用多聚酶链反应诊断弓形虫病

根据本实验室筛选出的弓形虫(ZS_2株)特异DNA克隆片段的部分顺序分析的数据,设计并合成特异的寡核苷酸引物对,建立多聚酶链反应诊断弓形虫病的方法。不同来源的弓形虫株和7例畸形胎儿DNA经体外基因扩增,扩增产物经电泳检测,均出现特异的扩增条带。对42例肝炎综合症的婴儿和33例不良生育史的孕妇的外周血白细胞DNA检测,分别为6例和4例阳性。50例正常人外周血白细胞DNA检测均为阴性。对扩增产物进行Southern印迹分析,以~(32)P标记克隆的弓形虫特异DNA片段为探针,能与阳性病例特异的扩增条带杂交,而不与阴性样品的扩增产物杂交。本法并与其它检测方法的结果相比较,具高度特异、敏感且快速的优点。     

检测弓形虫PCR-ELISA方法的建立

目的 建立检测弓形虫DNA的快速、敏感、特异、稳定的PCR-ELISA方法。方法 将生物素标记的PCR产物与地高辛标记的特异性探针杂交。通过酶免疫显色反应测出A值，判断弓形虫感染情况。优化反应条件，测定方法的敏感性。并与琼脂糖凝胶电泳结果比较。以人、小鼠、疟原虫、旋毛虫等DNA为模板在同样条件下进行测试，以确定该方法的特异性。结果 本实验的最佳杂交时间为30min，最佳探针浓度为3pmol／ml。该方法的检测阈值为20fg弓形虫DNA，其灵敏度是电泳法的10倍，并且与人、小鼠、疟原虫、旋毛虫等DNA均无交叉反应。结论 PCR-ELISA是一种快速、敏感、特异、稳定的检测方法，可用于临床弓形虫病的诊断。     

弓形虫ITS-1序列PCR诊断方法的建立

目的本文旨在为弓形虫感染的临床病例检测建立特异性PCR诊断方法。方法本研究以弓形虫ITS-1序列为种特异性遗传标记,采用有限稀释法稀释速殖子DNA,经PCR扩增,检测该方法的敏感性;用同一引物扩增鸡柔嫩艾美耳球虫原虫和弓形虫,检测PCR方法的特异性。人工感染小鼠和家兔,用组织触片法和PCR方法检测感染动物的组织,并检测10头临床疑似病猪的肺脏、肺门淋巴结、脾脏、肾脏和肝脏等组织,比较两者的敏感性。结果该PCR方法最低可以检测1pg弓形虫速殖子DNA(相当于10个速殖子的DNA);鸡柔嫩艾美耳球虫原虫未扩增出特异条带,仅弓形虫出现特异条带(300bp)。组织触片和PCR方法对人工感染小鼠组织DNA的检出率均为87.5%(7/8),对人工感染家兔的检出率分别为50%(3/6)和66.7%(4/6),对临床疑似弓形虫病猪检测的阳性率均为20%,两种方法的检查结果基本一致。结论本试验结果表明,PCR技术可以作为弓形虫感染动物的诊断与检测方法。     

PCR-ELISA检测弓形虫实验研究

目的建立快速、敏感、特异、稳定的PCR—ELISA方法，并用其检测感染动物体内的弓形虫。方法将生物素标记的PCR产物与地高辛标记的特异性探针杂交，再通过酶免显色反应测出OD值。以判断弓形虫感染情况。测定该方法的敏感性、特异性及稳定性。再分别以10^4、10^3弓形虫RH株速殖子腹腔接种小鼠。取全血、肝组织用PCR—ELISA检测小鼠感染情况。结果本实验中，PCR-ELISA方法的检测闻值为20fg弓形虫DNA，其灵敏度是电泳法的10倍，并且与人、小鼠、疟原虫、旋毛虫等DNA均无交叉反应。同一样本重复测试5次，结果经统计学检验，一致性良好（Alpha=0．72）。检测感染动物肝组织及全血标本，10^4、10^3组分别在感染后第二d、第三d即可测出阳性，两种标本的阳性检出效率无统计学差异（P〉0．05）。结论PCR—ELISA是一种快速、敏感、特异、稳定的检测方法，可试用于临床弓形虫病的诊断及流行病学调查。     

用聚合酶链反应方法诊断弓形虫病的研究初报

我们用聚合酶链反应(PCR)检测弓形虫基因组的方法诊断弓形虫病具有特异、灵敏、快速的优点。从弓形虫(ZS_2株)基因组文库中筛选出弓形虫特异DNA 片段的克隆(1.1kb),对该克隆的片段以噬菌体M13mp18为载体,用双脱氧核苷酸末端终止法进行了部分顺序分析。根据所得 DNA 顺序的数据,设计并合成若干长度为19—20NT 的特异的寡核苷酸引物对,并建立体外扩增弓形虫特异 DNA 顺序的聚合酶链反应     

原位PCR对弓形虫感染鼠病理检测效果的观察

观察原位PCR方法在弓形虫感染病原学检测中的效果。以RH株弓形虫速殖子感染小鼠后第 2、 4、 6天处死 ,取肝脏制备石蜡标本及冰冻切片标本 ,以直接法原位PCR扩增并检测石蜡标本中的弓形虫DNA ,与免疫组化方法检测冷冻切片标本的结果相比较。 18例直接原位PCR法检测标本中均得到阳性信号 ,病原体检出率为 10 0 % ,优于免疫组化法 (11/18)。直接法原位PCR为检测病理标本中的弓形虫DNA提供了一种新的可行方法。     

弓形虫微线体分泌蛋白TgMIC10基因的克隆、表达及鉴定

目的 克隆、表达及鉴定弓形虫（RH株）微线体分泌蛋白TgMIC10编码基因。为建立一种灵敏检测弓形虫感染的实验方法作准备。方法 提取弓形虫速殖子总RNA，设计并合成引物，RT-PCR扩增TgMIC10编码基因，与克隆载体pGEM-T连接。经酶切和PCR鉴定及DNA测序证实后．亚克隆入表达载体pBK-CMV，IPTG诱导表达pBK-TgMIC10阳性重组子转化宿主菌E．coli BL21．Western blot鉴定。结果 PCR法扩增出了一597bp左右的DNA片断，将重组质粒pGEM-TgMIC10、pBK-TgMIC10分别作EcDRⅠ和XbaⅠ双酶切，均能得到一个大小与PCR扩增产物一致的插入片断。表明Tg—MIC10基因的克隆和亚克隆均获成功，用IPTG诱导带有重组质粒pBK—TgMIC10的大肠杆菌，产物行SDS-PAGE。可得到一约21kDa融合蛋白。Western-blot法鉴定该蛋白能被弓形虫感染的兔血清所识别。     

弓形虫微线体分泌蛋白TgMIC10基因的克隆和序列分析

目的从弓形虫RH株cDNA中扩增出微线体分泌蛋白TgMIC10编码基因并进行克隆,为利用其表达的重组蛋白建立一种灵敏检测弓形虫感染的实验方法作准备。方法提取弓形虫速殖子总RNA,设计并合成引物,RT-PCR扩增TgMIC10编码基因,通过与线性克隆载体pGEM-T连接,经进行酶切和PCR鉴定及DNA测序证实。结果PCR法扩增出了一个大小约597bp左右的DNA片断,将重组质粒pGEM-T-TgMIC10作EcoRI和XbaI双酶切,均能得到一个大小与PCR扩增产物一致的插入片断,对插入片断的测序结果表明,TgMIC10具有一个长度为597bp的完整开放阅读框(ORF),编码198个氨基酸,理论分子量23kDa,与GenBank收录(编号为AF293654)的弓形虫Tg-MIC10基因具有高度的同源性(99.5%)。结论本实验成功地克隆了TgMIC10编码基因,为进一步研究提供了条件。     

弓形虫GRA8基因真核表达重组质粒的构建、鉴定及测序

目的 构建弓形虫RH株pcDNA3，1( )-GRA8真核表达重组质粒，为进一步DNA免疫做准备。方法 用聚合酶链反应(PCR)从弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码致密颗粒蛋白(GRA8)的基因片段，纯化后重组入pUC-19克隆载体，再经含IPTG，XGal氨苄培养基蓝白筛选，挑选白色克隆酶切，低溶点琼脂糖纯化，回收目的基因亚克隆入pcDNA3．1( )，经氨苄培养基过夜培养挑选6个克隆提纯酶切，PCR鉴定和测序。结果 从RH株基因组DNA中扩增出特异的GRA8基因片段，克隆成功pcDNA3．1( )-GRA8重组质粒。测序表明GRA8这部分基因与GENEBANK相应基因序列完全一致。结论 本结果为研究抗弓形虫核酸疫苗打下基础。     

应用PCR技术评价抗弓形虫药物的疗效

目的　探讨应用PCR技术对药物治疗小鼠急性弓形虫感染的疗效进行了考核评价。方法　小鼠腹腔内感染RH株弓形虫速殖子 2× 10 3 ,8h后给予双氢青蒿素 75mg/kg d和双氢青蒿素 75mg/kg d联合磺胺嘧啶钠 10 0mg/kg d每日两次灌胃小鼠治疗 ,疗程 15d ,观察小鼠存活率 ,并于感染后第 9、15、31d取小鼠腹水及肝、脾和脑进行弓形虫PCR检测 ;于停药后5个月取存活小鼠脑再行弓形虫PCR检测。结果　双氢青蒿素联合磺胺嘧啶钠组小鼠存活率达 93% ,明显高于磺胺嘧啶钠组 (6 8 3% )及双氢青蒿素组 (0 % )。PCR检测可见小鼠腹水中除联合治疗组外 ,其余各组均可检测出特异弓形虫DNA ;但只有对照组和双氢青蒿素组小鼠的肝脏和脑中可检测出虫体DNA ,而脾脏中只有对照组可检出虫体DNA。结论　小鼠腹水的PCR检测结果与存活率和腹水虫体镜检结果一致 ,并弥补了镜下检查由主观造成的不足 ;肝、脾、脑等脏器的PCR检测也取得与存活率基本一致的结果 ;总之 ,本研究中的PCR检测结果较客观地反映药物对小鼠的疗效情况 ,为动物实验性弓形虫病的药物疗效考核提供了一个较为简便、灵敏、特异的方法     

Construction of a genomic DNA library of the Toxoplasma gondii ZS2 strain, screening of specific clones, and DNA diagnosis of toxoplasmosis.

We have constructed a genomic DNA library of the Toxoplasma gondii ZS2 strain and isolated a specific cloned DNA sequence from this organism. The restriction map of this cloned 1.1-kb DNA fragment was analyzed. Southern and dot-blot analyses showed that the 32P-labeled DNA fragment hybridized to parasite DNA, to DNAs from peripheral blood leukocytes and the thymus of baby pigs that were artificially infected with T. gondii, and to DNAs of T. gondii-positive anencephalic and hydrocephalic fetuses. It did not hybridize with DNA from controls, (i.e., normal human and baby pig peripheral blood leukocytes, spleen of normal mice, Plasmodium falciparum, Pneumocystis carinii, and pBR322). As few as 100 T. gondii parasites or 500 pg of purified DNA from T. gondii can be detected by dot-blot hybridization. This probe method was specific and sensitive, and has been used successfully in detecting various clinical cases of toxoplasmosis with T. gondii.     

用PCR技术检测大鼠弓形虫DNA

目的 探讨弓形虫病大鼠外周血弓形虫DNA检测的意义。方法 自行设计一对引物,用聚合酶链反应技术扩增弓形虫P30基因的一段保守序列。结果 设计的这对引物对健康人、大鼠、小鼠外周血白细胞以及阴道毛滴虫、溶组织内阿米巴均不能扩增,表明具有特异性。反应体系经35个循环扩增,可检测到2条弓形虫DNA,表明具有较高的敏感性。结论 PCR法对大鼠弓形虫感染可做出早期诊断。     

刚地弓形虫RH株GRA6分子基因克隆与序列分析

目的　克隆刚地弓形虫 RH株致密颗粒抗原 (Dense granule antigen,GRA6 )分子基因 ,为研究使用重组的GRA6分子作为抗原进行弓形虫病诊断奠定基础。　方法　根据己知的 GRA6序列合成一对引物 ,抽提弓形虫速殖子m RNA,以速殖子 m RNA为模板 ,通过反转录 PCR(RT- PCR)扩增出 GRA6的 c DNA条带。目的基因 DNA条带被克隆到质粒 p UC19中形成重组质粒。对重组质粒 DNA进行纯化 ,并对目的基因片段进行核苷酸序列分析。　结果　通过RT- PCR从 m RNA中扩增出一条分子量约 70 0 bp的 DNA条带。核苷酸序列分析表明 ,GRA6分子基因的开放的阅读框全长为 6 93bp,编码 2 30个氨基酸分子 ,与已报道的 RH株 GRA6分子具有 10 0 %的同源性。　结论　本研究获得了刚地弓形虫 RH株的 GRA6分子基因 ,为今后应用此分子作为抗原诊断弓形虫病奠定了基础     

弓形虫感染家兔血液中虫体的动态观察

目的探明虫体在家兔血液中动态变化情况。方法用RH株弓形虫速殖子105个/只的剂量腹腔感染雄性家兔16只。在家兔感染前后分别采集家兔血液,抗凝处理后,-40℃冻存备用,用实时定量PCR检测弓形虫感染家兔血液中弓形虫DNA,依据对照计算虫体拷贝量,绘制感染后时间与血液中虫体含量的动态曲线图。结果雄兔弓形虫感染后4d血液中即可检测到虫体DNA,血液中虫体含量为217.887×103个/ml,血液中虫体含量在感染后8 d达到高峰期,血液中虫体含量为248.019×103个/ml,然后虫体含量逐渐下降,在感染后121 d雄兔血液中虫体密度为1.45×103/ml。结论弓形虫感染雄兔血液中虫体含量随感染后时间不同而变化。     

聚合酶链反应检测日本血吸虫DNA的实验研究

目的探索核酸检测在日本血吸虫病诊断中的应用。方法根据日本血吸虫基因设计特异性引物,采用PCR方法对日本血吸虫的成虫、虫卵、日本血吸虫感染家兔的肝组织、粪便、外周血清标本中的DNA进行扩增,并将虫卵和粪便的模板DNA倍比稀释后进行扩增,以测定PCR扩增法的敏感性。结果从日本血吸虫的成虫、虫卵、日本血吸虫感染家兔的肝组织、粪便和外周血清中均扩增到分子量为230bp的阳性条带,扩增产物经测序并在基因库中匹配,证实为日本血吸虫基因中的一个片段,其同源性为98%。其PCR扩增敏感性检测结果表明,0.021个虫卵DNA模板即可扩增出该特异性阳性条带。结论聚合酶链反应检测日本血吸虫DNA有较高的敏感性,尤其是能从日本血吸虫感染宿主血清中检测出特异性DNA,具有潜在的诊断应用价值。     

Cloning of repetitive DNA sequences from Toxoplasma gondii and their usefulness for parasite detection.

Genomic DNA of Toxoplasma gondii was digested with the restriction endonuclease Hpa II and the resulting repetitive DNA sequences were visualized after electrophoresis on agarose gels and staining with ethidium bromide. Three repetitive DNA sequences were isolated and cloned in the plasmid pUC19. The recombinant plasmids (pTg8, pTg4 and pTg1) had inserts of 840, 440, and 180 basepairs, respectively. The estimated copy number of these cloned sequences in the T. gondii genome was approximately 800-1,000 for pTg4, 150-200 for pTg8, and 30-40 for pTg1. In dot-blot hybridization tests, pTg4 was able to detect as little as 80 pg of purified T. gondii DNA or 1,000 parasites in the presence or absence of 1.5 x 10(6) human or mouse leukocytes. No cross-hybridization was detected with 10 micrograms of either human and mouse DNA or 100 ng of DNA from other parasites (Eimeria tenella, E. acervularia, Trypanosoma cruzi, and Leishmania donovani), or among the three DNA probes. Each probe identified T. gondii tachyzoites in tissue (liver and spleen) obtained from experimentally infected mice in which histologic damage was detected. In addition, early detection of T. gondii in brain tissue and blood samples was possible with the pTg4 probe.     

Clone of the gene of the dense granule antigen (GRA6) of the Toxoplasma gondii pig strain

The gene of GRA6 of Toxoplasma gondii pig strain was cloned; and the value of recombinant GRA6 as a diagnostic antigen of toxoplasmosis in China was investigated. A pair of primers was synthesized according to the DNA sequence of GRA6 of T. gondii RH strain, and the DNA of pig strain tachyzoites was prepared. A single, specific DNA fragment was successfully amplified from the genomic DNA of tachyzoites of T. gondii. This gene fragment was cloned into the plasmid pUC19 to form the recombinant. The recombinant plasmid was purified and the foreign DNA fragment was sequenced. The result of DNA sequencing showed that the open reading frame of GRA6 is composed of 693 base pairs and encodes 230 amino acids and is 100% homologous with the sequence of GRA6 of T. gondii RH strain.     

弓形虫表面抗原P30 DNA疫苗免疫小鼠诱导体液免疫应答及保护性的初步观察

目的观察弓形虫表面抗原P30 DNA疫苗免疫BALB/c小鼠诱导其体内产生的体液免疫应答及抗虫感染的免疫保护作用. 方法重组质粒pBK-P30用生理盐水稀释后,肌注免疫BALB/c小鼠.分别于免疫后5周和10周,ELISA测定IgG抗体滴度;取免疫鼠的血液、肺、心脏、肝脏、脾、肾脏及肌肉PCR扩增P30基因;免疫鼠腹腔注射弓形虫速殖子攻击感染.结果两次检测,均可测到特异性IgG抗体,且抗体的滴度随免疫时间的延长而增高;免疫后5周,免疫鼠的上述组织均可扩增出P30基因条带,但免疫后10周仅血液扩增出特异P30基因条带;弓形虫速殖子腹腔攻击感染,免疫组鼠的平均存活时间较对照组鼠延长,但统计学差异不显著(P＞0.05). 结论弓形虫表面抗原P30 DNA疫苗能诱导BALB/c小鼠产生特异性体液免疫应答及部分抗虫免疫保护作用.     

Cellular and humoral immune responses to recombinant antigens in sheep infected with Toxoplasma gondii

Immune responses to recombinant fragments of the Toxoplasma gondii antigens ROP2 and GRA2 were investigated in sheep naturally and experimentally infected with T. gondii oocysts. Specific serum antibodies to C-terminal fragments were detected by ELISA. Cell-mediated responses in peripheral blood mononuclear cells were demonstrated by proliferation and interferon-gamma production following in vitro stimulation with the ROP2 fragment. This data indicates the presence of epitopes for sheep B cells in the recombinant GRA2 fragment and for both B and T cells in the ROP2 fragment.