共济失调-毛细血管扩张症致病基因RNA干扰对胶质瘤细胞放射敏感性的影响

目的:观察共济失调-毛细血管扩张症致病基因(ATM基因)的RNA干扰对胶质瘤细胞放射敏感性的影响.方法:选择ATM基因不同区域的DNA序列合成并纯化寡核苷酸后转染人胚胎肾脏细胞HEK293,根据对ATM蛋白不同的阻断效应,筛选用于制备ATM发夹结构short hairpin structure(shRNA)基因的最佳序列.将有效序列克隆入pSilencer 1.0-U6载体中,构建出shRNA的表达质粒并转染恶性胶质瘤细胞系U87细胞.以U87细胞为对照,应用Western blot检测细胞中ATM基因的表达;以细胞存活分数(SF)来评估放射敏感性.结果:Western blot显示shRNA介导的ATM基因沉默能明显阻断U87细胞中的ATM蛋白;与U87细胞相比,U87 shRNA细胞SF明显降低,P＜0.05.结论:由ATM shRNA构建的表达质粒能明显抑制ATM表达,增加胶质瘤细胞的放射敏感性.     

shRNA沉默Survivin基因对胶质瘤细胞U87生物学行为影响的研究

目的 观察短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)沉默Survivin基因对人脑胶质瘤细胞U87增殖、凋亡等生物学特性的影响.方法 通过脂质体LipofectamineTM 2000对胶质瘤细胞株U87转染Survivin shRNA干扰质粒(Suvrivin shRNA-i),以及对照无意义质粒(Suvrivin shRNA-nonsense),应用RT-PCR、Western blot检测转染前后Survivin mRNA和蛋白表达,流式细胞术测定各组细胞的细胞周期及TUNEL测定细胞凋亡形态.结果 转染Survivin shRNA-i组的Survivin mRNA及蛋白表达水平显著低于对照组(P＜0.05).与对照组相比较,转染Survivin shRNA-i后细胞周期G2/M期阻滞显著,细胞凋亡率升高(P＜0.05).结论 靶向Survivin基因的特异性shRNA能够阻制U87细胞的生长并诱导其凋亡.     

SIRT1基因shRNA慢病毒载体的构建及其对乳腺癌细胞增殖的影响

目的：探讨慢病毒介导沉默信息调节因子1（silent information regulator 1,SIRT1）基因的 shRNA对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响。方法：设计、合成2对针对SIRT1基因shRNA的寡核苷酸序列,与pLentilox3.7-GFP载体连接产生重组慢病毒质粒pshSIRT1-1、pshSIRT1-2,同时构建不针对任何基因的shRNA阴性对照pshCont。将表达shRNA的载体plentilox3.7与pLP1、pLP2和pLP/VSVG 3种质粒共转染293FT细胞,包装产生慢病毒并测定病毒滴度。将慢病毒感染人乳腺癌细胞MCF-7,行real time-PCR和Western blot验证SIRT1基因的沉默效果,台盼蓝排斥实验和流式细胞仪分别检测其对MCF-7细胞增殖和凋亡的影响。结果：成功构建靶向SIRT1基因shRNA慢病毒载体并获得了相应的慢病毒。2个靶向 SIRT1的shRNA均能有效抑制SIRT1基因的表达（P=0.000 2）,并使MCF-7细胞增殖明显减慢,凋亡明显增加（P=0.006 0）。结论：靶向SIRT1基因RNA干扰能显著抑制 MCF-7 细胞的生长并促进其凋亡。     

shRNA 沉默YAP基因对人肾癌786-O细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨慢病毒干扰载体沉默Yes-相关蛋白（Yes-associated protein,YAP）对人肾癌786-O细胞增殖和凋亡的影响。方法：用细胞免疫荧光法检测肾癌786-O细胞中YAP蛋白表达情况;构建针对YAP基因的shRNA慢病毒干扰载体转染786-O细胞。RT-PCR和Western blot分别检测干扰786-O细胞前后 YAP mRNA及蛋白的表达情况;CCK-8（cell counting kit-8）法检测沉默YAP后细胞增殖的改变;流式细胞仪（flow cytometry,FCM）检测细胞凋亡和周期的变化。结果：786-O细胞中YAP蛋白表达于细胞浆和细胞核;shRNA-YAP慢病毒干扰载体转染4 d后,可明显下调786-O细胞YAP mRNA及蛋白表达水平（P=0.000）,并且明显抑制细胞增殖和促进细胞凋亡（P=0.000）;细胞周期紊乱,G1 期细胞明显增加,S期细胞明显降低（P=0.000）。结论：YAP-shRNA慢病毒干扰载体能有效抑制YAP基因在786-O细胞中表达,进而抑制细胞增殖并促进细胞凋亡。     

BC200通过介导脑胶质瘤细胞干性的维持抑制替莫唑胺的促凋亡作用

目的：探讨血清长链非编码RNA BC200在脑胶质瘤干细胞（GSCs）中的作用及相关作用机制。方法：神经干细胞培养液培养脑胶质瘤U87 MG细胞,并提取成球生长的GSCs;采用免疫荧光法检测GSCs干细胞标志性分子CD133和Nestin;小分子RNA（siRNA）转染沉默GSCs中BC200表达;替莫唑胺（TMZ）200 μmol·L-1处理GSCs 24 h,光镜下观察TMZ对GSCs悬浮细胞球形态的影响;采用Western blot方法检测CD133、Bax、Bcl-2和cleaved caspase-3的表达变化。结果：分离提取的GSCs球状生长,细胞球表面CD133和Nestin呈阳性表达。TMZ处理GSCs 24 h,GSCs成球能力略微下降,未见细胞球状状态明显离散,Bax、cleaved cas-pase-3、Bcl-2未有明显变化（均P＞0.05）。沉默BC200后GSCs CD133表达显著下降（P＜0.05）。BC200沉默后,TMZ处理GSCs发现其成球能力明显减弱、细胞分散;cleaved caspase-3和Bax分别上调（45.36%±4.25%）和（63.23%±5.12%）,Bcl-2下调（31.22%±3.80%）,均P＜0.01。结论：BC200能够维持脑胶质瘤U87 MG细胞的干性,该效应可促进细胞对TMZ诱导凋亡的抵抗。     

沉默ZEB1基因对胶质瘤U87细胞上皮-间质转化的影响

目的：探讨沉默锌指E盒结合同源框1（ZEB1）基因对胶质瘤U87细胞间质标志物表达和细胞迁移的作用,阐明ZEB1对胶质瘤细胞上皮-间质转化（EMT）的影响。方法：将构建的ZEB1短发夹RNA（shRNA）干扰质粒（shZEB1#1和shZEB1#2）和对照质粒（shCtrl）转染至胶质瘤U87细胞,Western blotting法检测干扰效果。将胶质瘤U87细胞分为对照组（转染shCtrl的胶质瘤U87细胞）、EMT组[转染shCtrl的胶质瘤U87细胞用转化生长因子β1（TGF-β1）诱导EMT]和ZEB1基因沉默组（转染shZEB1的胶质瘤U87细胞用TGF-β1诱导EMT）。Western blotting法检测各组细胞中间质标志物（N-钙黏蛋白和波形蛋白）及基质金属蛋白酶9（MMP-9）的蛋白表达水平,划痕愈合实验检测各组细胞的迁移率。结果： Western blotting法检测,转染shZEB1#1和shZEB1#2的胶质瘤U87细胞中ZEB1蛋白表达水平较转染shCtrl的细胞明显降低（P<0.05或P<0.01）,shZEB1#2对ZEB1表达的抑制效果更明显,表明ZEB1已稳定转染到U87细胞。与对照组比较,EMT组胶质瘤U87细胞中N-钙黏蛋白、波形蛋白和MMP-9蛋白表达水平均明显升高（P<0.05或P<0.01）;与EMT组比较,ZEB1基因沉默组N-钙黏蛋白、波形蛋白和MMP-9蛋白表达水平明显降低（P<0.05或P<0.01）。EMT组细胞迁移率明显高于对照组（P<0.01）,而ZEB1基因沉默组细胞迁移率明显低于EMT组（P<0.01）。结论：沉默ZEB1基因表达可抑制胶质瘤U87细胞EMT,并降低细胞迁移能力,提示ZEB1可作为侵袭性胶质瘤治疗的重要靶标。     

肿瘤坏死因子α诱导蛋白2对非小细胞肺癌细胞株H1299的增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响

目的：观察肿瘤坏死因子α诱导蛋白2（TNF-α-induced protein 2,TNFAIP2）在非小细胞肺癌（non-small cell lung can－cer,NSCLC）中的表达以及对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响。方法：RT-PCR检测NSCLC中TNFAIP2 mRNA表达情况;免疫组化检测NSCLC中TNFAIP2蛋白表达情况。构建TNFAIP2基因短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）干扰慢病毒载体（shRNA-TNFAIP2）和阴性对照慢病毒载体（shRNA-NC）分别感染H1299细胞后采用RT-PCR和Western blot检测感染效率。用Transwell实验检测细胞的迁移、侵袭能力;用CCK-8检测细胞的增殖能力;用流式细胞术检测细胞的凋亡能力;用Western blot检测细胞蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表达的变化。结果：TNFAIP2 mRNA和蛋白质在NSCLC癌组织中的表达明显高于癌旁组织中的表达。慢病毒下调TNFAIP2表达后,shRNA-TNFAIP2组细胞迁移数（170±11）较shRNA-NC组（329±31）明显减少（P=0.001）;侵袭细胞数（75±10）较shRNA-NC组（135±8）明显减少（P=0.001）。CCK-8结果提示,shRNA-TNFAIP2组的吸光度值明显低于shRNA-NC组（P=0.000）;流式细胞术结果显示,shRNA-TNFAIP2组的凋亡率（18.730±0.490）%明显高于shRNA-NC组（6.570±0.870）%（P=0.000）;Western blot结果显示,shRNA-TNFAIP2组较shRNA-NC组细胞蛋白N-cadherin、Vimentin表达降低,E-cadherin表达增加。结论：TNFAIP2在NSCLC中存在高表达,下调能够抑制细胞的增殖、迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡,逆转上皮间质转化。     

慢病毒介导shRNA特异性沉默促肝细胞再生磷酸酶1基因表达抑制舌癌细胞迁移侵袭能力

目的：探讨特异性沉默促肝细胞再生磷酸酶1（phosphatase of regenerating liver cell-1,PRL-1）基因表达对舌癌细胞迁移、侵袭能力的影响。方法：设计、合成5条针对PRL-1基因的短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）干扰序列,构建于慢病毒载体质粒中,PCR电泳及基因测序验证。转染293T细胞,Western blot筛选最佳干扰序列,包装产生慢病毒。转染TCA8113细胞,筛选、建立稳定转染细胞株;real-time PCR检测PRL-1基因沉默效率;划痕实验和Transwell实验分别比较慢病毒转染细胞（KD组）、空病毒转染细胞（NC组）及TCA8113细胞（CON组）迁移、侵袭能力变化。结果：PCR电泳及基因测序证实5条shRNA序列定向插入慢病毒载体质粒中。Western blot筛选出PRL-1-shRNA-1基因沉默效率最高,包装获得慢病毒滴度为 7×108 TU/ml。通过转染、筛选,建立了TCA8113细胞稳定转染细胞株;real-time PCR测得PRL-1基因mRNA表达明显下降（F=809.120,P=0.000）;PRL-1基因沉默后细胞迁移能力降低,穿过人工基底膜的细胞数KD组（25.5±0.4）明显少于NC组（81.5±2.0）和CON组（88.5±2.3）（F=1 092.970,P=0.000）。结论：沉默PRL-1基因表达能有效抑制舌癌细胞迁移、侵袭能力。     

人21．5kDaMBP基因沉默对神经胶质瘤细胞增殖与凋亡的作用研究

目的：研究人21．5kDa人脑髓鞘碱性蛋白（MBP）基因沉默对神经胶质瘤U251细胞增殖与凋亡的影响。方法将21．5kDaMBP序列特异性短发夹RNA（shRNA）重组质粒pGenesil‐1‐MBP‐3转染神经胶质瘤细胞株（U251）作为MBP基因沉默组,以空质粒转染为阴性对照组,脂质体转染为脂质体空转组;用实时定量PCR（RT‐PCR）和Westernblot方法检测各组21．5kDaMBPmRNA和蛋白的表达水平,CCK‐8法测定细胞增殖曲线,流式细胞法分析细胞凋亡率。结果与阴性对照组相比,MBP基因沉默组细胞中21．5kDaMBP在mRNA和蛋白水平的表达均显著下降（P＜0．05）、细胞增殖活性明显降低（P＜0．05）、细胞凋亡率显著增高（P＜0．05）。结论人21．5kDaMBP基因沉默对神经胶质瘤细胞U251具有显著的抑制增殖和促进凋亡的双重调节作用。     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

正常增殖期子宫内膜细胞增生状态的定量观察

以＾３氢－胸腺嘧啶核苷放射自显影法及ＨＥ染色，观察并分别测定了１８例正常子宫内膜增殖中期，１５例增殖晚期的腺上皮细胞或间质细胞的标记指数、分裂指数。结果显示：子宫内膜增殖晚期腺上皮细胞或间质细胞之ＬＩ均明显高于增殖中期。同时，增殖晚间质细胞之ＭＩ也明显高于增殖中期，即此两种细胞在增殖晚期中增生明显，其增生状态初步获得了定位定量测定的正常值。     

人工全髋关节置换术的手术配合

目的：介绍人工全髋关节置换术的手术配合做法;方法：主要在手术配合的六个方面,解决防感染、防栓塞等问题。结果：30例人工全髋关节置换术均获成功,结论：手术配合是护士责任心和基本功的全面体现,对提高手术效果有至关重要的影响。     

尿微量白蛋白检测在继发性肾脏疾病中的临床意义

目的探讨尿微量白蛋白（m-Alb）检测在继发性肾脏疾病中的临床意义。方法采用Beckman Immage全自动特种蛋白分析仪对糖尿病组、高血压组、心脏病组患者进行了m-Alb测定,同时与健康组结果作对比。结果m-Alb检测糖尿病组为3.7±5.26mg/dl,高血压组为7.5±8.18mg/dl,心脏病组为7.8±3.76mg/dl,健康组为0.66±0.48mg/dl,各试验组m-Alb增高百分率为糖尿病组48.9%,高血压组37.5%,心脏病组26.9%。结论尿蛋白阴性的糖尿病、高血压、心脏病患者进行m-Alb检测,可以监测病程的进展。     

尿液pH值对红细胞检验影响的探讨

[目的 ]通过尿液 pH值对红细胞检验影响的观察 ,更加科学、准确地诊断血尿和血红蛋白尿。[方法 ]采用干化学分析仪检测和尿液显微镜红细胞计数 ,观察 180例正常人尿标本加入正常人血标本后 ,不同 pH值 ,不同时间内 ,观察红细胞溶解情况。 [结果 ]pH <5 .5以下时 ,随着时间的延长 ,红细胞溶解现象明显。 1h后观察有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;2h后有非常显著性差异 (P <0 .0 1)。[结论 ]pH <5 .5时对红细胞计数影响较大 ,易致红细胞发生溶解现象 ,出现假性血红蛋白尿 ,对血尿和血红蛋白尿很难区分 ,给临床诊断造成不便 ,更易引起漏诊和误诊。     

喉癌主癌灶手术切缘的临床特点分析

目的探讨研究喉癌主癌灶手术的安全切缘在临床上的特点。方法回顾性分析2007年6月—2011年3月已经确诊喉癌的患者100例,随机分成A、B两组,A组为观察组50例,主要采取手术切缘后,然后采取镜下观察分析;B组为观察组50例,主要采取手术切缘后,然后采取肉眼观察分析,将结果进行临床特点分析比较。结果早期的喉癌患者和晚期的喉癌患者的阳性切缘例数,差异无统计学意义（P〉0.05）;晚期的阳性切缘发生次数高于早期的阳性切缘发生次数,差异有统计学意义（P〈0.05）。声门上区[SG]2、3和5、10mm;跨声门型[TG]2、3mm和5、10mm的切缘对比,差异有统计学意义（P〈0.05）。SG、G、TG、IG的2mm和3mm,5mm和10mm对,差异无统计学意义（P〉0.05）。肉眼阳性切缘观察39个,镜下阳性切缘观察43,两者差异无统计学意义（P〉0.05）。结论依据原发不同部位、不同分期和不同范围选取适合的切线,就可以有效地减少阳性切缘的发生。     

儿童腹痛328例病因诊断及分析

目的：根据儿童急性腹痛的特点,诊断儿童腹痛应综合临床及相关检查提供的依据,做出准确诊断,给予适当治疗。方法：对临床328例腹痛患儿进行选择性辅助检查和分析。结果：小儿腹痛病因复杂,腹腔内疾病占64．63％,共17种病因;腹腔外疾病占35．37％,共6种病因。结论：仔细询问病史、认真体格检查、密切观察病情、针对性地选择辅助检查,在儿童腹痛的诊断上具有重要的意义。