let-7与尤文肉瘤关系的研究进展

尤文肉瘤是儿童及青少年最为常见的恶性骨肿瘤之一,也是尤文肉瘤家族肿瘤(Ewing's sarcoma family of tumors,ESFT)中的重要一员.好发于四肢长骨的骨干,以股骨、胫骨及肱骨最多见,少数发生在干骺端及骨骺.儿童及青少年时期是发病的高峰期,早期症状主要是病变局部的疼痛和肿胀,该病具有恶性程度高、病程短、转移率高、复发快的特点.随着现代诊疗技术的进步,病灶较小的患者,其生存率虽然可以达到70％左右,但高达30％的复发率仍然制约了治疗效果[1],如何进一步提高疗效是目前亟待解决的问题.肿瘤的生物治疗是目前研究的热点,了解尤文肉瘤的发生、发展机制是生物治疗有效实施的前提.let-7是microRNA (miRNA)中的一个大家族,在哺乳动物的细胞分化过程中发挥重要的作用,且具有高度保守性.有研究[2]发现,let-7在多种肿瘤组织中出现不同程度的表达降低,且与肿瘤的恶性生物学特性密切相关,参与调控肿瘤的发生、发展.本文就let-7与尤文肉瘤相关性的研究进展作一综述.     

Let-7a microRNA沉默c-myc基因对人乳腺癌MCF-7细胞生长抑制作用

目的：研究let-7a对体外生长的人乳腺癌MCF-7细胞株的抑制作用,并利用分子生物学实验探索其可能的作用机制。方法：用LipofectamineTM2000介导的let-7a和阴性对照siRNA转染人乳腺癌细胞株MCF-7,半定量RT-PCR检测各组细胞c-myc mRNA表达;Western blot测定转染24h后蛋白的表达水平; CCK-8检测细胞增殖和凋亡。结果: 细胞转染后,let-7a转染组的c-myc mRNA表达水平明显低于脂质体对照组和阴性siRNA转染组（0.586±0.032 vs 0.934±0.029,0.825±0.004,P<0.01);在MCF-7细胞中存在分子量62kD的特异性条带,与c-myc分子量相符,let-7a在PVDF膜上的特异性条带明显弱于对照组; let-7a对细胞增殖具有一定的抑制作用(P<0.05),且该抑制作用具有时间和浓度的依赖性;转染24h后,let-7a组的细胞凋亡率高于对照组(P<0.05)。结论： LipofectamineTM2000介导的let-7a可以通过抑制c-myc的基因表达,对体外生长的人乳腺癌MCF-7细胞的增殖进行抑制。     

Let-7a负性调控肺癌A549细胞中NIRF基因的表达

目的：探讨肺癌A549细胞中let-7a对其靶基因NIRF表达的调控作用.方法：运用生物信息学方法对let-7a进行靶基因预测并分析其靶基因NIRF;构建含有NIRF 3′UTR全长的荧光素酶报告质粒pRL-TK-NIRF 3′UTR;将pRL-TK或pRL-TK-NIRF 3′UTR与pGL3-control,及let-7a mimics或control mimics共转染A549细胞,双荧光素酶报告系统检测试剂盒测定转染后A549细胞中荧光素酶的表达;A549细胞分别转染let-7a mimics和control mimics,Western Blot检测NIRF蛋白的表达.结果：NIRF3′UTR含有一个let-7a结合位点,而且该结合位点在多个物种高度保守;经测序证实荧光素酶报告质粒pRL-TK-NIRF 3′UTR构建成功;共转染let-7amimics,pRL-TK-NIRF3′UTR与pGL3-control的A549细胞组,荧光素酶活性明显降低（P〈0.01）,为对照组（共转染pRL-TK与pGL3-control的A549细胞组）的50%;Western Blot检测显示,与未转染的A549细胞相比,转染let-7a mimics的A549细胞中NIRF蛋白的表达显著降低（P〈0.01）,而转染control mimics的A549细胞中NIRF表达无明显变化（P〉0.05）.结论：肺癌A549细胞中,let-7a可以结合到NIRF 3′UTR,负性调控NIRF的表达.     

尤文肉瘤细胞凋亡及p15表达的研究

通过对尤文肉瘤细胞凋亡指数及相关调控基因表达产物p15蛋白的检测,了解其在尤文肉瘤中的表达水平,并初步探讨其临床及生物学意义.     

髂骨尤文肉瘤的MRI诊断

目的:分析髂骨尤文肉瘤的MRI表现及其诊断价值,以期提高对其的认识。方法:回顾性分析经病理证实的6例髂骨尤文肉瘤MRI表现,并复习文献所见。结果:6例中5例位于髂骨翼,1例位于髂骨体部。同侧骶髂关节和髋关节未见受侵。5例局部有溶骨性骨质破坏,1例髓腔硬化明显。骨皮质部分消失破坏,边缘毛糙。1例有针状骨膜反应。在病变髂骨前后均见巨大软组织肿块包绕,6例软组织肿块中均可见线样低信号间隔。结论:髂骨尤文肉瘤MRI表现缺乏特征性,但当髓腔和骨皮质出现广泛的溶骨性破坏,同时又有针状骨膜反应及具有低信号间隔的软组织肿块,结合年龄和发病部位,应考虑到本病可能。MRI可敏感、确切地显示肿瘤对骨内、骨外侵犯的范围及其与邻近组织器官的关系,但显示钙化和骨膜反应不如平片和CT。     

let-7a1和let-7c在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

目的:探讨人类微小RNA let-7a1和let-7c在肺癌组织中的表达及与临床病理特征之间的关系.方法:收集53例肺组织手术标本及临床资料,其中包括肺癌组织44例(收集其癌组织和癌旁正常组织)和良性肺疾病组织9例.并收集病人吸烟史、肿瘤TNM分期、病理分化程度及有无淋巴结转移等.采用Trizol法提取总RNA,采用荧...     

一例终末期儿童尤文肉瘤的护理

骨肉瘤、软骨肉瘤和尤文肉瘤是最常见的三种原发恶性骨肿瘤。尤文肉瘤多发生于5～20岁,是一种起源于神经外胚层细胞的恶性小圆细胞肿瘤,多发于椎旁、四肢、腹膜后、躯干等不同的部位,恶性程度及侵袭性较高,20%～30%的尤文肉瘤发现时已远处转移,如肺转移和骨骼转移。主要治疗方法为局部手术切除、化学治疗、放射治疗,复发、难治性尤文肉瘤治疗效果差。某医院科室收治一例儿童尤文肉瘤,随着疾病的不断恶化,出现了肿瘤并发症,但在医护团队的精心医治和照护下,患者顺利、安详度过了生命的最后阶段。     

携带尤文肉瘤EWS-FLI-1结合序列的DTA表达载体构建及其对尤文肉瘤细胞杀伤作用的研究

目的研究尤文氏肉瘤EWS-FLI-1融合蛋白的特异结合序列与DTA基因融合后的表达及对尤文肉瘤细胞的杀伤作用,为肿瘤基因治疗探索新的治疗方法.方法构建含有EWS-FLI-1特异结合序列和白喉毒素A链基因的表达载体pS2-DTA.转染尤文肉瘤细胞以及对照细胞后检测DTA表达及其对细胞的杀伤作用.结果表达载体pS2-DTA在尤文肉瘤细胞系中高表达并产生强烈的杀伤作用.结论 pS2-DTA可以对尤文肉瘤细胞产生选择性杀伤作用,抑制其生长,对尤文肉瘤的治疗有潜在的应用价值.     

Flavopiridol抑制尤文肉瘤WE-68细胞增殖的实验研究

目的以人尤文肉瘤细胞系WE-68为实验对象，探讨flavopiridol在体内外抑制尤文肉瘤细胞增殖的机制。方法MTT法观察生长抑制效应；流式细胞术及DNA凝胶电泳检测细胞凋亡；western免疫印迹法测定bcl-2、bcl-xl、bax和mcl-1基因的表达。建立WE-68细胞裸鼠皮下移植瘤模型，观察肿瘤的生长情况，肿瘤标本石蜡切片。TUNEL染色法检测体内肿瘤细胞的凋亡诱导情况。结果flavopiridol可显著抑制WE-68细胞增殖。且剂量-效应，时间-效应关系。WE-68细胞经flavopiridol处理后可发生凋亡。Flavopiridol能显著下调mcl-1的表达。但对bcl-2、bcl-xl和XIAP表达无影响。结论flavopiridol在体内外可显著抑制尤文肉瘤WE-68细胞生长并诱导凋亡，其机制可能与降低mcl-1蛋白表达有关。     

miRNA let-7a靶向抑制ACVR1B表达

目的：探讨miRNA let-7a对ACVR1B表达的影响。方法：生物信息学分析表明activin receptor type 1B（ACVR1B）是一个let-7a的潜在靶基因。构建ACVR1B 3’UTR野生型（ACVR1B 3’UTR-WT）和ACVR1B 3’UTR突变型（ACVR1B 3’UTR-MUT）双荧光素酶报告载体,分别与let-7a模拟物（let-7a mimic）或let-7a阴性对照（let-7a NC）共同转染HEK293T细胞,通过双荧光素酶报告系统检测各组细胞的荧光素酶活性。分别转染let-7a mimic、let-7a inhibitor和let-7a NC至HEK293T细胞,采用qRT-PCR和Western blot分别检测ACVR1B的mRNA和蛋白表达水平。结果：ACVR1B 3’UTR含有let-7a潜在的高度保守的结合靶点（77～83位点）。在HEK293T细胞中共转染ACVR1B 3’UTR-WT报告载体的let-7a mimic组比let-7a NC组荧光素酶活性组明显降低（P＜0.05）;而共转染ACVR1B 3’UTR-MUT报告载体的let-7a mimic与let-7a NC组其荧光素酶活性差异无统计学意义（P＞0.05）。在HEK293T细胞中let-7a mimic转染组中ACVR1B的mRNA和蛋白水平均低于let-7a NC组和let-7a inhibitor组（P＜0.05）。结论：ACVR1B是let-7a潜在调控的靶基因,miRNA let-7a可以直接抑制HEK293T细胞中ACVR1B基因的表达。     

尤文肉瘤EWS-FLI1基因原核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建尤文肉瘤EWS-FLI1基因原核表达质粒.方法:从人尤文肉瘤A673细胞中提取总RNA,以RT-PCR法扩增EWS-FLI1基因序列,目的基因两侧引入Sac Ⅰ和HindⅢ酶切位点,克隆至pMD18-T载体中,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆作PCR鉴定、酶切鉴定及测序鉴定.再将EWS-FLI1基因亚克隆至原核表达载体pQE30中,构建重组原核表达质粒pQE30-EWS-FLI1,酶切及测序鉴定.所构建的重组质粒转化JM109,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE电泳后转印到NC膜上,进行Western blot鉴定.结果:PCR结果显示扩增片段大小约为1.5 kb,双酶切鉴定目的基因片段大小约为1.5 kb,阳性克隆测序结果显示目的基因序列与预期相同.所构建重组质粒在大肠杆菌中表达出与预期大小相符的54 kD蛋白,经鉴定系EWS-FLI1蛋白.结论:成功构建了pQE30-EWS-FLI1,并进行了原核表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

骨外尤文氏肉瘤1例并文献复习

探讨骨外尤文氏肉瘤的临床、诊疗及预后特点,结合文献分析1例盆腔骨外尤文肉瘤的临床资料。结果,盆腔骨外尤文肉瘤属软组织恶性小圆细胞性肿瘤,早期诊断困难,诊断主要依靠病理组织学及免疫组化。其恶性程度高,转移率高,预后不佳。综合治疗可以提高5年生存率。     

LAG3慢病毒质粒构建及其稳定转染细胞系的建立

目的:构建淋巴细胞活化因子3(LAG3)-mCherry红色荧光蛋白的LAG3-mCherry慢病毒表达载体,转染HEK293T细胞获得稳定表达LAG3-mCherry融合蛋白的细胞系,探讨LAG3-mCherry融合蛋白在HEK293T细胞中的定位.方法:将LAG3质粒和带有mCherry的慢病毒载体分别用限制性内切...     

尤文肉瘤P_(15)基因蛋白的表达研究

目的 :研究尤文肉瘤P15 的表达的情况 ,并初步探讨其临床及生物学意义。方法 :免疫组化方法检测了 1 2例尤文肉瘤中P15 的表达情况 ,并统计其阳性反应率。结果 :本组病例中P15 呈阳性反应 9例 ,阳性率 75 %。结论 :尤文肉瘤组织中P15 基因表达有一定缺失率 ,与肿瘤的预后相关     

尤文肉瘤分子病理学诊断与治疗的研究新进展

尤文肉瘤是以平衡染色体易位和新融合基因形成为特征的一种发育性肿瘤,尽管近几年尤文肉瘤分子生物学研究取得一定进展,但是由于缺乏合适的动物模型以及样品获得所需资源,导致进展有限。本文拟通过对近几年文献报道的回顾,尤其针对尤文肉瘤分子病理学和靶向治疗这两个方面进行重点总结和归纳,以期对该疾病的诊疗实践提供一定的理论支持。     

EWS-FLI1通过代谢重编程对尤文肉瘤发生发展影响的研究进展

近年来尤文肉瘤的发病率逐年升高,该病恶性程度极高,患者病程短,转移事件发生快,严重危害儿童和青少年的健康。不同于正常组织,肿瘤细胞通过一系列复杂的调控机制促进包括糖、氨基酸、脂类等在内的营养物质发生代谢重编程,进而维持肿瘤高代谢状态,促进肿瘤发生发展。同时代谢重编程相关产物可作用于肿瘤微环境各细胞组分,进而抗肿瘤免疫反应,甚至诱导耐药事件的发生。EWS-FLI1融合蛋白在尤文肉瘤中作为关键的促癌分子具有多重功能和复杂的调控机制,了解EWS-FLI1影响尤文肉瘤细胞具体代谢变化及其相关调控机制,可为探究尤文肉瘤的病因和寻找有效的诊疗标志物及治疗策略提供线索。本文就EWS-FLI1尤文肉瘤代谢重编程相关研究进展进行汇总与剖析,旨在为该疾病的早期诊断和精准治疗提供新的参考。     

microRNA let-7a对人晶状体上皮细胞凋亡的调控及其在白内障中的作用

目的 探讨micro RNA let-7a对人晶状体上皮细胞凋亡的调控作用及其在白内障中的作用。方法 利用Real time q-PCR方法,检测年龄相关性白内障患者晶状体前囊膜和正常人眼晶状体前囊膜、人晶状体上皮细胞凋亡模型和正常人晶状体上皮细胞系let-7a的表达情况;利用Lipofectamine 2000瞬时转染let-7a mimic和let-7a inhibitor,分别上调和下调人晶状体上皮细胞中let-7a的表达,并利用Real time q-PCR方法验证转染效率,利用流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化。结果 年龄相关性白内障患者晶状体前囊膜组let-7a的表达显著低于正常对照组;人晶状体上皮细胞凋亡模型组let-7a的表达显著低于正常对照组;let-7a mimic转染组let-7a的表达显著高于对照组,let-7a inhibitor转染组let-7a的表达显著低于对照组;let-7a mimic转染组细胞凋亡率显著低于对照组,let-7a inhibitor转染组细胞凋亡率显著高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论 micro RNA let-7a能够调控人晶状体上皮细胞凋亡,从而在白内障发病过程中发挥重要作用,micro RNA let-7a可能成为白内障非手术治疗的新靶点。     

骨外尤文氏肉瘤临床与病理分析

目的探讨骨外尤文氏肉瘤的临床病理特点及其诊断鉴别诊断。方法通过组织学、特殊染色、免疫组织化学观察骨外尤文氏肉瘤。结果肿瘤由大小和形态较一致的小圆形细胞排列成片块状或分叶状，也可因肿瘤细胞坏死。形成假菊彤团结构。免疫组织化学：VIM、S-100阳性；NSE、NF部分细胞弱阳性；EMA、CEA、LCA、L26及MYO标记阴性。结论骨外尤文氏肉瘤是一种少见的软组织恶性小细胞性肿瘤，恶性度高，转移率高，早期便可经血道至肺或其他脏器，预后差。     

慢病毒介导的过表达载脂蛋白A1宫颈癌稳定细胞系建立的实验研究

目的采用慢病毒载体构建稳定过表达载脂蛋白A1(apolipoprotein A1, ApoA1)基因的SIHA、HELA细胞系,为研究ApoA1在宫颈癌中的作用机制奠定基础。方法构建过表达ApoA1基因的慢病毒载体,感染SIHA、HELA细胞并进行嘌呤霉素抗性筛选,构建稳定过表达ApoA1基因的SIHA、HELA细胞系,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot方法检测ApoA1 mRNA和蛋白的表达水平。结果 RT-qPCR显示SIHA及HELA细胞转染组中ApoA1mRNA表达量较阴性对照组明显提高(P <0.01),Western blot提示ApoA1蛋白在SIHA及HELA细胞中低表达,转染组ApoA1蛋白水平的表达明显高于对照组。结论成功构建稳定过表达ApoA1基因的宫颈癌SIHA、HELA细胞系。