分泌型血管内皮抑素重组腺病毒的构建及其在基因治疗载体肝干细胞中的表达

肝干细胞具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能,研究表明肝干细胞为良好的治疗载体细胞,广泛应用于生物型人工肝、肝细胞移植以及先天性代谢性肝病的基因治疗,而近年其在肝癌治疗中的潜力也备受关注.     

A mouse model for adenovirus gene delivery

The cellular attachment receptor for adenovirus (Ad), Coxsackie adenovirus receptor (CAR), required for delivery of Ad into primary cells, is not present on all cell types, thus restricting Ad-gene delivery systems. To circumvent this constrain, a transgenic mouse has been generated that expresses a truncated human CAR in all tissues analyzed. These mice allowed efficient in vitro infections at low multiplicities into lymphoid, myeloid, and endothelial cells. Furthermore, in vivo administration of Ad-vectors results in infection of macrophages, lymphocytes, and endothelial cells. In addition, tail vein injection resulted in targeting of virus into previously inaccessible areas, such as the lung and the capillaries of the brain. The CAR transgenic mice will be useful for rapid functional genomic analysis in vivo, for testing the efficacy of gene therapy procedures or as a source of easily transducible cells.     

重组人p53腺病毒经肝动脉灌注化疗治疗中晚期肝癌临床疗效观察

目的评价重组人p53腺病毒注射液经肝动脉灌注治疗中、晚期肝癌的疗效。方法选择我院2008年~2014年临床诊断的无手术指征或拒绝手术治疗的原发性肝癌患者72例,分为选择性肝动脉栓塞化疗术(TACE)和重组人p53腺病毒注射液(r Ad-p53)联合栓塞化疗治疗,每组36例。两组均每隔28天进行一次治疗,4次为1疗程。于完成疗程后1月,根据临床表现、肝脏CT及肝功能检查等指标进行疗效评价。结果 TACE组患者病情缓解(CR+PR)18例(50%),肝脏肿瘤病灶无完全消失(CR),明显缩小或病灶数量减少(PR)18例(50%),病情稳定(SD)2例(5.6%),病情进展(PD)16例(44.4%);联合治疗组患者病情缓解(CR+PR)25例(69.4%),症状好转,一般状况改善,Karuafsky评分明显提高(P0.05)。CR 2例(5.6%),PR 23例(63.8%),SD 2例(5.6%),PD 9例(25%);使用重组人p53腺病毒灌注治疗后不良反应轻微。结论应用重组人p53腺病毒注射液联合TACE治疗肝癌患者临床疗效优于单纯TACE治疗,值得在合适的肝癌患者中应用。     

腺病毒介导的胞嘧啶脱氨酶基因对小鼠肝癌的治疗

目的 探讨腺病毒介导的胞嘧啶脱氨酶基因对小鼠肝癌的基因治疗效果。方法 分离纯化ＡｄＣＤ,体外实验观察ＩＣ５０,旁观者效应及凋亡现象。在体内,ＡｄＣＤ瘤内注射并腹腔注射５ＦＣ,观察ＡｄＣＤ／５ＦＣ系统对肝瘤荷瘤小鼠的抗肿瘤效应。结果 当ＭＯＩ＝１００时,ＡｄＣＤ感染的ＭＭ４５Ｔ．Ｌｉ细胞对５ＦＣ敏感,ＩＣ５０〈５０μｍｏｌ／Ｌ。当ＡｄＣＤ感染的ＭＭ４５Ｔ．Ｌｉ细胞占１０％时,可有７２％细胞死亡,Ａｄ     

趋化因子Fractalkine对小鼠实验性肝癌的基因治疗

目的 通过将趋化因fFractalkine（FK）基因转染小鼠肝癌细胞株MM45T．Li，探讨FK用于诱导抗肝癌主动免疫的可行性。方法 用脂质体将小鼠FK基因导入小鼠肝癌细胞株MM45T．Li，G418筛选抗性克隆。逆转录聚合酶链反应检测FK的表达，体内实验观察野生型及FK基因修饰肿瘤细胞的致瘤性，组织病理学检测肿瘤中免疫细胞的浸润，流式细胞仪检测外周血中CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞水平。结果 逆转录聚合酶链反应检测发现G418筛选得到的转染FK的抗性克隆MM45T．Li-FK表达FK，而野生型MM45T．Li不表达FK。体内成瘤实验显示，与野生型瘤细胞相比，MM45T．Li-FK的成瘤率显著下降。MM45T．Li-FK所形成肿瘤中有明显的免疫细胞浸润，对照组肿瘤中免疫细胞的浸润较少。接种MM45T．Li-FK瘤细胞的小鼠，外周血中CD4、CD8^＋T淋巴细胞水平明显增高，与对照组相比差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论 转染FK皋因能促进机体的抗肝痛主动免疫反应。     

Hepatic gene therapy: adenovirus enhancement of receptor-mediated gene delivery and expression in primary hepatocytes.

We have combined a receptor-mediated DNA delivery system with the endosomal lysis ability of adenovirus and shown that DNA can be delivered into primary hepatocytes, resulting in a high level of gene expression. When asialoorosomucoid conjugated with poly(L-lysine) was used to deliver the Escherichia coli beta-galactosidase gene into primary hepatocytes through binding with the hepatic asialoglycoprotein receptor, only a low level of beta-galactosidase was detectable, with less than 0.1% of the hepatocytes being transfected. This level of activity can be greatly enhanced by the cointernalization of the DNA.protein complex with a replication-defective adenovirus, resulting in 100% of the hepatocytes staining blue with 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside. Quantitative analysis of beta-galactosidase expression also showed a 1000-fold enhancement of activity. To test the applicability of this DNA delivery system for the correction of phenylketonuria, a metabolic disorder that causes severe mental retardation in children, we have delivered the human phenylalanine hydroxylase (PAH) gene to hepatocytes derived from a PAH-deficient mouse strain and demonstrated complete reconstitution of enzymatic activity. This method shows great promise for efficient gene delivery to the liver for correction of hepatic disorders.     

Ad-p27mt转染重组腺病毒治疗裸鼠内人胃癌的分子机制

目的:研究Ad-p27mt转染重组腺病毒对人胃癌细胞凋亡的作用及机制.方法:Ad-p27mt转染重组腺病毒导入胃癌细胞株SGC-7901内;流式细胞仪检测凋亡染色体亚二倍体峰值,了解Ad-p27mt对人胃癌组织凋亡的作用;TUNEL法检测DNA片断,在Ad-p27mt组和Ad-LacZ组中分析细胞的凋亡.结果:Ad-p27mt成功转入人胃癌细胞SGC-7901内,转化率达100%.流式细胞仪检测发现在感染后18h出现G1-S相前出现凋亡染色体亚二倍体峰值,并且DNA电泳出现凋亡特征性的条带;TUNEL法检测Ad-p27治疗组与对照组的凋亡率分别是92.3%±3.76%和2.01%±0.15%,两组的差异有显著性(P<0.01).结论:重组腺病毒转染的人p27突变基因能诱导裸鼠体内人胃癌细胞SGC-7901的凋亡.     

Tet-Off诱导的硫氧还蛋白基因重组腺病毒载体的构建

目的 克隆人硫氧还蛋白(hTRX)基因,并构建含有该目的 基因的重组腺病毒载体.方法 用内切酶从重组质粒pGEM-TEasy/TRX上切下全长TRXcDNA片段,与穿梭质粒pshuttle2连接,形成pshuttle2-TRX重组质粒,再双酶切pshuttle2-TRX,将带有CMV启动子的目的 片段,插入Tet-Off诱导的Adeno-X病毒DNA中,用PCR、双酶切方法进行鉴定.结果 对pGEM-TEasy/TRX重组质粒进行序列测定,测定结果与GeneBank序列J04026基本一致,其中包括TRXcDNA全长.该实验构建出含TRX的穿梭质粒pshuttle2-TRX,并成功获得Tet-Off诱导的重组腺病毒载体pAdCMV-TRX.结论 TRX基因的克隆及其重组腺病毒载体pAdCMV-TRX的成功构建,为进一步研究TRX生物活性及发病与氧化损伤关系密切的疾病治疗提供新的手段,如病毒性心肌炎、动脉硬化、心肌病、糖尿病、Alzheimers病等.     

蜂毒素基因重组腺病毒抗肝癌作用的实验研究

目的将编码蜂毒素的基因用于肝癌治疗,为蜂毒素的临床应用提供实验依据.方法采用细菌内同源重组法构建携蜂毒素基因及甲胎蛋白(AFP)启动子的重组腺病毒,X-gal染色检测其转染效率,MTT法测定其对肝癌细胞的抑制作用,并观察其体外转染对肝癌细胞致瘤能力的影响及肿瘤内注射对荷肝癌裸鼠的抑瘤效果.结果蜂毒素基因mRNA在细胞中得到了转录;当感染复数(MOI)为10时,重组腺病毒在体外对BEL-7402人肝癌细胞的转染效率达到100%,体内转染亦有较高的效率.Ad-rAFP-Mel和Ad-rAFP对BEL7402细胞的抑制率分别为66.2%±2.7%和2.9%± 2.3%(t=30.83,P<0.01).Ad-CMV Mel对BEL7402、SMMC7721及L02细胞的抑制率分别为58.9%± 9.6%、65.9%±3.8%和31.7%± 1.2%,而Ad-rAFP-Mel对BEL7402、SMMC7721及L02细胞的抑制率分别为66.2%±2.7%、16.1%±6.6%和7.5%±3.3%,与Ad-CMV-Mel组比较t=1.27,P=0.27,t=11.31、P<0.01和t=12.12、P<0.01.重组腺病毒体外转染后,肝癌细胞致瘤能力减弱,肿瘤内注射,裸鼠皮下移植瘤消退. 结论蜂毒素基因重组腺病毒在体内外对肝癌均有特异性抑制作用,证明动物毒素基因作为抗肿瘤目的基因具有可行性.     

巨噬细胞炎症蛋白-1α对小鼠肝癌的基因治疗

目的　观察重组腺病毒载体介导的小鼠巨噬细胞炎症蛋白 1α(MIP 1α)对小鼠肝癌的基因治疗效果。方法　携带小鼠MIP 1α基因的腺病毒载体 (AdmMIP 1α)体外感染小鼠肝癌细胞株Hepa1 6 。 48h后 ,用载体自身报告基因表达的绿色荧光蛋白检测感染效率 ;RT PCR法检测感染后细胞内MIP 1α的表达 ;每天计数细胞 ,观察细胞的体外生长曲线。皮下接种Hepa1 6细胞建立小鼠肝癌模型 ,肿瘤局部分别单次注射 1× 10 9cfu的AdmMIP 1α、空载体对照 (Ad empty)和PBS ,观察肿瘤大小和小鼠生存期。结果　腺病毒载体AdmMIP 1α体外能有效地感染靶细胞Hepa1 6 ,并在感染后的细胞内检测到mMIP 1α的mRNA ,体外感染对Hepa1 6的生长曲线无显著影响。瘤体内单次注射AdmMIP 1α导致 4/ 9只小鼠肿瘤完全消退 ,并延长小鼠生存期 ,与对照组比较 ,差异有显著性 (P <0 .0 0 1)。结论　腺病毒介导的MIP 1α基因治疗对小鼠肝癌有一定的效果 ,可能成为肝癌基因治疗的候选方案     

携带人Endostatin基因的腺病毒治疗胰腺癌移植瘤

目的 观察携带人Endostatin基因的重组腺病毒载体Ad-hEnd对裸鼠胰腺癌移植瘤的治疗作用.方法 将胰腺癌细胞株SW1990细胞皮下注射建立裸鼠移植瘤模型,随机分为Ad-hEnd组、报告基因LacZ重组腺病毒组(Ad-LacZ组)和对照组,每组8只.重组腺病毒200 μl瘤内注射,隔日1次,共4次.观察移植瘤的生长情况,免疫组化染色检测血管内皮生长因子(VEGF)的表达和微血管密度(MVD),原位缺口末端标记法(TUNEL)检测肿瘤细胞凋亡.结果 移植瘤成瘤率100%.治疗后4周,Ad-hEnd组、Ad-LacZ组和对照组移植瘤体积分别为(921.9±279.7)mm3、(2804.4±553.5)mm3和(3040.6±487.6)mm3;瘤重分别为(1.19±0.18)g、(2.38±0.42)g和(2.41±0.47)g;VEGF表达阳性率分别为(36.3±7.1)%、(81.2±6.6)%和(79.4±6.2)%;MVD分别为12±4、27±5和25±6;细胞凋亡率分别为(31.2±5.4)%、(9.4±4.9)%和(8.5±3.7)%.与Ad-LacZ组和对照组比较,Ad-hEnd组以上各项指标均有显著性差异(P＜0.01);Ad-LacZ组和对照组之间的差异无统计学意义.结论 重组腺病毒介导的hEndostatin基因可抑制胰腺癌的生长和血管生成,促进肿瘤细胞凋亡,可用于胰腺癌抗血管生成的基因治疗.     

人血管生成素相关蛋白2重组腺病毒制备

目的构建并鉴定血管生成素相关蛋白2基因(ARP2)重组腺病毒,为有关基因转染研究作准备。方法第二军医大学长海医院心脏内科2004-12~2005-10将ARP2目的基因经酶切插入pAxCAwt载体,构建成ARP2-pAxCAwt重组黏粒。脂质体转染人胚肾细胞(293)细胞获取重组腺病毒。结果ARP2-pAx-CAwt重组黏粒插入方向正确,所获腺病毒为复制缺陷型ARP2重组腺病毒。结论采用的黏粒构建、转染方法可行,所获重组腺病毒可靠。     

嗜肝细胞腺相关病毒载体的构建

HBV具有天然嗜肝性,其中由HBVpreS1基因编码的前S1(PreS1)抗原位于病毒外壳表面,是HBV嗜肝性的主要分子机制[1].重组腺相关病毒(rAAV)是目前常用的基因治疗载体.我们以腺相关病毒载体系统为基础,用PreS1的编码基因HBVpreS1替代腺相关病毒载体系统的Cap基因,构建出以PreS1为衣壳的重组腺相关病毒载体(rA AVHBVpreS1),旨在探索构建肝病基因治疗特异性载体,为肝病靶向基因治疗提供实验研究基础.     

嗜肝细胞腺相关病毒载体的构建

HBV具有天然嗜肝性,其中由HBVpreS1基因编码的前S1(PreS1)抗原位于病毒外壳表面,是HBV嗜肝性的主要分子机制[1].重组腺相关病毒(rAAV)是目前常用的基因治疗载体.我们以腺相关病毒载体系统为基础,用PreS1的编码基因HBVpreS1替代腺相关病毒载体系统的Cap基因,构建出以PreS1为衣壳的重组腺相关病毒载体(rA AVHBVpreS1),旨在探索构建肝病基因治疗特异性载体,为肝病靶向基因治疗提供实验研究基础.