达增加。EGFR mRNA表达明显升高(P0.05),EGFR蛋白表达也相应增加。与未转染组和对照组比较,siRNA转染Eca109细胞可有效沉默HIF-1α蛋白在低氧状态下的表达(P0.05),EGFR蛋白的表达水平也明显下调(P0.05)。Eca109细胞在低氧状态下放射敏感性较常氧下明显降低(P0.05)。RNAi沉默HIF-1α可部分逆转低氧造成的Eca109细胞的放射耐受。结论:低氧可上调食管鳞癌Eca109细胞HIF-1α蛋白水平;HIF-1α增加Eca109细胞在低氧状态下的放射抗性,可能与HIF-1α上调EGFR mRNA及蛋白表达有关,有效抑制HIF-1α可增加Eca109细胞的放射敏感性。     

VEGFR-3 siRNA对人结肠癌细胞黏附力和侵袭性的抑制作用

目的:探讨VEGFR-3对人结肠癌细胞黏附力和侵袭性的影响.方法:构建携靶向 VEGFR-3基因siRNA(small interfering RNA)表达载体,转染人结肠癌LoVo细胞, 半定量RT-PCR和Western blotting检测转染前后LoVo细胞VEGFR-3 mRNA和蛋白表达的变化,基质-黏附实验检测细胞转染后的黏附能力,细胞侵袭实验检测转染后肿瘤细胞侵袭性的改变.结果: 携靶向VEGFR-3基因siRNA的表达载体成功构建,RT-PCR检测转染siRNA后LoVo细胞VEGFR-3 mRNA表达水平降低;Western blotting检测转染siRNA后72 h LoVo细胞VEGFR-3蛋白表达下降,其表达相对值由(1.26±0.19)降至(0.39±0.12)(P<0.05).转染siRNA 72 h后LoVo细胞的黏附能力显著下降[(0.626±0.047)vs (0.407±0.029), P＜0.05];LoVo细胞穿膜细胞数(6.38±3.25)明显低于空白对照组(24.82±3.44)、非特异性对照组(23.58±3.73) (P＜0.05).结论:siRNA能够在LoVo细胞中引发RNA干扰效应,下调VEGFR-3基因的表达,进而抑制LoVo细胞的黏附能力和侵袭性.     

HIF-1α通过调控脂代谢关键基因促进肾癌细胞的侵袭

目的:脂肪代谢在肾癌的发生、发展过程中至关重要.缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)被认为是肾癌发生发展过程中关键的基因之一,其参与调控肾癌的侵袭转移过程.本研究探讨肾癌细胞侵袭过程中HIF-1α与脂肪代谢相关基因的关系.方法:采用免疫组织化学法检测人肾癌组织内HIF-1α、SCD1及FASN的表达,分析各基因之间的相关性.采用HIF-1 α过表达质粒或敲除shRNA沉默正常肾脏细胞HK-2及肾癌细胞ACHN内HIF-1α后,运用real-time PCR及Western blot技术检测脂肪代谢相关基因SCD1及FASN的表达改变情况.采用Transwell实验检测细胞体外侵袭能力,并运用SCD1及FASN的siRNA行基因沉默后,检测此两种基因对细胞侵袭能力的影响.结果:免疫组织化学结果显示SCD1及FASN在肾癌组织中的表达与HIF-1α呈显著正相关.HIF-1α过表达质粒能明显上调SCD1和FASN mRNA及蛋白的表达水平,反之,HIF-1α shRNA则明显抑制两种基因的表达.HIF-1α促进肾癌细胞ACHN的体外侵袭能力,而同时转染SCD1及FASN siRNA沉默基因表达后,细胞的侵袭能力减弱.结论:调控肾癌脂肪代谢的基因SCD1及FASN在HIF-1α所调控的肾癌细胞的侵袭过程中发挥重要作用.     

siRNA沉默HIF-2α对缺氧培养的BGC-823胃癌细胞中VEGF表达的影响

目的:观察乏氧培养条件下胃腺癌细胞系BGC-823中HIF-2α和VEGF的表达,探讨HIF-2α在低氧条件下对胃癌血管生成的调控作用.方法:采用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)和Western blot法分别检测低氧状态下HIF-2α和VEGF在mRNA和蛋白水平的表达.进一步采用化学合成小干扰RNA(siRNA)介导的RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)转染BGC-823细胞.观察转染后HIF-2 α沉默效果.结果:与常氧时比较,缺氧后BGC-823细胞HIF-2α、VEGF的mRNA水平稳定,而蛋白的表达水平均明显升高(P＜0.05),siRNA转染BGC-823后能够显著下调HIF-2α的基因表达,同时VEGF基因的表达也受到明显抑制.结论:缺氧可促使BGC-823细胞HIF-2α在蛋白水平表达升高,并通过激活VEGF的机制调控胃癌血管生成,切断HIF-2α途径可能会有效阻止胃癌血管生成.     

siRNA对胃癌AGS细胞中血管生成相关分子表达的影响

目的： 研究小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）抑制Rac1b表达后对胃癌AGS细胞血管生成相关分子表达的影响。 方法： 体外合成针对 Rac1b 基因的siRNA序列（ Rac1b siRNA）,脂质体法转染AGS细胞,RT-PCR和Western blotting观察 Rac1b siRNA 对AGS细胞 Rac1b mRNA和蛋白水平表达的影响,ELISA和Western blotting检测缺氧条件下转染 Rac1b siRNA后AGS细胞培养上清中VEGF表达水平以及细胞中血管生成相关分子P53、VHL和HIF-1α表达水平的变化。 结果： 测序证实体外合成的 Rac1b siRNA序列正确。 Rac1b siRNA转染AGS细胞后,可在mRNA和蛋白水平特异性抑制Rac1b的表达,对其同源分子Rac1的mRNA和蛋白表达水平无影响。 Rac1b siRNA可显著抑制AGS细胞培养上清中VEGF的分泌,这种抑制作用在缺氧情况下更为明显。同时, Rac1b siRNA在缺氧情况下可抑制AGS细胞内HIF-1α蛋白的表达、上调p53和VHL蛋白的表达。 结论： Rac1b siRNA可抑制胃癌AGS细胞中 Rac1b 在mRNA和蛋白水平的表达,可能通过调节血管生成相关分子HIF-1α、P53及VHL的表达抑制缺氧情况下AGS细胞VEGF的分泌。     

AP-4基因表达下调抑制子宫内膜癌细胞侵袭和迁移能力

目的:观察靶向抑制激活增强子结合蛋白-4(AP-4)基因的表达对子宫内膜癌细胞侵袭和迁移能力的影响。方法:用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测人子宫内膜癌细胞株HEC-1A、RL-952、HEC-1B、ishikawa中AP-4基因的表达水平。采用脂质体介导的细胞转染法将AP-4 siRNA转染至HEC-1A细胞,同时设置转染对照。转染48 h后,采用qRT-PCR和蛋白印迹法(Western blot)检测转染后各组HEC-1A细胞中AP-4的表达水平,通过细胞划痕实验观察转染后各组细胞迁移情况,采用Transwell实验检测转染后各组细胞侵袭能力。采用Western blot检测转染后各组细胞中上皮细胞标志分子E-钙粘蛋白(E-cadherin)和间充细胞标志分子N-钙粘素(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表达水平。结果:AP-1基因在四株子宫内膜癌细胞中均有表达,在HEC-1A细胞中相对表达水平最高(P<0.05),用于后续转染实验。qRT-PCR和Western blot结果均显示转染AP-4 siRNA能够成功抑制HEC-1A细胞中AP-1 mRNA和蛋白的表达(P<0.05)。Transwell实验显示转染AP-4 siRNA后HEC-1A细胞侵袭能力明显受到抑制(P<0.05)。划痕实验显示转染AP-4 siRNA后HEC-1A细胞迁移能力明显受到抑制(P<0.05)。Western blot结果显示转染AP-4 siRNA后HEC-1A细胞中N-cadherin和Vimentin蛋白水平降低,E-cadherin蛋白水平升高,抑制了上皮间质转化(EMT)过程(P<0.05)。结论:AP-4基因表达下调能够有效抑制子宫内膜癌细胞的侵袭和迁移能力,该过程可能与逆转细胞EMT过程有关。     

雷帕霉素对人淋巴瘤Raji细胞增殖、VEGF-A及HIF-1α表达的影响

目的:探讨雷帕霉素对人淋巴瘤细胞株Raji细胞体外增殖、VEGF-A及HIF-1α表达的影响及其临床意义.方法:不同浓度(0、10、50、100、250、500nmol/L)雷帕霉素对Raji细胞作用不同时间(24、48、72h)后,使用CCK8法检测细胞增殖的变化;采用蛋白质印记法(Western blot,WB)检测72h组不同浓度mTOR、VEGF-A、HIF-1α蛋白变化;采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测其mRNA的变化.结果:雷帕霉素对Raji细胞增殖具有显著抑制作用(P＜0.01);雷帕霉素处理72h后的Raji细胞,随着药物浓度增加,mTOR、VEGF-A和HIF-1 α蛋白明显减少(P＜0.01);雷帕霉素处理后的Raji细胞,随着药物浓度和作用时间的增加,mTOR、VEGF-A和HIF-1α的mRNA明显减少(P＜0.01);mTOR、VEGF-A及HIF-1α的mR-NA表达两两之间呈正相关性.结论:雷帕霉素通过mTOR通路,能明显抑制人淋巴瘤Raji细胞增殖过程,表现出明显的时间、剂量效应依赖关系;同时也可明显减少mTOR、VEGF-A、HIF-1α的mRNA的转录表达,减少p-mTOR、VEGF-A、HIF-1α等蛋白的翻译表达,从而抑制Raji细胞的生长及其血管新生.     

靶向沉默人类真核翻译延长因子1A2可抑制胰腺癌细胞BxPC-3体外迁移和侵袭

目的:探讨靶向沉默人类真核翻译延长因子1A2 (homo sapiens eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 2,EEF1A2)对胰腺癌BxPC-3细胞体外迁移和侵袭的影响及其可能的分子机制.方法:应用RT-PCR和蛋白质印迹法检测4种胰腺癌细胞株中EEF1A2的mRNA和蛋白表达水平.将EEF1A2-小干扰RNA (smallinterference RNA,siRNA)和阴性对照siRNA转染到BxPC-3细胞中,随后采用RT-PCR和蛋白质印迹法分别检测EEF1A2的mRNA及蛋白表达,应用体外划痕和Transwell侵袭实验分别检测BxPC-3细胞的体外迁移和侵袭能力,蛋白质印迹法检测转染前后细胞中p -Akt和总Akt蛋白的表达变化.结果:4种胰腺癌细胞株中除SW1990细胞呈EEF1A2低表达外,BxPC-3、Patu8988和Panc-1细胞均呈EEF1A2高表达.EEF1A2-siRNA转染BxPC-3细胞48 h后,EEF1A2 mRNA及蛋白表达水平较阴性对照siRNA转染的细胞和空白对照细胞明显降低(P＜0.01).EEF1A2-siRNA转染组BxPC-3细胞的体外迁移和侵袭能力明显低于阴性转染对照组和空白对照组(P＜0.05).EEF1A2-siRNA转染组细胞中Akt的磷酸化水平明显低于对照组细胞(P＜0.05),而总Akt蛋白表达水平未显著改变(P＞0.05).结论:siRNA干扰下调EEF1A2基因表达可明显抑制胰腺癌BxPC-3细胞的体外迁移和侵袭,其机制可能与EEF1A2调控Akt信号通路有关.     

NF-κBp65对人非霍奇金淋巴瘤细胞HIF-1α-VEGF途径调节及其机制的探讨

目的:研究NF-κB对人非霍奇金淋巴瘤(NHL)HIF-1α-VEGF途径的调控及其机制。方法:应用Echinomycin(EC)处理人NHL细胞,将HIF-1α反义质粒转染至肿瘤细胞中,采用蛋白质印迹法检测经两种方法处理后各细胞系中VEGF表达水平。以NF-κB特异性抑制剂quinazoline(QNZ)及Bay11-7082预处理人NHL细胞,检测各细胞系中HIF-1α蛋白的表达水平,同时采用实时定量PCR方法检测HIF-1αmRNA变化。应用QNZ处理NHL细胞后检测HIF-1α下游调控靶点VEGF的蛋白表达水平。结果:通过应用HIF-1α特异性抑制剂和转染反义质粒两种方法均能够抑制HIF-1α,明显下调了VEGF蛋白表达水平,与对照组相比差异均有统计学意义,P<0.05。NF-κB抑制剂QNZ及Bay11-7082能够降低NHL细胞HIF-1α蛋白及基因水平的表达,同时下调其下游调控靶点VEGF蛋白的表达,P<0.05。结论:抑制NF-κB可阻断人NHL细胞HIF-1α-VEGF通路,其机制可能与NF-κB调控HIF-1α的基因与蛋白表达有关。     

HIF干扰表达载体psilencer3.0-HIF-α siRNA的构建和鉴定

背景与目的：肾透明细胞癌是最常见的肾实质恶性肿瘤．生物学行为极为复杂，对放疗和化疗均不敏感。研究发现缺氧诱导因子HIF-α（和HIF-2α与肾透明细胞癌发生发展过程存在相关性．．本研究拟通过RNA干扰的方法构建psiletwer3．0-H1F-αsiRNA重组质粒，从而为进一步探讨HIF在肾细胞癌发生发展中的功能提供有效的工具。方法：设计并化学合成编码HIF-1α和HIF-2αsiRNA的DNA片段，通过基因重组的方法将其构建进siRNA的表达载体。采用实时定量PCR和Western blot检测构建成功的siRNA表达载体在mRNA及蛋白水平对目标基因表达的抑制。结果：786-0细胞转染psilem、er3．0-HIF-1αsiRNA和psilencer3．0-HIF-2α后，HIF-1α和HIF-2α的mRNA表达的抑制率分别达到r82．1％和87．4％；OS—RC-2细胞转染psilelwer3．0-HIF-1αsiRNA和psilencer3．0-HIF-2α后．抑制率分别达到了91．2％和81．2％。在786-0细胞和OS—RC-2细胞中转染HIF-1α干扰质粒和HIF-2α干扰质粒的实验组蛋白表达量较空白对照均有不同程度的减低、结论：构建成功的siRNA表达载体可以有效抑制目标基因HIF-1和HIF乏在mRNA硬蛋白水平的表达.     

干扰LOX表达对MDA-MB-231细胞侵袭迁移影响及其机制的探讨

目的:研究干扰赖氨酰氧化酶(LOX)基因表达对乳腺癌细胞MDA-MB-231体外侵袭迁移能力的影响,并探讨相关机制及意义。方法:设计合成特异性慢病毒干扰载体(LOX-RNAi-LV)转染MDA-MB-231细胞,实时定量PCR检测LOX mRNA和侵袭转移相关因子MMP-2、MMP-9和HIF-1α的mRNA表达,蛋白质印迹法检测LOX蛋白表达,细胞侵袭迁移实验(Transwell)检测细胞侵袭迁移能力。结果:转染LOX-RNAi-LV后,乳腺癌MDA-MB-231细胞LOXmRNA和蛋白表达水平明显降低,与空白组相比,抑制率分别为89.2%和82.97%。MMP-2(F=225.271,P=0.0000)、MMP-9(F=35.373,P=0.000 01)和低氧诱导因子HIF-1α(F=341.081,P=0.0000)的mRNA表达均明显降低。细胞侵袭迁移实验显示,干扰组穿过Transwell小室滤过膜的细胞数明显少于对照组(侵袭实验F=269.557,P=0.000 5;迁移实验F=164.321,P=0.000 3)。结论:转染LOX-RNAi-LV能有效地干扰LOX在乳腺癌细胞MDA-MB-231中表达,抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移能力,其作用机制可能与下调MMP-2、MMP-9和HIF-1α表达有关。     

钠氢交换蛋白1基因在体外对食管癌KYSE-70细胞增殖和侵袭作用的影响

目的:观察钠氢交换蛋白1(Na+/H-exchanger 1,NHE-1)基因对食管癌KYSE-70细胞增殖和侵袭能力的影响.方法:采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测NHE-1 mRNA及其蛋白在人食管癌EC-9706、KYSE-450、EC-1和KYSE-70细胞中的表达情况.将化学合成的靶向NHE-1的小干扰RNA (small interference RNA,si RNA)体外转染入KYSE-70细胞,实时荧光定量-PCR和蛋白质印迹法检测转染24、48和72 h后KYSE-70细胞中NHE-1 mRNA及其蛋白的表达,MTT和Boyden小室法检测KYSE-70细胞的增殖及侵袭能力.结果:NHE-1 mRNA及其蛋白在KYSE-70细胞中高表达.与阴性对照(转染阴性对照siRNA)及空白对照(未转染的KYSE-70细胞)组相比,靶向NHE-1的siRNA可抑制KYSE-70细胞中NHE-1 mRNA及其蛋白的表达,差异具有统计学意义(P＜0.05);与阴性对照组、空白对照组及NHE-1 siRNA转染24 h组比较,NHE-1 siRNA转染48和72 h后的KYSE-70细胞体外增殖能力和侵袭能力明显受到抑制,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:干扰NHE-1基因的表达可以抑制食管癌KYSE-70细胞的体外增殖和侵袭能力,NHE-1基因有望成为食管癌基因治疗的重要靶点.