肝癌中少量侧群细胞的分离、纯化及在体内荷瘤能力

目的从侧群(side population,SP)表型细胞具有干细胞特性的角度出发,对肝癌细胞系中的SP细胞进行检测、分离和评价。方法利用SP细胞能将荧光染料Hoechst33342泵到细胞外的特性,结合流式细胞技术进行分离纯化。结果在肝癌细胞系PLC、Huh7、Hep3B、SMMC7721及1例临床肝癌组织中检测到SP细胞的比例依次为0.8%、0.3%、0.6%、0.3%、0.4%;未在HepG2中检测到SP细胞。NOD-SCID荷瘤实验发现SP细胞较非SP细胞具有更高的成瘤性。结论肝癌细胞系及标本组织含有少量的SP细胞,这些SP细胞比非SP细胞具有更强的成瘤性,为进一步分析SP细胞的肿瘤干细胞特性奠定了基础。     

肝癌细胞株Bel-7402中侧群细胞的分离和致瘤能力

【目的】 分选肝癌Bel-7402细胞中的侧群(SP)细胞并分析其生物学特性?【方法】 采用流式细胞荧光激活分选(FACS)技术将Bel-7402细胞分为SP细胞和非侧群(NSP) 细胞2亚群?实验分组:SP组与NSP组?细胞生长曲线法和平板克隆法比较SP细胞和NSP细胞的增殖能力和克隆形成能力;RT-PCR法检测SP细胞和NSP细胞的CD133?三磷酸腺苷结合盒转动蛋白G2(ABCG2)表达;流式细胞术分析细胞凋亡率;无血清培养法检测SP细胞及NSP细胞成球率;非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠体内成瘤实验比较SP细胞和NSP细胞的致瘤性?【结果】 Bel-7402细胞中分选出的SP细胞比例为(2.4 ± 0.0)%?生长曲线表明SP细胞的增殖速度快于NSP细胞(P < 0.05)?SP?NSP细胞的克隆形成率分别为(20.5 ± 2.6)%?(5.1 ± 0.9)%,两者差异明显(P < 0.05)?SP细胞ABCG2 mRNA和CD133 mRNA平均表达水平分别是NSP细胞的3.03倍(P < 0.01)和1.98倍(P < 0.01)?SP细胞凋亡率为(0.89 ± 0.23)%,低于NSP细胞 (P < 0.05)?在无血清培养基中,SP细胞成球率为(14.1 ± 1.9)%,高于NSP细胞(P < 0.05)?1 × 103?104?105数量的SP细胞形成皮下移植瘤(P > 0.05,P < 0.05,P < 0.05),而1 × 105 NSP细胞则还不能成瘤?【结论】 肝癌 Bel-7402细胞中的SP细胞可能富集了肝癌干细胞?     

从黑色素瘤荷瘤小鼠中分离纯化髓系抑制性细胞

目的：从黑色素瘤荷瘤小鼠脾脏中分离得到CD11b＋Gr-1＋的髓系抑制性细胞（ Myeloid derived suppressor cells ,MDSCs）。方法给C57BL/6小鼠注射LPS或者小鼠黑色素瘤细胞株B16BL6后,取小鼠的脾脏细胞,检测其中CD11b＋Gr-1＋的MDSCs 细胞的比例。通过流式细胞仪（ flow cytometry, FCM）分选出CD11b＋Gr-1＋的细胞,培养24小时后,CBA（cytometric bead array）法检测其分泌IL-10的情况;提取CD11b＋Gr-1＋细胞的总RNA,利用RT-PCR的方法检测其表达IFN-β、TGF-β、iNOS、ARG-1和IDO的情况。结果与注射LPS相比,注射B16BL6细胞株的小鼠脾脏中CD11b＋Gr-1＋的MDSCs细胞的比例更高;利用FCM分选得到CD11b＋Gr-1＋的MDSCs,进一步鉴定发现其表达IL-10、IFN-β、TGF-β、iNOS、ARG-1和IDO。与先前报道的MDSCs的特征相一致。结论可从B16BL6荷瘤小鼠脾脏中获得高纯度的MDSCs用于实验研究。     

甲状腺癌中类干细胞的侧群细胞的分离及鉴定

目的:研究不同甲状腺肿瘤细胞中是否存在具备干细胞特性的侧群(side population,SP)细胞,同时比较侧群细胞和非侧群(non-SP)细胞生长?成瘤及侵袭性的差异?方法:以多种人甲状腺未分化癌细胞株为对象,利用干细胞高表达ABCG2转运体,可将荧光染料Hoechst泵出胞外的特性,运用双波长流式细胞仪从不同的甲状腺肿瘤细胞株中分选出具有干细胞特性的侧群细胞,进而通过半定量PCR及免疫荧光染色比较侧群和非侧群细胞的干细胞标志OCT4及肿瘤耐药基因ABCG2?MDR1表达的情况,采用克隆形成率及细胞侵袭迁移实验比较两组细胞群的克隆形成能力和侵袭转移能力?结果:人甲状腺未分化癌细胞株中存在具有干细胞特性的侧群细胞,该群细胞高表达干细胞标志OCT4及肿瘤耐药基因ABCG2和MDR1;同时在体外培养中,此侧群细胞可产生侧群细胞和非侧群细胞;侧群细胞比非侧群细胞具有更强的体外克隆形成能力和侵袭转移能力?结论:甲状腺肿瘤细胞中存在具有干细胞特性的侧群细胞,此群细胞可生成普通的瘤体细胞,提示该群细胞可能是肿瘤耐药和复发的根源?     

血卟啉在H-22肝癌荷瘤小鼠体内的分布

目的探讨声敏剂血卟啉衍生物在肿瘤组织中的富集情况,以便在给药后超声结合血卟啉治疗肿瘤时选择最佳的超声处理时间。方法H-22肝癌荷瘤小鼠尾静脉注射HpD后,不同时间点取材,采用荧光分光光度法测定不同组织提取液中HpD的荧光强度,研究HpD在不同组织中的分布以及代谢变化。结果给药后2 h肿瘤组织以外的其他各组织内(血浆、肝、肾、皮肤、肌肉)血卟啉含量均达到其代谢过程的最高点,后逐渐下降;肿瘤组织中的HpD含量注射后不断上升,6 h时达到顶峰,随后又开始下降,10~24 h代谢比较缓慢,表现为肿瘤组织中对HpD的滞留作用,24 h时肿瘤组织中的HpD含量高于其他各组织,48~72 h趋于稳定在较低水平。结论提出了不同部位的肿瘤应选择各自适当的时间点进行超声处理。     

侧群细胞、干细胞和脑肿瘤

脑肿瘤是中枢神经系统最具破坏性的病理改变,越来越多的证据表明恶性肿瘤,包括脑肿瘤和肿瘤细胞株,含有干细胞样肿瘤细胞[1].在各种正常和癌性组织中,单独依靠表面标记鉴定干细胞已显不足.     

大鼠树突状细胞的体外分离、纯化、扩增及鉴定

目的 探讨诱导及纯化大鼠树突状细胞（Dendritic cells,DC）的方法，为进一步研究树突状细胞的功能、特性及临床应用提供技术方法。方法 应用重组大鼠rGM-CSF、IL－4在体外培养大鼠骨髓前体细胞获得大量DCs，经标抗大鼠OX62单抗免疫磁株分离纯化后的DCs经形态学观察、表型检测、功能学实验鉴定。结果 大鼠骨髓来源的DC在体外培养12－14d后完全成熟，99．36％培养纯化后DC表达大鼠特异性表面标志OX62；典型的成熟大鼠DC形态上类似于小鼠和人类的DC，表型为MHCⅡ＋＋，OX62＋＋，FcγR（CD32）＋／－，CD80＋／－，CD86＋＋，体外功能分析显示该DC能够强烈刺激MLR并有效递呈可溶性抗原OVA刺激初始型T细胞的增殖。结论 成功地建立了体外大量扩增大鼠骨髓DC的方法，为研究其在异种移植及诱导免疫耐受的作用打下基础。     

大鼠肝癌肺转移灶中边缘群细胞的分离与表型鉴定

目的：建立肝癌远处器官转移灶中边缘群肝癌细胞的分离方法并对其干细胞特征进行鉴定．方法：利用二乙基亚硝胺（DEN）建立大鼠肝癌肺转移灶模型;组织块原代培养法扩增培养肺转移灶中的肝癌细胞,对细胞进行Ho-echst 33342及不同荧光标记的c—kit,Sca-1 mAb染色后,利用流式细胞仪（FACS）分选肝癌肺转移灶中的边缘群及非边缘群细胞,并分析两群细胞表面干细胞标志物的表达特征;软琼脂克隆形成分析两群细胞的肿瘤形成能力．结果：成功建立大鼠肝癌肺转移灶模型,并在此基础上获得性质较为均一并可稳定传代的肺转移肝癌细胞株;FACS分析表明边缘群细胞占肺转移肝癌细胞总细胞量的0．5％,边缘群细胞表面c-妇表达率为85％,Sca-1表达率为75％,而非边缘群细胞表面c-kit及Sca-1表达率分别仅为8％和3％;软琼脂克隆实验结果表明边缘群细胞平均克隆形成率为69．9％,非边缘群细胞平均克隆形成率为15．3％,边缘群细胞肿瘤形成能力显著高于非边缘群细胞（P〈0．01）．结论：肺转移肝癌细胞中的边缘群细胞具备显著的肿瘤干细胞特征．     

人舌癌细胞株Tca8113中侧群细胞的分离及其ABCG2的表达

目的 通过流式细胞技术分选人舌癌细胞株Tca8113中的侧群细胞(SP细胞)、非侧群细胞(MP细胞),检查ABCG2蛋白在SP细胞、MP细胞、T(Tca8113)细胞中的表达情况,并探讨其意义.方法 用流式细胞仪检测SP细胞、MP细胞、未分选Tca8113细胞中的ABCG2表达情况.结果 人舌癌细胞株Tca8113中存在SP细胞,ABCG2在Tca8113 SP细胞中较高表达(表达率13.16%),在MP细胞中几乎不表达(表达率1.07%)、在Tca8113细胞中少量表达(表达率3.29%).结论 人舌癌细胞株Tca8113中的SP细胞较高表达ABCG2,通过ABCG2+分选侧群细胞,将有可能进一步分选纯化类肿瘤干细胞,为今后分离肿瘤干细胞提供有效手段.     

大鼠胰岛细胞的分离纯化及培养

目的　探讨大鼠胰岛细胞分离纯化和培养的方法。方法　采用胰导管逆行灌注Hanks液分离成年大鼠胰岛,Ⅴ型胶原酶消化,不连续密度梯度Ficoll 4 0 0纯化胰岛。用台盼蓝和双硫腙染色检测胰岛活性和纯度,葡萄糖刺激胰岛素释放试验检测胰岛功能。结果　胰岛细胞的收获量为5 4 0±15 0个胰岛 胰腺,活性>90 % ,纯度>90 % ,高糖刺激后胰岛素释放量为低糖刺激的2倍多。结论　胰导管灌注Hanks液,Ⅴ型胶原酶消化和不连续密度梯度葡聚糖纯化胰岛,可以获取数量多,活性和纯度好的胰岛     

乳腺癌细胞MDA-MB-435s中侧群细胞的分选及其与非侧群细胞的生物学特点比较

目的 分离乳腺癌细胞MDA-MB-435s中的侧群细胞(side population cells,SP),并比较侧群细胞和非侧群细胞(non-side population cells,NSP)的基本生物学特点.方法 经Hoechst33342染色后,利用流式细胞技术分选乳腺癌细胞MDA-MB-435s中SP和NSP 2个细胞亚群,比较2群细胞的形态、增殖和周期等特点.结果 分选得到的SP细胞约占5.2％,其增殖速度较NSP细胞快,且细胞形态较粗大.NSP细胞的G1期所占比例为73.63％,高于SP细胞的G1期所占比例为54.16％.结论 SP和NSP细胞的形态有差异,SP细胞的增殖速度快于NSP细胞,NSP细胞的周期阻滞在G1期,提示SP细胞可能在乳腺癌细胞的生长过程中具有重要的作用.     

肝癌细胞线粒体的纯化及双向凝胶电泳分析

目的:建立纯化肝癌细胞线粒体的方法,通过双向电泳及酶活力测定确认纯化效果.方法:使用蔗糖密度梯离心法分离纯化线粒体,双向凝胶电泳分析纯化过程中样品蛋白质图谱的变化.结果:通过标志酶活力的监测,梯度离心后线粒体纯提高近12倍,线粒体蛋白质在双向凝胶电泳中得到很好的显现.结论:使用蔗糖密度梯度心法可有效地分离纯化线粒体,为线粒体蛋白质组后续研究奠定了基础.     

膀胱癌T-24细胞系中细胞角蛋白20的分离纯化及鉴定

目的分离纯化细胞角蛋白20(Cytokeratin20,CK20)并加以鉴定,为进一步研制抗CK20单克隆抗体奠定基础。方法培养人膀胱肿瘤T-24细胞系并用免疫组化检测CK20表达,然后大量培养并收集细胞,超声波细胞粉碎后,先用萃取、高速离心、透析等方式进行蛋白初分离,然后利用以DE52为介质的阴离子交换层析分离纯化CK20蛋白,以电泳示踪,最后采用SDS-PAGE、HLPC和Western-blotting加以鉴定。结果在阴离子交换层析时出现3组洗脱峰,CK20主要存在第二组峰中,该峰在SDS-PAGE和Western—blotting上均呈现单一条带,HLPC分析显示CK20蛋白主峰呈正态分布,仅处一个较低峰度的蛋白质杂峰。结论该纯化方法简便、可行、效果好、获得的蛋白纯度高,提取的蛋白可确认为CK20并且具有较高的免疫生物活性。     

肝癌大鼠T细胞亚群变化和免疫疗法体内抗肿瘤作用

应用小鼠抗大鼠T细胞亚群单克隆抗体荧光标记流式细胞仪分析技术,观察BERH_2肝瘤大鼠和不同对照组大鼠T细胞亚群。并在此基础上探讨了不同免疫疗法对荷瘤大鼠体内免疫调节和抗肿瘤效应。结果表明,荷瘤大鼠T细胞亚群变化同肿瘤生长、扩散有关。单纯给于IFN、IL-2和5-Fu对BERH_2肝癌抑制作用不明显。联合应用能选择性抑制T_S细胞功能,具有增强免疫力,去除免疫抑制和直接抑制肿瘤转移等多重抗肿瘤作用。是抗肿瘤治疗一个有价值方案。     

miR-182在体内外肝癌细胞中的表达及对肝癌的诊断价值

目的 探讨mi R-182在体内和体外细胞中的表达及对肝癌的诊断价值。方法 荧光定量PCR检测正常肝细胞系L-O2与肝癌细胞系Hep G2、Hep G3B、Huh7的mi R-182表达,以及肝癌组和对照组各40例mi R-182的表达。并且用ROC曲线分析血浆mi R-182对肝癌的诊断效能。结果 (1)Hep G2、Hep G3B及Huh7三种肝癌细胞系的mi R-182表达水平均显著高于正常肝细胞系L-O2(均P<0.05);(2)肝癌组血浆mi R-182相对表达量远高于对照组(P<0.05);(3)肝癌组mi R-182的异常表达与性别、年龄、肿瘤大小无显著相关性(均P>0.05),而与肿瘤的分化程度、临床分期、淋巴结转移有关(均P<0.05);(4)ROC曲线分析提示mi R-182诊断肝癌的曲线下面积(AUC)为0.852(95%CI:0.762~0.942),敏感度为87.5%,特异度为80.0%,约登指数为0.675,阳性预测值为△Ct1=5.25,当低于这个值时,提示mi R-182表达升高,罹患肝癌的可能性增大。结论 血浆mi R-182的高表达可能成为肝癌诊断的新方法 。     

营养损伤影响肝癌荷瘤小鼠体内炎性微环境的研究

目的:探讨不同营养价值的饲料喂养对肝癌荷瘤小鼠体内炎性微环境的影响及其机制。方法:将55只Balb/c小白鼠,按照喂养饲料的不同进行分组,分为标准组、强化组、玉米组、脂肪乳组和高脂组,全部同时接种HepA肝癌,喂养至实验结束,处死取血清测肿瘤相关的炎性因子IL-6、IL-8、NF-κB、TNF-α。结果:五组动物的肿瘤相关炎性因子从低至高的排列为标准组<强化组<玉米组<脂肪乳组<高脂组,各组与标准饲料组相比炎性因子均显著升高(P<0.05)。结论:均衡营养更加有利于肝癌荷瘤小鼠的生存,过高或过低的热量饮食都不利于肝癌的生存,尤其是高脂肪饮食使体内促发肿瘤的炎性因子升高最为明显,能量过高或过低造成的营养损伤通过炎性因子的升高来引起或促发肝癌的发生和转移。     

骨转移瘤中侧群细胞的初步分析

目的研究骨转移瘤原代细胞中是否存在干细胞样侧群细胞(SP细胞)。方法对乳腺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、肾癌及宫颈癌骨转移瘤原代细胞进行Hoechst33342染色,应用荧光显微镜直接进行观察,检测骨转移瘤原代细胞中是否存在SP细胞及非SP细胞,并给予维拉帕米拮抗剂,观察各骨转移瘤瘤细胞中SP细胞亚群染色变化情况。结果所检测的乳腺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、肾癌及宫颈癌骨转移瘤原代细胞中均存在SP细胞。荧光显微镜下,SP细胞体积较非SP细胞小,SP细胞胞核蓝色荧光呈淡染或消失;非SP细胞经染色后发出较强的蓝色荧光。给予维拉帕米拮抗剂后,各骨转移瘤细胞中胞核发蓝色荧光的细胞数目明显增多。结论乳腺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、肾癌及宫颈癌骨转移瘤原代细胞中存在干细胞样的SP细胞。     

人卵巢癌OVCAR3细胞系中侧群细胞的分离及其成瘤性、侵袭性的实验研究

目的  分离卵巢癌细胞系OVCAR3中的侧群(SP)细胞,并观察其成瘤性和侵袭性。 方法  利用流式细胞荧光激活分选法将卵巢癌OVCAR3细胞系分成SP和非侧群(non-SP)细胞两个亚群。对两个亚群细胞分别采用软琼脂克隆形成实验和细胞球形成实验观察其体外成瘤能力;Transwell小室法检测两个亚群细胞的体外侵袭力。  结果  OVCAR3细胞株中外排Hoechst33342的SP细胞占13.1％,加入维拉帕米SP细胞的比例为1.8%。SP细胞的体外克隆形成率为(46.17±23.27)％,non-SP细胞仅为(6.17±3.06)％,SP细胞克隆形成率高于non-SP细胞(P<0.05);细胞球形成实验结果显示,SP细胞能在无血清的培养液中形成细胞球,而non-SP细胞则不能;Transwell侵袭实验结果显示,SP表型细胞穿过Matrigel基底膜的细胞数为(215.9±30.9)个,non-SP表型细胞仅为(60.9±10.5)个。  结论  卵巢癌OVCAR3细胞系中存在外排Hoechst33342荧光染料的SP细胞,其成瘤性、侵袭力均强于non-SP亚群细胞,表明SP表型的肿瘤细胞在卵巢癌的生长、侵袭及转移中具有重要的地位。