人乳头瘤病毒16型晚期基因L1的原核表达质粒的构建和鉴定

目的 构建人类乳头瘤病毒（ＨＰＶ）１６型晚期基因Ｌ１的原核表达质粒,以期从中选出能够高效表达ＨＰＶ１６Ｌ１的重组子,为进一步表达Ｌ１蛋白奠定基础。方法 应用定向克隆策略,将ＨＰＶ１６Ｌ１基因分别克隆到原核表达载体ｐＴｒａｃ９９Ａ和ｐＥＴ－２１ｃ中。结果 通过酶切鉴定选出了重组子ｐＴｒｃ９９Ａ－ＨＰＶ１６Ｌ１和ｐＥＴ－２１ｃ－ＨＰＶ１６Ｌ１。结论 ＨＰＶ１６Ｌ１的原核表达质粒构建成功。     

人乳头瘤病毒16型(新疆株)E6基因的原核表达

根据人乳头瘤病毒16（新疆株）E6基因编码序列设计引物，从含有HPV16 E6基因的质粒中扩增出含HPV16 E6基因的CNA片段，该片段全长450bp，将所得片段与pMD18-T载体连接，转化到JM109大肠杆菌中，筛选的阳性克隆扩增后，提取质粒DNA，用BamH I和Sal I酶切，回收450bp的目的片段，定向克隆到pET28a中，转化JM109受体菌，从JM109受体菌中提出质粒，再转化到BL21（DE3）中，筛选出转化体，用IPTG诱导表达，在PAGE上见到所表达的18kD的特异性的HPV16（新疆株）E6蛋白条带。     

人乳头瘤病毒16型L1的表达、病毒样颗粒组装及其免疫原性研究

目的 在原核表达系统中表达HPV16 L1蛋白,纯化后在体外自组装成VLPs并鉴定。方法 优化GenBank中HPV16 L1基因序列并截短C末端25个氨基酸,构建至原核表达载体pET-28a上,获得重组表达载体pET28a-16L1△C25。采用镍亲和层析法纯化超声上清,于体外解组装-重组装HPV16 VLPs,采用动态光散射和透射电镜进行形貌分析,纯化后于第0、2和4周免疫小鼠,假病毒中和试验检测HPV16 VLPs免疫后血清中和抗体。结果 双酶切和测序结果表明成功构建pET28a-16L1△C25重组质粒,诱导表达后,经SDS-PAGE和Western blotting分析显示表达的L1蛋白大部分以可溶性形式存在,纯化后的蛋白样品于体外重新组装,动态光散射和透射电镜能够观察到形态与天然病毒颗粒相似的VLPs,第6周小鼠血清中和抗体滴度Log10平均值达到4.43。结论 利用原核表达系统成功表达了截短型HPV16 L1蛋白,并于体外组装成结构完整的VLPs,且具有较好的免疫原性,为低成本HPV预防性疫苗的研发奠定基础。     

人乳头瘤病毒四价疫苗可能有效

据Medscape．com4月7日报道(原载Lancet Oncol 2005)，一项随机双盲研究结果显示HPV四价疫苗在预防HPV持续性感染或发病方面可能有效。另一项与之相关的大型研究正在进行之中。     

人乳头瘤病毒16型L1蛋白表达及其单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

目的表达并纯化重组人乳头瘤病毒16型（HPV16）L1蛋白，建立分泌抗HPV16 L1单克隆抗体（mAb）的杂交瘤细胞株。方法以基因工程表达HPV16L1蛋白。用Ni—NTA技术进行纯化后免疫BALB／c小鼠，取脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞融合，经含次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶（HAT）的选择培养基及有限稀释法进行克隆化，用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，对获得的杂交瘤细胞株染色体进行计数．同时测定细胞培养上清mAb的效价。结果筛选出2株可分泌抗HPV16 L1 mAb的杂交瘤细胞，命名为AE3和AG7，染色体数分别为130条和98条。2株杂交瘤细胞AE3和AG7培养上清的效价分别为1：5120和1：80。结论成功建立了2株可分泌抗HPV 16 L1 mAb的杂交瘤细胞，为进一步研制HPV感染检测试剂盒提供实验基础。     

基因重组人巨细胞病毒pp150蛋白片段的原核表达及鉴定

目的以人巨细胞病毒（HCMV）AD169病毒株基因为模板,经PCR扩增了编码pp150蛋白片段的UL32基因,转入pMD18-T克隆载体后经酶切与表达载体pET-11a连接,转入大肠杆菌BL21,重组大肠杆菌经诱导表达pp150蛋白片段.经SDS-PAGE分析,其相对分子量约为21.5 kD,表达量约占菌体蛋白的16.38%,Western blot鉴定为阳性.表明成功构建了pp150蛋白片段的表达载体,并成功诱导表达了pp150蛋白,为进一步纯化该蛋白奠定了基础.     

人类乳头瘤病毒16型ETC亚基因在耻垢分枝杆菌中的表达

目的在耻垢分枝杆菌Mycobaterium smegmatis mc^2 155中表达人类乳头瘤病毒16型E7C亚基因,为其重组BCG疫苗的研究奠定基础。方法采用电穿孔转化法将重组质粒pBCG-E7C导入耻垢分枝杆菌（M.smegmatis mc^2 155）中,通过卡那霉素抗性筛选经PCR鉴定的重组M.smegmatis mc^2 155,培养于middlebrook7H9 broth（M7H9）培养基中,并添加10%M7H9 enrichment ADC和0.05%Tween 80,37℃培养48 h～72 h,42℃诱导表达5 h,表达产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及Western blot分析。结果成功构建pBCG3000-E7C质粒,SDS-PAGE显示表达产物的分子质量单位约为6.5 ku,与预期理论值相符,Western blot分析表达产物能被宫颈癌患者血清识别。结论人类乳头瘤病毒16型E7C基因在M.smegmatis mc^2 155中成功表达。     

人乳头瘤病毒疫苗研究的新进展

人乳头瘤病毒 (Humanpapillomavirus,HPV)是一种有种属和组织特异性的双链闭环的脱氧核糖核酸 (DNA)病毒 ,可引起肛门周围、外阴生殖道的良恶性损害 ,及寻常疣和跖疣。寻常疣多由HPV 1型和 2型[1 ] 。约有 30多型HPV感染生殖道 ,引起良恶性新生物 (包括宫颈癌 )。尽管抗病毒治疗和免疫调节剂有一定疗效 ,但主要靠去除感染。所有治疗措施均有一定的无效和复发率 ,有些还有明显的毒性。采用安全套等屏障方法有一定的保护作用 ,但预防感染主要是避免接触感染组织。因感染广泛 ,由其引起的相关疾病较多 ,缺乏有效防治方法 ,引起了研究者对…     

人乳头瘤病毒58型E6E7融合基因重组巨细胞病毒的构建及鉴定

目的 利用人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)58突变型E6E7(Mutant type E6E7,mE6E7)融合基因为靶点,巨细胞病毒株(Towne株)细菌人工染色体(SW102 Towne bacterial artificial chromosome,SW102-T-BAC)为载体,构建携带HPV58 mE6E7融合基因的重组病毒,探讨HPV58mE6E7的转化活性。方法 PCR扩增带有50 bp Towne 开放读码框(open reading frame,ORF)75左右同源臂的GalK、mE6E7及野生型E6E7(Wild type E6E7,wE6E7)融合基因片段,切胶回收纯化;将GalK片段电转到(SW102-T-BAC)感受态细胞,经过同源重组、GalK及氯霉素抗性筛选,获得SW102-T-ORF75-Galk-BAC克隆;然后分别将纯化的mE6E7及wE6E7电转到SW102-T-ORF75-Galk-BAC感受态细胞,经脱GalK及氯霉素抗性筛选,获得SW102-T-ORF75-mE6E7-BAC及SW102-T-ORF75-wE6E7-BAC克隆;提取所得克隆质粒DNA,转染ARPE-19细胞(以转染SW102-T-BAC的细胞及未转染细胞为对照),逆转录PCR及测序分析验证转染细胞中mE6E7及wE6E7的表达状况;观察重组病毒T-ORF75-mE6E7及T-ORF75-wE6E7对转染ARPE-19细胞的影响,通过软琼脂克隆分析mE6E7及wE6E7转化活性。结果 获得了SW102-T-ORF75-mE6E7-BAC及SW102-T-ORF75-wE6E7-BAC的克隆。逆转录PCR及测序分析验证转染细胞中mE6E7及wE6E7的表达正确。转染SW102-T-ORF75-wE6E7-BAC的细胞生长失去接触抑制,出现重叠生长现象,其形态由原来梭形变为变圆、肿胀、胞浆颗粒增多;并且在软琼脂中能够形成克隆;而转染SW102-T-ORF75-mE6E7-BAC、SW102-T-BAC及未转染细胞未出现上述细胞的特点。结论 获得了T-ORF75-mE6E7及T-ORF75-wE6E7重组病毒,并且重组病毒T-ORF75-mE6E7的转化活性已消除,为HPV58型治疗性疫苗的研究奠定了基础。     

HPV16 L1在整合型重组毕赤酵母中的表达及病毒样颗粒的纯化

目的 构建可稳定表达HPV16 L1的整合型重组毕赤酵母,并纯化自主组装成的HPV16 L1病毒样颗粒（VLPs）.方法 根据酵母密码子偏爱性优化HPV16 L1基因并克隆到pPIC3.5K表达载体,构建pPIC3.5K/HPV16 L1重组质粒;重组质粒经Bgl Ⅱ酶切线性化后,电转化至GS115菌株中,筛选HPV16 L1重组毕赤酵母.阳性整合菌株甲醇诱导后,以HPV16 L1单克隆抗体检测目的蛋白表达;采用肝素亲和层析法纯化HPV16 L1VLPs并进行透射电镜观察.结果 PCR、酶切和测序分析表明成功构建了pPIC3.5K/HPV16 L1重组质粒.成功构建的HPV16 L1重组毕赤酵母甲醇诱导后,Western blot证实重组酵母菌裂解产物存在HPV16 L1目的蛋白.肝素亲和纯化后,透射电镜观察到了直径大约55 nm的VLPs,其形态与HPV16天然病毒颗粒相似.结论 利用整合型重组毕赤酵母表达系统成功表达了HPV16L1蛋白,并用肝素亲和纯化可快速获得结构完整的HPV16 L1VLPs,为HPV16预防性疫苗的研制奠定基础.     

Construction of prokaryotic expression system of TGF-β1 epitope gene and identification of recombinant fusion protein immunity

AIM: To insert the constructed TGF-β1the el loop of C-terminus of truncated hepatitis B core antigen to increase TGF-β1expression system and to identify immunity of the expressed recombinant protein in order to exploit the possibility for obtaining anti- TGF-β1METHODS: The TGF-β1mature TGF-β1TGF-32) was amplified by polymerase chain reaction from the recombinant pGEM-7z/TGF-β1HBcAg gene fragments (encoding HBcAg from 1-71 and 89-144 amino acid residues) were amplified from PYTA1-HBcAg vector. The recombinant vector pGEMEX-1 was used to insert HBcAg1-71, TGF-β1into restrictive endonuclease enzyme and ligated with T4ligase. The fusion gene fragments HBcAg1-71-TGF-β1HBcAg89-144 were recloned to pET28a(+) and the DNA sequence was confirmed by the dideoxy chain termination method. The recombinant vector pET28a (+)/CTC was transformed and expressed in E.. Coli BL21 (DE3)under induction of IPTG. After purification with Ni+2-NTA agarose resins, the antigenicity of purified protein was detected by ELISA and Western blot and visualized under electron microscope.RESULTS: Enzyme digestion analysis and sequencing showed that TGF-β1loop of C-terminus of truncated hepatitis B core antigen.SDS-PAGE analysis showed that relative molecular mass(Mr) of the expressed product by pET28a (+)/CTC was Mr 24 600.The output of the target recombinant protein was approximately 34.8％ of the total bacterial protein,mainly presented in the form of inclusion body. Western blotting and ELISA demonstrated that the fusion protein could combine with anti-TGF-β1not with anti-HBcAg. The purity of protein was about 90% and the protein was in the form of self-assembling particles visualized under electron microscope. This fusion protein had good anti-TGF-β1could be used as anti-TGF-β1CONCLUSION: A recombinant prokaryotic expression system with high expression efficiency of the target TGF- epitope gene was successfully established.The fusion protein is in the form of self-assembling particles and HBcAg can increase the antigenicity of TGF-β1immunogenicity and antigenicity.     

昆虫细胞偏爱密码子优化的HPV16L1基因在昆虫和哺乳动物细胞中的表达

目的获得有效表达人乳头瘤病毒16型（HPV16）L1基因的重组杆状病毒和腺病毒，为研究HPV的免疫保护机制提供材料。方法按照昆虫细胞密码子偏爱优化并合成HPV16LI基因，利用Bac—to-Bac昆虫表达系统获得表达HPV16L1基因的重组杆状病毒，利用AdEasy腺病毒载体系统获得表达HPV16L1基因的重组腺病毒载体。通过间接免疫荧光和Westernblot对HPV16L1基因表达进行鉴定，利用负染电子显微镜观察病毒样颗粒（VLP）的形成。结果获得了稳定表达HPV16L1蛋白的重组杆状病毒和重组腺病毒载体，在Sf9细胞和293细胞中可有效表达能被抗HPV16L1单克隆抗体识别的L1蛋白，分子质量单位为56ku，在Sf9细胞中可观察到VLP的形成。结论按照昆虫细胞密码子偏爱进行优化的HPV16L1基因，在昆虫细胞和哺乳动物细胞内均可有效表达。     

Construction of prokaryotic expression system of TGF-β1 epitope gene and identification of recombinant fusion protein immunity

AIM: To insert the constructed TGF-beta(1) epitope gene into the el loop of C-terminus of truncated hepatitis B core antigen to increase TGF-beta(1) antigenicity in its prokaryotic expression system and to identify immunity of the expressed recombinant protein in order to exploit the possibility for obtaining anti-TGF-beta(1) vaccine. METHODS: The TGF-beta(1) encoding epitope gene (the mature TGF-beta(1) from 78-109 amino acid residues, TGF-beta(1)(32)) was amplified by polymerase chain reaction from the recombinant pGEM-7z/ TGF-beta(1)(32) vector. The HBcAg gene fragments (encoding HBcAg from 1-71 and 89-144 amino acid residues) were amplified from PYTA1-HBcAg vector. The recombinant vector pGEMEX-1 was used to insert HBcAg1-71, TGF-beta(1)(32) and HBcAg89-144 into restrictive endonuclease enzyme and ligated with T(4) ligase. The fusion gene fragments HBcAg1-71-TGF-beta(1)(32)- HBcAg89-144 were recloned to pET28a(+) and the DNA sequence was confirmed by the dideoxy chain termination method. The recombinant vector pET28a (+)/CTC was transformed and expressed in E. coli BL21 (DE3) under induction of IPTG. After purification with Ni(+2)-NTA agarose resins, the antigenicity of purified protein was detected by ELISA and Western blot and visualized under electron microscope. RESULTS: Enzyme digestion analysis and sequencing showed that TGF-beta(1) epitope gene was inserted into the el loop of C-terminus of truncated hepatitis B core antigen. SDS-PAGE analysis showed that relative molecular mass (Mr) of the expressed product by pET28a (+)/CTC was Mr 24,600. The output of the target recombinant protein was approximately 34.8% of the total bacterial protein, mainly presented in the form of inclusion body. Western blotting and ELISA demonstrated that the fusion protein could combine with anti-TGF-beta(1) polyclonal IgG but not with anti-HBcAg. The purity of protein was about 90% and the protein was in the form of self-assembling particles visualized under electron microscope. This fusion protein had good anti-TGF-beta(1) antigenicity and could be used as anti-TGF-beta(1) vaccine. CONCLUSION: A recombinant prokaryotic expression system with high expression efficiency of the target TGF-beta(1) epitope gene was successfully established. The fusion protein is in the form of self-assembling particles and HBcAg can increase the antigenicity of TGF-beta(1). The expressed TGF-beta(1) epitope gene shows good immunogenicity and antigenicity.     

人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因原核表达及活性鉴定

目的:构建人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因的原核表达质粒,诱导sTNFR1-MBP融合蛋白表达,观察表达产物的生物学活性.方法:以HeLa细胞的总RNA为模板.用RT- PCR方法扩增sTNFR1全编码区基因片段,构建含有目的片段的T载体克隆及原核表达载体pMAL-c2x重组质粒亚克隆,经异丙基-β-D半乳糖苷酶(IPTG)诱导重组质粒菌表达sTNFR1,以淀粉树脂亲和层析法纯化重组蛋白,并对重组蛋白进行序列分析和Western blot鉴定.MTT法测定重组蛋白的生物学活性的测定.结果:经DNA序列分析和Western blot鉴定,成功构建了人sTNFR1重组质粒基因工程菌;在IPTG的诱导下,重组质粒菌能表达sTNFR1- MBP融合蛋白,SDS-PAGE显示在66 kDa处有一特异性表达条带;纯化的sTNFR1-MBP融合蛋白经Western blot证实具有生物学活性;生物活性实验(MTT法)显示可有效地封闭TNF-α对OSG7701的细胞毒性作用,随着重组蛋白浓度的增高(0.2,2,20,40,80 mg/L),对TNF-α细胞毒效应的抑制作用增强,细胞死亡率依次为69.98%±1.52%,60.05%±2.18%,46.27%±2.48%,37.02%±3.17%,1.83%±0.59%,1.71%±0.61%.结论:成功获得了具有生物学活性的人sTNFR1-MBP融合蛋白,为进一步研究奠定了基础.     

蓝氏贾第鞭毛虫末端结合蛋白 1 基因的克隆与原核表达

目的 克隆并原核表达 C2 株蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lambia,简称贾第虫)末端结合蛋白 1(End-bind- ing protein 1,geb1)基因,获得重组 gEB1 蛋白。 方法 由于 geb1 基因无内含子,我们以 C2 株贾第虫基因组为模板,以国际标准株WB 株geb1 基因序列为参考序列,设计引物克隆 geb1 基因,经 NcoⅠ和 XhoⅠ双酶切与原核表达载体 pET-28α(+)连接,转化感受态 E. coli TOP10,经筛选和测序验证后导入大肠杆菌 E. coli Rosetta(DE3),异丙基-β-D -硫代半乳糖(IPTG)诱导 gEB1 蛋白表达,产物经 SDS-PAGE 和 Western blot 进行检测和验证。 结果 成功构建了表 达 C2 株贾第虫 geb1 基因的原核表达载体 pET-28α(+)- gEB1,转化入大肠杆菌 E. coli Rosetta(DE3),重组菌株经 0. 1 mmol / L IPTG ,30℃低温诱导 5 h, SDS-PAGE 和 Western blot 显示,在相对分子量约 29 KDa 的位置出现目的蛋 白条带,与理论值一致。 结论 用大肠杆菌成功表达了 gEB1 蛋白,为 gEB1 蛋白的功能研究和抗体制备提供了材料。     

弓形虫表面抗原IMP1的克隆 原核表达及免疫学鉴定

目的 目的 克隆刚地弓形虫强毒RH株的表面抗原免疫作图蛋白1 （Immune mapped protein?1, IMP1）, 并对其进行原 核表达纯化、 鉴定。方法 方法 采用逆转录法合成刚地弓形虫RH株的第一链cDNA, 以此为模板, 用PCR法扩增野生型IMP1 基因的最大开放阅读框 （ORF） 序列, TA克隆测序鉴定后, 插入原核表达载体pET28b中, 构建重组表达载体pET28b? IMP1, 经双酶切和测序鉴定后转化大肠杆菌E.coli BL21 （DE3）, 经异丙基硫代?β?D?半乳糖苷 （IPTG） 诱导表达携带6 × 组 氨酸标签的IMP1融合蛋白, 改变温度、 诱导时间和IPTG浓度以优化诱导表达条件并测定蛋白可溶性, 通过镍离子螯合 （Ni 2+ ?NTA） 亲和层析纯化IMP1融合蛋白, 经Western blotting验证重组蛋白的特异性。结果 结果 在弓形虫RH株速殖子cD? NA中成功调取了IMP1基因的ORF序列, 并通过TA克隆和测序鉴定了IMP1基因的正确性, 在此基础上构建了原核表达 重组质粒pET28b?IMP1, 经双酶切和测序验证了重组载体的正确性, 并通过条件筛选确定了IMP1的最佳表达条件为 20 ℃下0.3 mmol/L IPTG诱导9 h。经镍柱亲和层析纯化后, IMP1全蛋白表达量和可溶性均较好, 与镍柱填料有较高的亲 和力, 能实现高效纯化。经SDS?PAGE及 Western blotting鉴定, IMP1具有良好的免疫活性。结论 结论 新型强毒弓形虫RH 株的表面抗原IMP1可在大肠杆菌原核表达系统中高效表达, 全长蛋白可溶, 性状稳定。本研究为进一步制备IMP1多克 隆抗体, 进行后续的体内表达研究以及抗弓形虫感染亚单位疫苗的构建和IMP1晶体结构研究奠定了基础。     

人基质金属蛋白酶-1的基因克隆、表达及其产物抗原性的分析

目的 构建人基质金属蛋白酶-1(MMP-1)基因重组质粒的克隆，获得具有抗原性的人MMP-1融合蛋白。方法 从人肝组织提取总RNA，以此为模板，逆转录巢式PCR扩增MMP-1全编码区基因片段，构建含目的片段的T载体克隆及原核表达载体pMAL-c2x重组质粒亚克隆，经异丙基-β-D半乳糖苷酶(IPTG)诱导表达MMP-1重组质粒菌，用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western-blot对重组蛋白进行分析鉴定。结果 经核苷酸序列测定和免疫印迹鉴定，成功地构建了人MMP-1重组质粒基因工程菌，并表达具有MMP-1抗原性的融合蛋白。结论 构建了人MMP-1重组质粒克隆，获得了具有抗原性的MMP-1融合蛋白，这将有助于今后制备MMP-1多克隆抗体。     

柯萨奇病毒B组3型中国分离株VP1基因真核表达系统的克隆

目的探讨构建柯萨奇病毒Ｂ组３型（ＣＶＢ３）基因疫苗的可行性。方法应用逆转录ＰＣＲ技术扩增ＣＶＢ３中国分离株ＶＰ１基因,通过ＴＡ克隆法构建ｐＣＲ２．１－ＣＶＢ３ＶＰ１,将ＣＶＢ３ＶＰ１亚克隆至真核表达载体ｐＣＥＰ４,构建真核表达系统ｐＣＥＰ４－ＣＶＢ３ＶＰ１,并进行酶切和测序鉴定。结果发现ＣＶＢ３的中国分离株与Ｎａｎｃｙ株的ＶＰ１基因基本一致,均编码２９３个氨基酸,其中有５９处核苷酸存在变异,但仅改变了１０处氨基酸编码,证实克隆的片段为ＣＶＢ３ＶＰ１基因,表达载体为ｐＣＥＰ４。结论实验成功地构建了ＣＶＢ３中国分离株的真核表达系统ｐＣＥＰ４－ＣＶＢ３ＶＰ１,为ＣＶＢ３基因疫苗的研究奠定了基础