逆转录病毒载体介导的RNAi抑制Bmi-1基因表达对MCF-7细胞的影响

目的:研究RNA干扰(RNAi)抑制Bmi-1基因表达后对乳腺癌细胞株MCF-7凋亡和增殖的影响.方法:将表达Bmi-1短发夹RNA(shRNA)的重组逆转录病毒载体pSuper-retro/Bmi-1si瞬时转染MCF-7乳腺癌细胞株,携带针对绿色荧光蛋白干扰序列的载体pSuper-retro/GFPsi作为阴性对照.用RT-PCR和Western Blot分别从mRNA,蛋白水平检测Bmi-1的表达;MTT法检测细胞增殖;流式细胞术检测MCF-7细胞周期和凋亡的变化.结果:pSuper-retro/Bmi-1si明显抑制MCF-7细胞Bmi-1 mRNA及蛋白表达.与空白对照组及阴性对照组相比较凋亡细胞数无明显增加;抑制Bmi-1基因表达使MCF-7细胞G1/S周期转换及细胞增殖速率受抑制.结论:表达shRNA的重组逆转录病毒载体pSuper-retro/Bmi-1si能显著抑制乳腺癌细胞株MCF-7中Bmi-1基因表达,从而有效抑制MCF-7细胞增殖,为乳腺癌的基因治疗提供了实验依据.     

RASSF1A基因对食管癌细胞EC9706凋亡影响的研究

目的 观察外源性RASSF1A基因诱导食管癌细胞EC9706凋亡作用并探讨机制.方法 将包含RASSF1A基因的质粒pcDNA3.1(+)转染人食管癌细胞EC9706,建立稳定表达细胞系,通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法、原位末端标记(TUNEL)、透射电子显微镜观察细胞形态研究RASSF1A对食管癌细胞生长的影响.结果 建立稳定高表达RASSF1A基因的EC9706细胞系,高表达RASSF1A的细胞较转染空载体和未经转染细胞RASSF1A蛋白表达增加;细胞生长速度明显减慢(P<0.001);TUNEL与透射电镜均观光到细胞生长有明显的凋亡特征性改变(P<0.001).结论 RASSF1A基因的外源性表达能显著抑制食管癌细胞在体内外的生长,其机制可能与该基因诱导凋亡、抑制增殖作用有关.     

Bmi-1基因沉默对人视网膜母细胞瘤SO-RB50细胞生长的体外抑制作用

[目的] 探讨体外沉默Bmi-1基因对人视网膜母细胞瘤SO-RB50瘤细胞增殖和凋亡的影响。[方法] 免疫组织化学和RT-PCR分别检测Bmi-1基因在人视网膜母细胞瘤瘤组织和SO-RB50瘤细胞中表达。体外化学合成法合成靶向Bmi-1基因的siRNA双链转染培养的人SO-RB50瘤细胞。荧光定量RT-PCR和western-blot分别检测转染Bmi-1 siRNA后的人SO-RB50瘤细胞中Bmi-1 mRNA和蛋白水平的变化。MTT法测定Bmi-1基因干扰后SO-RB50瘤细胞增殖情况。流式细胞仪检测Bmi-1 siRNA对人SO-RB50瘤细胞凋亡的影响。[结果] 免疫组化和RT-PCR显示Bmi-1基因在人视网膜母细胞瘤瘤组织和SO-RB50瘤细胞中表达。人SO-RB50瘤细胞经Bmi-1沉默处理后,与阴性对照组相比,Bmi-1在mRNA和蛋白水平抑制率分别为（83.9±3.2）%和（82.8±1.1）%。MTT结果显示干扰组细胞在第3天增殖抑制作用最明显,抑制率达（52.5±1.9）%。干扰组人SO-RB50瘤细胞凋亡率为（20.67±1.1）%,阴性组细胞凋亡率为（1.9±0.2）%,两者有统计学差异。[结论] Bmi-1特异性siRNA能显著抑制人SO-RB50瘤细胞 Bmi-1基因的表达,抑制细胞生长,可能通过促进瘤细胞凋亡而起作用,Bmi-1基因可能为RB治疗的新靶点。     

血红素加氧酶-1对食管癌细胞株Eca109增殖及凋亡作用的影响

目的 研究血红素加氧酶-1(heme oxygenase,HO-1)对食管癌细胞株Eca109增殖活性及凋亡作用的影响.方法 利用体外设计合成的靶向抑制HO-1的低分子RNA(siRNA)沉默食管鳞癌Eca109细胞HO-1基因的表达,应用RT-PCR、Western blot检测HO-1 mRNA和蛋白表达水平,分别以MTS法、流式细胞术检测干扰HO-1后食管鳞癌Eca109细胞增殖和凋亡水平.结果 RT-PCR、Western blot检测结果显示转染HO-1 siRNA可以成功抑制食管鳞癌Eca109细胞HO-1的表达;与空白组、阴性对照组比较,HO-1 siRNA干扰组Eca109细胞增殖能力明显减弱,细胞凋亡率显著增加.结论 HO-1siRNA可有效沉默食管癌细胞HO-1的表达,抑制细胞的增殖活性,促进细胞的凋亡.     

Bmi-1 siRNA对人白血病K562细胞增殖的影响及其机制

目的探讨Bmi-1 siRNA对人白血病K562细胞增殖的影响及其作用机制。方法通过脂质体将化学合成针对Bmi-1基因的siRNA转染K562细胞,采用MTT法观察Bmi-1 siRNA对K562细胞增殖的抑制作用;流式细胞术分析细胞周期变化;Western blot检测Bmi-1 siRNA对K562细胞中Bmi-1和P16蛋白表达的影响。结果Bmi-1 siRNA能明显延长K562细胞的倍增时间、G1期比例增加;下调Bmi-1表达的同时上调P16蛋白表达。结论体外化学合成的Bmi-1 siRNA对K562细胞的体外增殖具有明显的抑制作用,下调Bmi-1蛋白表达的同时上调P16蛋白表达。     

RNAi干扰食管癌EC9706细胞MTA1基因表达对侵袭和迁移的影响

目的 采用RNAi抑制食管癌EC9706细胞株MTA1基因的表达,观察对食管癌细胞侵袭和迁移的影响.方法 用脂质体包裹转染沉默MTA1表达的siRNA表达载体人食管癌细胞EC9706.定量RT-PCR和免疫印迹分别检测MTAl mRNA和蛋白表达情况;划痕损伤实验和细胞体外侵袭实验分别测定迁移和侵袭的影响.结果 定量RT-PCR检测显示,MTA1基因的表达水平明显降低;转染沉默MTA1的siRNA表达载体组的食管癌细胞划痕未愈合,穿透Matrigel的细胞数量明显减少,与未转染组、转染空载体组和转染无关序列siRNA载体组比较差异有显著性(P<0.05).结论 RNA干扰介导的MTA1基因表达沉寂可有效降低食管癌细胞侵袭和迁移;MTA1基因可能成为肿瘤治疗上有前途的分子靶点.     

RASSF1A基因对食管癌细胞EC9706生长抑制作用的研究

目的观察RASSF1A基因对食管癌细胞EC9706生长的抑制。方法将包含RASSF1A基因的质粒转染RASSF1A表达缺失的EC9706细胞,建立稳定转染细胞系,通过MTT法检测细胞活性和增殖能力、流式细胞仪检测其对细胞周期的影响、裸鼠移植瘤实验检测转染细胞的体内成瘤特性。结果稳定表达RASSF1A的EC9706细胞较对照组细胞的RASSF1A蛋白表达增加;细胞生长速度减慢（P〈0．01）;细胞周期中G1期比例增加,S期比例减少（G1期：RASSF1A组细胞：68．53％±3．34％;空质粒组：54．25％±4．61％;未转染组：53．41％±5．60％。S期：RASSF1A组细胞：（23．19±5．04）％;空质粒组：（31．81±2．05）％;未转染组：32．09％±1．99％）（P〈0．01）;同时裸鼠致瘤能力也被抑制（P〈0．05）。结论RASSF1A基因的外源性表达能显著抑制食管癌细胞在体内外的生长,提示该基因在食管癌的发生发展中发挥重要作用。     

奥曲肽对食管癌细胞株Eca9706增殖的影响

目的 研究奥曲肽对食管癌细胞株Eca9706增殖的影响。方法 将不同浓度的奥曲肽加入食管癌细胞．用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞生长抑制效应。^3H-胸腺嘧啶核苷(^3H-TdR)掺入实验测定对DNA合成的影响,显微镜下观察细胞形态变化，流式细胞仪(FCM)检测细胞周期。结果 奥曲肽对Eca9706细胞的生长及DNA合成均有抑制作用。显微镜下可见明显的细胞病变，细胞变圆、变小、脱落，FCM显示奥曲肽作用后，G0／G1期细胞增多，S期、G2／M期细胞减少。结论 奥曲肽能明显抑制食管癌细胞株Eca9706的DNA合成，并能形成G0／G1期阻滞，使细胞存活率下降，表明奥曲肽显著抑制Eca9706的增殖。     

Dnmt1基因对胃癌细胞株AGS细胞增殖凋亡的影响

目的:利用RNA干扰(RNAi)技术,以Dnmt1(DNA methyltransferase 1)为靶基因,设计构建重组体pshRNA-Dnmt1,研究其对胃癌AGS细胞增殖凋亡的影响.方法:设计shRNA的寡核苷酸片断,再克隆至载体pTZU6 1中构建重组体pshRNA-Dnmt1,转染胃癌细胞株AGS,用Western Blot检测DNMT1蛋白水平变化,用RT-PCR法评估mRNA水平,MTT法动态监测活细胞数,AO/EB法、电镜和TUNEL观察其促凋亡作用.结果:成功构建重组质粒pshRNA-Dnmt1 后,进行序列分析得到确证. RT-PCR检测结果证实: 重组质粒pshRNA-Dnmt1 对胃癌AGS细胞中Dnmt1基因的转录有着明显抑制作用,转染后24 h抑制率在21.63%左右;48 h为52.97%;72 h为72.06%. Western Blot检测结果表明:pshRNA-Dnmt1 转染AGS细胞后24 h出现DNMT1蛋白表达量减少,抑制率为28.24%;48 h为68.54%;72 h为81.47%. MTT结果提示: 转染后24, 48和72 h细胞数存活率为对照组的79.49%, 51.63%和39.16%. AO/EB法、电镜和TUNEL都看见大量典型的凋亡和坏死细胞,转染后48 h的细胞凋亡率由对照组的5%上升为35%左右.结论:重组质粒pshRNA-Dnmt1 能特异有效地抑制胃癌细胞株AGS内Dnmt1基因的表达,能抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,从而为肿瘤的基因治疗开辟了新途径.     

丁酸钠对食管癌细胞增殖的影响

目的:观察丁酸钠对食管癌EC9706细胞增殖、细胞周期及NDRG1蛋白表达的影响.方法:采用0.5 mmol/L丁酸钠作用于食管癌EC9706细胞,用MTT法检测处理不同时间时细胞增殖的变化,采用流式细胞仪检测细胞周期的变化,采用免疫组化方法检测NDRG1蛋白表达的变化.结果:①MTT实验结果显示,丁酸钠作用1～5 d时各组吸光度均低于对照组,经统计学处理差异有显著性意义(P＜0.05);丁酸钠不同作用时间的细胞增殖抑制率分别为:1 d组21.2%,3 d组23.5%,5 d组25.6%,且随作用时间延长抑制率升高.②细胞周期检测结果为(%):G1期细胞:对照组57.00±1.10,1 d组63.10±0.78,3 d组67.20±0.58,5 d组69.70±0.64;S期细胞:对照组25.30±0.27,1 d组20.20±0.66,3 d组20.40±0.82,5 d组20.90±0.50;M期细胞:对照组17.20±1.00,1 d组16.70±0.69,3 d组12.10±0.41,5 d组9.40±0.23.各组G1期结果分别与对照组结果比较,差异有显著性意义(P＜0.01).③丁酸钠可上调NDRG1蛋白表达水平,随作用时间增长蛋白表达增强.结论:丁酸钠可抑制食管癌细胞增殖,这一作用可能与NDRG1蛋白表达增加有关.     

组织蛋白酶B特异性siRNA对人食管癌EC9706细胞体外侵袭力的抑制作用

目的:探讨组织蛋白酶B(CB)特异性siRNA对人食管癌EC9706细胞体外侵袭力的抑制作用.方法:将体外转录合成的针对CB的特异性siRNA设10 μmol/L、15 μmol/L和20 μmol/L 3个不同剂量转染人食管癌EC9706细胞,用Boyden chamber体外侵袭实验检测转染前后细胞体外侵袭力的变化.对照组设无关siRNA转染组、空白对照组(转染空脂质体)及正常对照组(不进行任何操作).结果:和正常对照组相比,特异性siRNA 15μmol/L组和20 μmol/L组穿越Matrigel胶的细胞数明显减少(P＜0.05),而10 μmol/L特异性siRNA组、空白对照组和无关siRNA转染组与正常对照组之间差异均无统计学意义(P＞0.05).结论:特异性CB siRNA能有效抑制人食管癌EC9706细胞的体外侵袭力.     

小白菊内酯诱导人食管癌细胞凋亡的研究

目的 探讨小白菊内酯(Parthenolide,PN)对人食管癌细胞EC9706增殖和凋亡的影响及PN的作用机制.方法 MTT法检测PN(20、40和80μmoL/L)作用EC 970624、48和72 h细胞增殖活性的变化;流式细胞术和免疫细胞化学法分别检测PN处理的EC9706细胞凋亡和NF-K Bp65蛋白表达的变化.结果 ①PN抑制EC 9706的增殖活性,呈时间和剂量依赖性.②PN作用EC 970648 h后,NF-κ Bp65蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.05).③PN作用EC 970672h后,细胞早期和晚期凋亡率增加,差异有统计学意义(P<0.05).结论 PN抑制EC9706细胞的增殖,诱导其凋亡,作用机制与抑制NF-κB有关.     

肝素酶特异性RNAi对人食管癌EC9706细胞肝素酶基因表达的影响

目的:探讨RNAi技术对人食管癌EC9706细胞肝素酶(heparanase,Hpa)基因表达的影响.方法:针对Hpa不同基因位点设计合成寡核苷酸,然后转录为小分子干扰RNA(siRNA),分别用浓度为10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L的siRNA经LipofectamineTM 2000脂质体介导转染EC9706细胞72 h,同时设无关序列组及不转染组.采用完整细胞原位杂交技术观察各组EC9706细胞中Hpa基因的表达.结果:siRNA可有效抑制人食管癌EC9706细胞Hpa基因的表达,以15 μmol/L的siRNA作用效应最强,但不同浓度siRNA两两相比,差异均无统计学意义(P＞0.05),不同浓度siRNA对Hpa基因表达的抑制效应均显著强于无关序列组及不转染组(P＜0.05).结论:RNAi技术可有效抑制人食管癌EC9706细胞Hpa基因的表达.     

肝素酶反义寡核苷酸转染的人食管癌EC9706细胞中肝素酶mRNA的表达

目的:探讨肝素酶反义寡核苷营酸对肝毒酶mRNA表达的影响。方法:食管癌EC9706细胞分6组培养,5组分别用设计合成的4条封闭肝素酶不同基因位点的反义寡核苷酸(ASODN1、ASODN2、ASODN3、ASODN4)及1条无关寡核苷酸(N-ODN)转染,另1组不转染。采用完整细胞原位杂交技术观察各组EC9706细胞中肝素酶mR-NA表达情况。结果:4条肝素酶反义寡核苷酸转染的EC9706细胞中肝素酶mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05),但均显著低于无关寡核苷酸组(P<0.05)。结论:肝素酶反义寡核苷酸序列可抑制食管癌EC9706细胞中肝素酶mRNA表达。     

人端粒酶RNA反义寡核苷酸诱导食管癌EC9706细胞凋亡观察

目的:观察人端粒酶RNA功能区的硫代修饰性反义寡核苷酸(ASODN)对食管癌EC9706细胞凋亡的诱导作用.方法:应用20 μmol/L ASODN 1次/d、连续7 d转染EC9706细胞,分别于转染前及转染后第1 d、3 d、5 d、7d采用端粒酶活性的定性及定量检测技术测定ASODN对EC9706细胞增殖及端粒酶活性的抑制作用,采用细胞DNA凋亡条带检测、TUNEL检测及吖啶橙荧光染色法观察细胞的凋亡情况.结果:与转染前比较,ASODN转染后各时点EC9706细胞端粒酶活性降低,凋亡细胞增多(P＜0.05或0.01).转染后第3 d开始出现DNA凋亡条带,第7 d出现从靠近加样孔处向远端延伸的相差180～200 bp的十几条DNA凋亡条带.结论:ASODN可通过抑制EC9706细胞端粒酶活性诱导肿瘤细胞凋亡,从而抑制食管癌细胞的增殖.     

ROCK抑制剂对人食管癌EC9706细胞迁移能力的影响

目的研究ROCK特异性抑制剂Y-27632对人食管癌EC9706细胞迁移能力的影响,并探讨其可能的机制。方法体外培养人食管癌株EC9706,加入20μmoL／L的Y-27632溶液（实验组）及等体积的PBS（对照组）培养1h,采用细胞计数、MTF实验检测细胞生长情况,采用Transwell实验观察细胞迁移情况,采用Westernblot检测Cav-1的表达水平,并进行两组的比较。结果细胞计数、MTT、Transwell实验结果显示,Y-27632可以抑制细胞的生长与迁移能力,与对照组比较差异有统计学意义（P均〈0．05）。Westernblot检测结果显示,Y-27632处理细胞1h后,Cav-1蛋白表达水平明显下降,并明显低于对照组（P均〈0．05）。结论ROCK信号通路参与EC9706细胞生长与迁移的调节,Y-27632可以抑制EC9706细胞的生长及迁移能力,其机制可能与下调Cav-1的表达有关。     

抑制Raf-MEK-ERK信号传导途径上调食管癌细胞株EC9706柯萨奇-腺病毒受体的表达

目的 研究Raf-MEK-ERK信号传导途径对食管癌EC9706细胞柯萨奇-腺病毒受体(CAR)表达的影响.方法 用ERK抑制剂PD98059 10、20、40 μmol/L作用EC9706细胞24 h,利用免疫荧光和RT-PCR、Western-blot检测各种浓度处理前、后CAR表达水平的变化.结果 与对照组比较,10 μmol/L PD98059组CAR表达水平差异无统计学意义;20、40 μmol/L PD98059处理组 CAR表达水平显著提高(P<0.05),且呈浓度依赖性.结论 用一定浓度的抑制剂抑制Raf-MEK-ERK信号传导途径可上调食管癌EC9706细胞膜表面CAR的表达.     

Cathepsin B反义寡核苷酸对食管癌EC9706细胞中CB mRNA表达的影响

目的:探讨组织蛋白酶B(CB)反义寡核苷酸(ASODN)对CB mRNA表达的影响。方法:将食管癌EC9706细胞分5组培养,5组分别用设计合成的3条封闭CB不同基因位点的反义寡核苷酸(ASODN1、ASODN2、ASODN3)及1条无关寡核苷酸(N-ODN)转染,另1组不转染(空白对照组)。采用完整细胞原位杂交技术观察各组EC9706细胞中CB mRNA表达情况。结果:3条CB ASODNs转染的EC9706细胞中CB mRNA表达均下调,差异无统计学意义,但均明显低于N-ODN组及空白对照组。结论:CB ASODN可抑制食管癌EC9706细胞中CB mRNA表达,为临床预防食管癌等恶性肿瘤浸润转移奠定理论了基础。     

食管癌相关基因2对EC9706细胞恶性增殖的抑制作用

目的探讨食管癌相关基因2(esophageal cancer related gene2,ECRG2)对EC9706食管癌细胞恶性增殖的抑制作用及其机制。方法利用DNA重组技术,构建ECRG2真核表达质粒(pcDNA3.1ECRG2),在食管癌EC9706细胞中转染并表达ECRG2蛋白,观察细胞的生长状态,比较平板集落和软琼脂克隆形成能力的改变,分析ECRG2对EC9706恶性表型的影响。进一步采用WesternBlot检测p53、p21的改变。结果转染表达ECRG2后,EC9706细胞的生长受到干扰,细胞的增殖速度受到抑制,实验组细胞平板集落形成率为18%,而对照组为55%,两者间差异显著(P<0.05);肿瘤细胞的停泊非依赖能力降低,实验组软琼脂克隆体积小且形成个数(8±1.88)明显少于对照组(14.3±3.13),差异显著(P<0.05)。WesternBlot分析表明,EC9706细胞转染表达ECRG2后伴随着p53、p21蛋白表达上升。结论转染表达ECRG2蛋白能够部分逆转食管癌EC8706细胞的恶性表型,其过程可能与p53、p21通路密切相关。