硫化氢对氧糖剥夺/复氧诱导小鼠脑皮层神经元损伤的体外观察

目的 探讨硫化氢（H₂S）对氧糖剥夺/复氧（OGD/R）诱导神经元损伤的影响。方法 小鼠皮层神经元用无糖厄尔氏平衡盐溶液（EBSS）于2% O₂、5% CO₂、93% N₂ 37℃培养4h,换用neurobasal + B27培养基于37℃ 5%CO₂培养箱中继续培养12h,建立OGD/R模型。以硫氢化钠(NaHS)作为H₂S的供体,采用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞存活率;用fura-2/AM和显微荧光成像系统检测神经元胞质钙离子浓度（［Ca ²⁺ ］i）;利用比色法检测乳酸脱氢酶（LDH）释放率;碘化丙啶（PI）染色检测细胞损伤。 结果 200、300与600 μmol/L NaHS预处理30min再OGD/R,神经元存活率显著提高（n=4）;300 μmol/L NaHS预处理后再OGD/R,［Ca ²⁺］i（n=5）、LDH释放率（n=4）和细胞损伤率（n=6）均低于OGD/R组,且使用10 μmol/L钙螯合剂BAPTA也降低OGD/R诱导的LDH释放率和细胞损伤率。 结论 H₂S减轻OGD/R所致皮层神经元损伤,其机制与H₂S抑制OGD/R诱导神经元钙超载有关。     

京尼平对缺氧/复氧损伤后大鼠心肌细胞凋亡及自噬的影响

目的 探讨京尼平对缺氧/复氧(H/R)损伤后大鼠心肌细胞凋亡及自噬的影响。方法 建立H/R损伤模型,体外培养的大鼠H9c2心肌细胞行缺氧12 h、复氧4 h。实验分为对照组（Con）、京尼平组(GE)、缺氧/复氧组(H/R)、缺氧/复氧+京尼平组(H/R+GE)。细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡,透射电子显微镜观察自噬体,Western blotting检测Bax、Bcl-2、P62、Beclin1、LC3-Ⅱ、蛋白激酶B(Akt)、p-Akt、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和p-mTOR蛋白的表达。结果 京尼平预处理增强了H/R损伤后的H9c2心肌细胞活力,抑制细胞凋亡及自噬体累积,降低自噬结构断面积与细胞质断面积的比值。Western blotting结果显示,京尼平预处理减少了H/R损伤后Bax、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表达,增加Bcl-2、P62、p-Akt和p-mTOR蛋白表达。结论 京尼平可以抑制H/R损伤后心肌细胞凋亡及自噬,其机制可能与上调Akt/mTOR信号通路有关。     

黄芪甲苷与人参皂苷Rg1配伍对PC12细胞氧糖剥夺复糖复氧后细胞自噬和PI3K信号通路的影响

目的:探讨黄芪甲苷和人参皂苷Rg1配伍对PC12细胞氧糖剥夺后再复糖复氧(oxygen glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)诱导的细胞自噬的影响及作用机制。方法:以PC12细胞建立OGD/R自噬性损伤模型,观察黄芪甲苷与人参皂苷Rg1配伍对细胞自噬的影响,并通过PI3KⅠ/Akt/m TOR和PI3KⅢ/beclin-1/Bcl-2信号通路研究黄芪甲苷与人参皂苷Rg1配伍的作用机制。结果:氧糖剥夺2 h复糖复氧24 h后,PC12细胞内LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值增加。黄芪甲苷、人参皂苷Rg1及黄芪甲苷与人参皂苷Rg1配伍均能下调OGD/R后PC12细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值,且配伍组的效应强于药物单用组。机制研究表明,人参皂苷Rg1单用及黄芪甲苷和人参皂苷Rg1配伍能升高PI3KⅠ、Akt、m TOR蛋白磷酸化水平,配伍的效应强于药物单用;黄芪甲苷单用及黄芪甲苷和人参皂苷Rg1配伍均能抑制PI3KⅢ、beclin-1蛋白表达,而配伍还能上调Bcl-2蛋白表达,且配伍的效应强于药物单用组。结论:PC12细胞在缺糖缺氧2 h再复糖复氧24 h后,细胞出现自噬;黄芪甲苷和人参皂苷Rg1均能减轻OGD/R诱导的PC12细胞自噬,且2者配伍对细胞自噬具有协同抑制作用,其机制可能与调节PI3KⅠ/Akt/m TOR和PI3KⅢ/beclin-1/Bcl-2信号通路有关。     

葡萄籽原花青素提取物对HT22细胞糖氧剥夺损伤的保护作用

目的:通过研究小鼠海马神经元细胞系HT22细胞糖氧剥夺(OGD)后凋亡/自噬相关蛋白表达的变化,探讨葡萄籽原花青素提取物(GSPE)预处理对OGD诱导的HT22细胞损伤的保护作用。方法:将HT22细胞分为对照组、OGD组、OGD+GSPE组。CCK8法检测OGD不同时间(4、6、8 h)干预后HT22细胞的活性,确定后续实验中OGD时间;CCK8法检测同一OGD时间下,不同GSPE浓度(20、40、100、200μmol/L)处理后HT22细胞的活性,确定GSPE最佳浓度;免疫荧光技术标记Tubulin蛋白,观察细胞形态的改变;AnnexinⅤ-FITC/PI染色和TUNEL染色检测细胞凋亡;免疫荧光技术检测Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、LC3Ⅱ和Beclin1等蛋白的表达量变化;caspase-3活性检测试剂盒检测caspase-3相对活性。结果:观察细胞形态结果表明:对照组细胞形态完整、胞体较大,OGD组中细胞大量皱缩成团、胞体变小,OGD+GSPE组细胞状态较OGD组明显改善;观察细胞凋亡情况结果表明:和OGD组相比,GSPE预处理后的HT22细胞,凋亡阳性细胞明显减少(P<0.01);免疫荧光结果表明GSPE预处理能抑制HT22细胞中Bax、cleaved caspase-3、LC3Ⅱ和Beclin1的表达并促进Bcl-2的表达。结论:OGD对HT22细胞损伤明显,GSPE预处理可以减轻OGD对HT22细胞损伤并显著提高细胞活性,其作用机制可能与其抑制细胞凋亡和细胞自噬有关。     

自噬减轻模拟缺血/再灌注微环境中肺微血管内皮细胞损伤

目的:观察体外模拟缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)微环境下人肺微血管内皮细胞(human pulmonary microvascular endothelial cells,HPMVECs)的自噬变化,研究自噬在维持I/R条件下HPMVECs细胞存活及内皮屏障完整性中的作用。方法:用雷帕霉素(rapamycin,RAP)预处理HPMVECs,在缺糖缺氧/恢复糖和氧供(oxygen-glucose deprivation/oxygen-glucose restoration,OGD)模拟的I/R微环境中孵育细胞。应用Western blot及透射电镜法检测细胞自噬变化,用流式细胞术检测细胞凋亡,通透性小室法检测HPMVECs通透性。结果:OGD条件下HPMVECs的自噬水平明显升高,RAP预处理进一步上调了OGD条件下的细胞自噬。OGD组细胞凋亡率明显增高,细胞通透性增加。RAP预处理不仅降低了OGD引起的细胞凋亡率,而且减轻了OGD条件下细胞通透性。结论:自噬在I/R诱发的肺微血管内皮细胞损伤中发挥保护性作用,提高自噬水平有助于减少I/R条件下细胞凋亡并维持内皮屏障完整性。     

HDAC9沉默抑制新生大鼠海马神经元氧糖剥夺/再灌注损伤

目的:研究组蛋白去乙酰化酶9(HDAC9)对氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)诱导的新生大鼠海马神经元损伤的影响及其机制,为研究新生儿缺氧缺血性脑损伤奠定基础。方法:体外培养新生SD大鼠海马神经元,建立OGD/R损伤模型。用real-time PCR和Western Blot分别检测HDAC9 m RNA和蛋白表达;转染HDAC9 si RNA沉默其表达,并将细胞分为空白对照组、OGD/R组、OGD/R+scramble si RNA组和OGD/R+HDAC9 si RNA组;MTT法测定神经细胞的存活率,乳酸脱氢酶(LDH)活性检测试剂盒检测LDH漏出率,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western Blot检测细胞Bax、Bcl-2和p-STAT3的蛋白表达。此外,用JAK2抑制剂AG490预处理细胞,评价JAK2/STAT3通路在HDAC9沉默对海马神经元OGD/R损伤中的作用。结果:HDAC9在OGD/R损伤的在新生大鼠海马神经元细胞中高表达(P0.05);转染HDAC9 si RNA后,细胞HDAC9表达降低(P0.05);在OGD/R诱导的海马神经元细胞中,下调HDAC9的表达能够显著提高细胞活性,降低LDH渗出率,减少神经细胞凋亡,下调Bax表达,上调Bcl-2表达,上调p-STAT3的表达(P0.05),此外,AG490部分逆转HDAC9沉默对新生大鼠海马神经元细胞OGD/R损伤的抑制作用(P0.05)。结论:HDAC9沉默通过JAK2/STAT3通路抑制新生大鼠海马神经元OGD/R损伤。     

程序化细胞死亡因子5对缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡和自噬的影响及机制

目的:探讨程序化细胞死亡因子5(PDCD5)对缺氧/复氧(H/R)诱导的心肌细胞凋亡和自噬的影响及其作用机制。方法:以H9c2心肌细胞系为研究对象,建立H/R损伤模型,采用RNA干扰方法抑制PDCD5的表达,MTT法检测心肌细胞的存活率,TUNEL显色法检测细胞凋亡率,RT-qPCR和Western blot法分别检测mRNA和蛋白的表达水平。结果:H/R损伤的H9c2心肌细胞中,PDCD5表达水平升高,同时细胞的存活率降低,细胞凋亡率和自噬水平增加,而PDCD5沉默能够增加细胞存活率,同时减少细胞凋亡率,促进Bax表达且抑制抑Bcl-2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及自噬相关蛋白beclin-1的表达。此外,沉默PDCD5可通过降低p-P65的蛋白水平抑制NF-κB通路。结论:沉默PDCD5通过阻断NF-κB信号通路而抑制H/R损伤诱导的心肌细胞凋亡和自噬,从而保护心肌细胞。     

下调lncRNA MALAT1表达保护PC12细胞免于氧糖剥夺/复糖复氧所致的损伤

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)肺腺癌转移相关转录本1(MALAT1)对氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)诱导PC12细胞损伤的作用。方法:体外培养PC12细胞,分为4组(n=3):正常(normal)组、模型(OGD/R)组、OGD/R+si-NC组(si-NC组)和OGD/R+MALAT1 siRNA组(siRNA组)。RT-qPCR检测MALAT1的表达,MTT法检测PC12细胞活力,流式细胞术检测PC12细胞凋亡率,Western blot分析环加氧酶2(COX-2)、Bax及Bcl-2蛋白的表达,ELISA试剂盒检测炎症因子的含量。结果:同normal组相比,OGD/R组MALAT1表达升高(P0.01),细胞活力显著降低(P0.01),细胞凋亡率显著升高(P0.01),炎症因子前列腺素E_2(PGE_2)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达显著增加(P0.01),COX-2和Bax表达显著上调,Bcl-2和IL-10含量显著降低(P0.01)。同si-NC组相比,siRNA干扰MALAT1的表达后,PC12细胞活力显著提高(P0.01),细胞凋亡率显著降低(P0.05),炎症因子PGE_2和TNF-α表达显著减少(P0.05或P0.01),IL-10表达明显增加(P0.05),COX-2和Bax表达显著下调(P0.05),Bcl-2明显上调(P0.05)。结论:下调MALAT1表达可减轻OGD/R诱导的PC12细胞损伤,其机制可能涉及减轻炎症反应和抑制细胞凋亡。     

Prdx1基因敲减促进氧糖剥夺/复氧诱导的小鼠神经母细胞瘤N2a细胞凋亡

目的:观察过氧化还原蛋白1(Prdx1)基因敲减对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的小鼠神经母细胞瘤N2a细胞凋亡的作用,并进一步探讨其可能机制。方法:体外培养小鼠神经母细胞瘤N2a细胞,构建OGD/R诱导的N2a细胞损伤模型。将对数生长期的N2a细胞随机分为正常对照组、OGD/R组、OGD/R+c-Jun氨基末端激酶(JNK)抑制剂(SP600125)组、OGD/R+阴性对照序列(siNC)组、OGD/R+siPrdx1组和OGD/R+siPrdx1+SP600125组。用siRNA转染细胞;CCK-8比色法检测细胞活力;TUNEL染色法检测细胞凋亡;RT-qPCR检测Prdx1 mRNA的表达;Western blot检测Prdx1、JNK、磷酸化JNK(p-JNK)及凋亡执行蛋白cleaved caspase-3的蛋白水平。结果:体外培养的小鼠神经母细胞瘤N2a细胞经OGD/R处理后出现明显损伤,表现为细胞活力显著降低(P0.05),细胞凋亡率显著增高(P0.05);此外,Prdx1蛋白表达水平亦增高(P0.05)。Prdx1基因敲减显著促进了OGD/R诱导的JNK和caspase-3激活(P0.05),细胞活力显著降低(P0.05),同时显著加剧细胞凋亡(P0.05)。SP600125可显著抑制OGD/R诱导的JNK和caspase-3激活(P0.05),减少细胞凋亡(P0.05),逆转OGD/R条件下Prdx1基因敲减对N2a细胞的损伤作用。结论:Prdx1基因敲减促进OGD/R诱导的小鼠神经母细胞瘤N2a细胞凋亡,其机制与进一步激活JNK/caspase-3信号通路有关。     

雷帕霉素激活自噬改善嘌呤霉素氨基核苷诱导的足细胞损伤

目的:通过观察雷帕霉素对PAN 诱导的足细胞损伤及自噬相关蛋白表达的影响,探讨自噬在雷帕霉素保护PAN 诱导的足细胞损伤中的作用及可能机制。方法:构建PAN 诱导的足细胞损伤模型,将足细胞分成对照组(Control 组),PAN 组(加入50 μg/ ml PAN),雷帕霉素组(RAP 组:分别加入100、200、300 ng/ ml 雷帕霉素),PAN+雷帕霉素组(PAN+RAP组:细胞在用含PAN 的培养液培养前1 h,分别用100、200、300 ng/ ml 雷帕霉素进行预处理1 h)。采用Annexin V/ PI 双染法检测细胞凋亡,透射电镜观察自噬小体,Western blot 检测LC3、p62、4EBP1、P70S6K、mTOR 蛋白表达。结果:与对照组比较,PAN组足细胞凋亡增加,自噬体减少,LC3域蛋白表达下调,p62 上调,mTOR、4EBP1、P70S6K 磷酸化水平上调;与PAN 组比较,PAN+RAP 组足细胞凋亡率下降,自噬体增加,LC3域蛋白表达上调,p62 下调,mTOR、4EBP1、P70S6K 磷酸化水平下调。结论:PAN 可以抑制足细胞自噬,促进足细胞凋亡;雷帕霉素可通过激活自噬改善PAN 诱导的足细胞损伤,这种作用可能与雷帕霉素抑制mTOR/4EBP1、P70S6K 信号通路有关。     

脑缺血再灌注损伤程度与自噬相关基因LC3、mTOR表达的相关性研究

目的　探讨局灶性脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion, CIR）程度与自噬微管相关蛋白轻链3抗体-Ⅱ（Autophagy microtubule associated protein light chain 3 antibody-Ⅱ,LC3-Ⅱ）、雷帕霉素靶蛋白抗体（Rapamycin target protein antibody,mTOR）表达的相关性。 方法　采用线栓阻断法阻塞大脑中动脉2 h制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型;观察各组间的神经功能缺失评分、TTC梗死体积;应用免疫印迹、免疫荧光法检测大脑顶叶的LC3-Ⅱ、mTOR的表达。 结果　TTC染色显示,梗死体积在缺血再灌24 h达高峰。WB、免疫荧光显示,LC3-Ⅱ在IR中表达增加,且在缺血再灌24 h表达最高;mTOR在缺血再灌24 h、48 h表达最低。相关性分析显示,TTC染色梗死体积与LC3-Ⅱ表达水平高度正相关。 结论　脑缺血再灌注损伤程度可能与LC3、mTOR的表达水平相关。     

硫化氢对抗过氧化氢对PC12细胞的损伤作用

目的探讨硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)对抗过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)对PC12细胞的损伤作用及有关机制。方法应用H2O2在PC12细胞建立氧化应激损伤的实验模型;应用甲氮甲唑蓝(MTT)法检测细胞存活率,碘化丙啶(PI)染色流式细胞技术(FCM)检测细胞凋亡率,罗丹明123(Rhodamine 123,Rh123)染色FCM检测细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP),双氢罗丹明123染色FCM检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量。应用硫化氢钠(sodium hydrosulfide,NaHS)作为H2S的供体。结果200μmol和400μmolH2O2作用PC12细胞24h均使细胞的存活率明显降低及凋亡率显著增加,200μmolH2O2引起PC12细胞的MMP明显降低及ROS生成显著增多。当NaHS与H2O2(200或400μmol/L)共同作用于PC12细胞时,NaHS(100～400μmol/L)浓度依赖性的阻断H2O2引起PC12细胞的存活率降低及细胞凋亡率增加。400μmolNaHS明显地阻断200μmolH2O2引起PC12细胞的MMP降低及ROS增多。结论H2S能明显地保护PC12细胞对抗H2O2引起的损伤,阻断MMP降低及ROS生成可能是H2S的细胞保护机制之一。     

MPP+对PC12细胞内源性H2S生成的影响

目的： 观察1-甲基4-苯基吡啶离子 (MPP+)对PC12细胞内源性硫化氢（H2S）生成的影响,以探讨MPP+损伤PC12细胞的新机制。方法: RT-PCR方法检测PC12细胞胱硫醚-β-合酶（CBS）mRNA 的表达;亚甲基蓝分光光度计法检测PC12细胞内源性H2S的含量及PC12细胞CBS活性;台盼蓝拒染色法观察PC12细胞的存活率。结果：MPP+ 可以抑制PC12细胞CBS的表达及其活性,减少内源性H2S的生成;MPP+可以明显地降低PC12细胞的存活率;H2S的供体硫氢化钠（NaHS）对MPP+诱导的PC12细胞损伤具有显著的拮抗作用。结论: MPP+能抑制CBS的表达和活性,减少内源性H2S生成,这可能与其损伤PC12细胞的机制有关。     

二甲双胍通过AMPK信号通路对小鼠骨关节炎保护作用的研究

目的　研究二甲双胍对小鼠骨关节炎及软骨细胞分化的影响。 方法　切除小鼠右膝关节的内侧半月板和前交叉韧带造模骨关节炎,造模成功后,随机分为2组,实验组给予二甲双胍(2mg/kg/d)而对照组予等量的生理盐水灌胃干预治疗8周,通过HE、番红O-快速绿切片染色和Micro-CT观察关节结构变化,进行Mankin评分评估关节炎严重程度,通过Western Blot检测各组关节软骨AMPK、mTOR的活性及自噬程度;取新生小鼠肋软骨和膝关节软骨进行细胞培养,随机分为实验组（2mmol/L的二甲双胍）和空白对照组,观察软骨细胞形态、数量,MTT法检测细胞活性, Western Blot检测软骨细胞AMPK、mTOR的活性及自噬程度。 结果　（1）成功构建了小鼠骨关节炎模型, HE、番红O-快速绿染色、Micro-CT结果及Mankin评分证明二甲双胍能保护骨关节炎;（2）关节软骨Western Blot结果显示二甲双胍能激活AMPK,增强自噬保护骨关节炎;（3）MTT法显示二甲双胍抑制软骨细胞增殖分化,Western Blot结果显示二甲双胍促进软骨细胞自噬。 结论　二甲双胍通过激活AMPK信号通路,抑制mTOR信号通路,促进软骨细胞自噬,发挥保护骨关节炎作用。     

巨噬细胞迁移抑制因子对氧糖剥夺/复氧PC12细胞的作用

目的:研究巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)条件下PC12细胞的保护作用及其机制.方法:将PC12细胞分为对照组(control)、氧糖剥夺/复氧组(OGD/R)、MIF处理组(MIF)、ISO-1处理组(ISO-1)和MIF联合MIF抑制剂ISO-1处理组(ISO-1+MIF).利用无糖无血...     

硫化氢对β-淀粉样蛋白诱导PC12细胞凋亡的影响

目的探讨硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)对抗β-淀粉样蛋白(β-amylmoid)诱导PC12细胞凋亡的作用及机制。方法应用硫化氢钠(sodium hydrosulfide,NaHS)作为H2S的供体,甲氮甲唑蓝(MTT)法检测细胞存活率,碘化丙啶(PI)染色流式细胞技术(FCM)检测细胞凋亡率,Hoechst染色检测细胞凋亡的形态学变化,罗丹明123(Rhodamine123,Rh123)染色FCM检测细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP),双氢罗丹明123染色FCM检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量。结果淀粉样多肽β25-35(Aβ25-35)引起PC12细胞的存活率显著降低及凋亡率明显增大,同时引起PC12细胞的MMP明显降低及ROS生成率显著增加。当NaHS与Aβ25-35共同作用于PC12细胞时,NaHS浓度依赖性地阻断20μmol/LAβ25-35引起PC12细胞的存活率降低,100μmol/LNaHS显著地降低20μmol/LAβ25-35引起PC12细胞的凋亡率并阻断Aβ25-35引起的MMP降低及ROS升高。结论H2S的供体NaHS具有细胞保护作用,能对抗Aβ25-35引起的PC12细胞凋亡,此作用可能与其阻断MMP降低及ROS生成增多有关。     

自噬参与低氧预处理抗PC12细胞糖氧剥夺损伤过程

目的:观察低氧预处理(HPC)对氧糖剥夺(OGD)损伤的PC12细胞的作用,同时探讨自噬在其中的作用。方法:培养的PC12细胞按照处理因素分为6组:对照组、HPC模型组、3-甲基腺嘌呤(3-MA)组、低氧预处理后氧糖剥夺(HPC+OGD)组、3-甲基腺嘌呤预处理后行低氧预处理及氧糖剥夺(3-MA+HPC+OGD)组和OGD组。CCK-8检测细胞存活率;caspase-3活性检测试剂盒检测酶活性;TUNEL染色和流式细胞术检测细胞凋亡的情况;Western blot法检测自噬相关蛋白LC3、beclin-1和凋亡相关蛋白caspase-3的表达。结果:与对照组相比,OGD组细胞存活率明显降低;与3-MA+HPC+OGD组及OGD组相比,HPC+OGD组细胞存活率明显升高(P0.05)。与对照组相比,OGD组细胞的caspase-3酶活性明显升高;与3-MA+HPC+OGD组及OGD组相比,HPC+OGD组的caspase-3酶活性明显降低(P0.05)。与对照组相比OGD组细胞凋亡明显增多;HPC+OGD组与OGD组相比凋亡明显减少(P0.05)。此外,与对照组相比,OGD组的激活型caspase-3蛋白水平明显升高(P0.05);且HPC+OGD组与OGD组相比激活型caspase-3蛋白水平明显减少而LC3、beclin-1的蛋白水平明显升高(P0.05)。结论:HPC抗OGD损伤的机制可能与其激活细胞自噬有关。