大鼠肝星状细胞大电导钙激活钾通道特性与细胞增殖的关系

目的探讨肝星状细胞（HSC）钙激活钾通道特性,以及钾通道对HSC增殖的影响。方法以胶原酶循环灌流法分离大鼠HSC,用结蛋白抗体及α-抗平滑肌抗体进行分离细胞鉴定,采用单通道细胞膜片钳技术检测传代HSC钾通道的特性,通过MTT法、流式细胞术分别检测钾离子通道阻滞剂四乙胺（TEA）对HSC的增殖、细胞周期的影响。结果所分离细胞为HSC。传代活化的HSC有单通道存在,其电导值为（210.86±5.49）pS（n=7）,属于大电导通道;其通道表现出明显的电压依赖性以及对钙敏感性,TEA可明显减少外向钾离子通道开放概率。TAE对HSC的增殖抑制效应具有时间依赖与剂量依赖的特点,可使细胞周期阻滞于G0/G1期。结论 HSC上大电导钙激活钾通道可能参与了HSC活化增殖。     

高血压病患者动脉平滑肌细胞钙激活钾通道变化及意义

目的　研究高血压病 (essential hypertension,EH )患者肠系膜动脉平滑肌 (mesenteric arterial sm oothmuscle,MASM)细胞钙激活钾通道 (Ca2 + activated K+ channel,KCa)改变及意义。方法　利用膜片钳单通道记录技术记录胞内和胞外 Ca2 +对无 EH家族史的正常血压者 (Nn 组 ) ,有 EH家族史的正常血压者 (Nf组 ) ,无 EH家族史的 EH患者 (En 组 ) ,有 EH家族史的 EH患者 (Ef组 )肠系膜动脉平滑肌 (MASM)细胞 KCa开放概率 (Po) ,平均开放时间 (To) ,平均关闭时间 (Tc)及电流幅值 (Am)的影响。结果　 (1)人动脉平滑肌 KCa开放具有明显的电压和 Ca2 +依赖性 ,其电导值大。 (2 )胞内 Ca2 + 浓度≥ 5× 10 - 7m ol/ L时 ,En 组、Ef 组 MASM细胞 KCa的 Po 分别低于 Nn 组、Nf组 ,To 缩短。(3)胞外 Ca2 +浓度≥ 1.8× 10 - 3m ol/ L 时 ,En 组、Ef 组 MASM细胞 KCa的 Po 分别高于 Nn 组、Nf组 ,To延长 ,Tc缩短。结论　 (1) EH患者 MASM细胞 KCa对胞内 Ca2 + 敏感性降低 ,这可能是促进高血压发生的机制之一。(2 ) EH患者 MASM细胞对胞外 Ca2 +敏感性增加 ,可能与胞外 Ca2 +内流增加导致胞内 Ca2 +增加有关     

主动脉平滑肌钙激活钾通道的增龄变化

目的研究不同月龄大鼠主动脉平滑肌细胞钙激活钾通道的活性,探讨老化过程中血管平滑肌细胞钙激活钾通道的变化。方法取三组Wistar大鼠(分别为1月龄、6月龄、20月龄各20只)主动脉用酶消化法获得单个平滑肌细胞。以膜片钳技术检测细胞钙激活钾通道的活性,记录不同钳制电压下单通道电流的平均开放时间、平均关闭时间、平均开放概率、电流幅值,并绘制成电流—电压关系曲线。对比各月龄组Wistar大鼠主动脉平滑肌细胞钙激活钾通道活性。结果(1)各月龄组大鼠主动脉平滑肌细胞随着膜电位从+10 mV向+60 mV方向去极化,钙激活钾通道的电流强度逐渐加大,但加大幅度随月龄增加而降低。1月龄、6月龄和20月龄大鼠主动脉平滑肌细胞钙激活钾通道的电导值分别为192±47 ps、177±56 ps和163±35 ps,但差异无统计学意义(P>0.05)。(2)在内面向外式膜片上,20月龄和1月龄大鼠主动脉平滑肌细胞钙激活钾通道平均开放概率分别为0.009±0.001和0.015±0.004,两组比较具有显著性差异(P<0.01)。20月龄和1月龄大鼠主动脉平滑肌细胞钙激活钾通道平均关闭时间分别为2 260±653和2 512±185*,两组比较具有显著性差异(P<0.01)。(3)在同样的对称性高钾浴液中,加入不同浓度钙后,发现钙对各月龄组大鼠主动脉平滑肌细胞钙激活钾通道均有明显的激活作用,表现为平均开放概率逐渐加大,平均关闭时间逐渐缩短。但对各月龄相同钙浓度间比较发现,6月龄组平均开放概率比1月龄加大,而20月龄组平均开放概率和平均开放时间比6月龄和1月龄组均显著降低。结论大鼠主动脉平滑肌细胞钙激活钾通道的活性随着年龄增大而下降。     

槲皮素对人肠系膜动脉平滑肌细胞钙激活钾通道的激活作用

目的:观察槲皮素对人肠系膜动脉平滑肌细胞钙激活钾通道(KCa)的影响,以探讨槲皮素在分子水平扩张血管的作用机制.方法:选取需择期行腹部手术并且血压正常的患者14例,取肠系膜动脉小分支,用急性酶消化法获得单个肠系膜动脉平滑肌细胞.然后应用单通道细胞膜片钳技术观察不同浓度槲皮素对肠系膜动脉平滑肌细胞KCa通道开放概率(NPo)、电流幅度值(Am)、平均开放时间(To)、平均关闭时间(Tc)等各指标的影响.结果:在内面向外式方式下,随着浴液中槲皮素浓度的增高,通道NPo明显增高:槲皮素浓度100μmol/L时,NPo由用药前(即0 μmol/L)的0.028 62±0.011 99增高到0.147 03±0.058 17(P＜0.01);通道Am、To变化不大(P＞0.05);而通道Tc明显缩短:由用药前(477.650±376.650)ms缩短到(112.643±114.365)ms(P＜0.01).结论:槲皮素能直接激活人类血管平滑肌细胞KCa通道而实现降血压效应.     

肝星状细胞激活的研究进展

肝纤维化(HF)是各种慢性肝病共有的病理改变,其特点是以胶原为主的细胞外基质(ECM)在肝内过度沉积。肝星状细胞(HSC)激活、增殖、迁移、合成和分泌大量ECM是HF形成和发展的中心环节与细胞学基础。在此过程中,许多细胞因子(CK)、氧化应激产物、ECM组构的广泛改变、化学分子、细胞周期调控因子以及核转录因子(NF)参与HSC的激活。     

二十二碳六烯酸对大鼠冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活性钾通道的影响

目的探讨二十二碳六烯酸(DHA)对大鼠冠状动脉平滑肌细胞(CASMCs)上大电导钙激活性钾通道(BKCa)的影响。方法采用酶消化法获得大鼠CASMCs,用膜片钳技术分别记录0,10,20,40,60和80μmol/LDHA对大鼠CASMCs上BKCa通道动力学的影响。结果在不同浓度DHA作用下,IBKCa和BKCa尾电流均呈浓度依赖性增加。IBKCa和BKCa尾电流I-V曲线均上移,对IBKCa稳态激活曲线无影响。在指令电压+150 mV,不同浓度DHA作用下,IBKCa电流密度分别为68.24±22.75,72.40±24.49,120.44±37.96,237.48±53.22,323.60±74.83和370.61±88.16pA/pF(P<0.05,n=20)。DHA对IBKCa激活的药物半效浓度为36.22±2.17μmol/L。在测试电压+90 mV,不同浓度DHA作用下,BKCa尾电流密度分别为91.02±13.52,100.23±17.34,224.02±38.76,369.19±65.39,511.39±82.77和700.14±96.64 pA/pF(P<0.05,n=20)。结论 DHA对全细胞BKCa有激活作用,对稳态激活曲线无影响。DHA对BKCa通道的激活作用可能是其舒张血管机制之一。     

肝星状细胞激活与信号转导

肝纤维化是多种慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段,是所有慢性肝病的共同病理基础.目前认为肝星状细胞的激活是肝纤维化形成的关键,各种致病因素作用下引起肝损伤,释放多种细胞因子,如转化生长因子β、血管紧张素、瘦素,通过各种信号转导使肝星状细胞激活.本文就肝星状细胞激活过程中一些重要的膜受体、核受体信号转导途径及其研究进展作一综述.     

动脉粥样硬化兔主动脉平滑肌细胞钙激活钾通道变化及意义

目的　探讨动脉粥样硬化 (atherosclerosis,AS)兔主动脉平滑肌细胞钙激活钾 (Calcium activatedpotassium ,KCa)通道变化及意义。方法　 2 0只健康新西兰白兔随机分为AS组和对照组 ,每组 10只。用酶消化法获取单个主动脉平滑肌细胞 ,通过膜片钳记录技术检测AS兔主动脉平滑肌细胞KCa通道的活性 ,并在浴液中分别加入不同浓度的Ca2 + ,实时采样记录通道的开放概率 (Po)、平均开放时间 (To)、平均关闭时间 (Tc)和电流幅值 (Am) ,以加钙前作为对照组观察上述参数的变化。结果　AS组KCa通道的活性明显高于对照组。结论　AS血管平滑肌细胞KCa通道的活性明显增加 ,可能是AS血管发生代偿性扩张的机制之一。     

自发性高血压大鼠肾动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道的增龄变化研究

目的 探讨自发性高血压大鼠(SHR)大电导钙激活钾通道(BKCa,MaxiK)增龄的变化及其与血压水平的关系.方法 选取雄性SHR及正常大鼠9、15、21、27、33周龄各6只.测定各周龄SHR和正常大鼠腹主动脉血压;利用膜片钳全细胞模式记录肾动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)钾电流、用四乙胺(TEA)阻断BKCa后的电流、膜电容(Cm),计算BKCa电流值和BKCa电流密度.统计分析BKCa电流密度和其它各参数的增龄变化,及其和血压之间的相关性.结果 不同周龄SHR腹主动脉平均动脉压(MABP)均明显升高.正常大鼠MABP始终正常;SHR和正常大鼠腹主动脉血压都有升高趋势,与同周龄正常大鼠相比,SHR腹主动脉血压升高更明显(P均＜0.001).SHR肾动脉VSMCs Cm随增龄增大,正常大鼠则无显著变化.SHR肾动脉VSMCs BKCa电流密度随增龄显著降低,电容逐渐增大,而正常大鼠随增龄的变化无统计学意义(P＞0.05).SHR肾动脉VSMCs BKCa电流密度、Cm与腹主动脉MABP高度负相关(r=-0.7962,r=-0.7361),正常大鼠肾动脉VSMCs BKCa电流密度与腹主动脉MABP低度相关(r=-0.4761).结论 SHR大鼠BKCa电流密度随增龄降低,电容随增龄增大,其过程复杂,并与血压水平有高度相关性.     

一种改良的肝星状细胞分离方法

目的改良肝星状细胞（HSC）的分离方法,为深入研究肝纤维化的发生机制奠定基础。方法采用Ⅳ型胶原酶和链酶蛋白酶原位消化肝脏,在1．040～1．060g／mL范围内多重多次密度梯度离心分离HSC,台盼蓝染色测定细胞存活率,328nm紫外光激发HSC自发蓝绿色荧光法和Desmin细胞免疫荧光法鉴定HSC及检测HSC纯度。Desmin和n—SMA细胞免疫荧光方法鉴定HSC静息和活化状态。结果每只大鼠肝脏HSC得率为（3～5）×10^7个,HSC存活率在95％以上,纯度在90％以上,体外培养14d后活化的HSC纯度几乎达100％。结论在1．040～1．060g／mL密度范围内采用多重多次密度梯度离心方法,避免了HSC分离过程中因密度配比误差及HSC自身密度相对不均一性所导致的细胞流失,建立了一种改良的肝星状细胞分离方法,HSC得率和纯度更加稳定,达到国外文献报道水平。     

C/EBPα基因在大鼠肝星状细胞内的表达及意义

目的 初步探讨CCAAT增强子结合蛋白α(C／EBPα)在肝星状细胞(HSC)激活过程中的作用。方法 采用免疫细胞化学、western blot及RT-PCR检测原代培养不同时间段HSC内C／EBPd蛋白和mRNA的表达，以及α平滑肌肌动蛋白(α SMA)、结蛋白、基质金属蛋白酶-2(MMP2)mRNA、Ⅰ型前胶原(α1)mRNA的表达；Lipofect AMINE2000介导的瞬时转染方法将pcDNA3．1(-)-C／EBPα真核表达质粒转染入激活的HSC内，采用免疫细胞化学方法鉴定转染成功及转染后HSC内增殖细胞核抗原(PCNA)的表达；在相差显做镜下观察HSC在原代培养过程中形态的改变。结果 原代正常HSC中可以检测到C／FBPα mRNA和蛋白的表达，蛋白位于细胞质和细胞核内，但主要位于细胞质内，且除新鲜分离(0d)组以外，随着HSC培养至2、4、7、10d，C／EBPα蛋白和mRNA的表达呈逐步下降的趋势，而α-SMA、MMP2和Ⅰ型前胶原(α1)的表达则逐步增强；转染后24h，目的基因转染组HSC内C／EBPα的表达明显强于空载体对照组，而PCNA的阳性细胞数较空载体对照组明显减少；转染后36h，目的基因转染组细胞几乎全部死亡，残存的细胞形态变细，体积缩小，而空载体对照组细胞仍存括。结论 C／EBPα基因可能参与HSC的激活调控机制，且C／EBPα过表达对HSC的增殖存在抑制作用。     

过氧化物酶体增殖物激活受体γ与肝星状细胞在肝纤维化中的关系

肝纤维化是慢性肝损伤后常见的形态学表现，大多数是由慢性肝脏疾病发展而来。而肝损伤（肝实质炎症、坏死）激活肝星状细胞（HSC）引起大量细胞外基质沉积，是肝纤维化发生机制的中心环节。在正常肝脏中，HSC处于静息状态，细胞质中脂滴丰富，具有合成和分泌少量细胞外基质和胶原酶的能力。在肝损伤及各种慢性肝病时，HSC被激活转化为肌成纤维母样细胞，发生明显的形态和结构变化：细胞质中脂滴减少或消失，增殖迁移活性明显增强，分泌多种细胞因子和黏附分子，合成各种细胞外基质（ECM）的能力明显增强，抑制基质金属蛋白酶（MMPs）的合成和分泌，而上调基质金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）的表达，同时发生多种基因表达的改变。     

肝星状细胞的抗原提呈特性

肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC),曾被称为Ito细胞、窦周细胞、脂细胞和贮脂细胞.由德国学者Kupffer在1876年首先用氯化金染色确认,称之为sternzellen,当时曾被误认为是一种肝内吞噬细胞.1951年,Ito用电镜观察将窦周HSC与窦内Kupffer细胞(肝吞噬细胞)予以清楚鉴别.1996年国际上将该细胞统一命名为HSC[1].     

Variable expression of cystatin C in cultured trans-differentiating rat hepatic stellate cells

AIM: To study the expression of cystatin C (CysC), its regulation by transforming growth factor-beta1 (TGF-beta1) and platelet-derived growth factor (PDGF) and the potential interference of CysC with TGF-beta1 signaling in this special cell type. METHODS: We evaluated the CysC expression in cultured, profibrogenic hepatic stellate cells and trans-differentiated myofibroblasts by Northern and Western blotting and confocal laser scanning microscopy. RESULTS: CysC was increased significantly in the course of trans-differentiation. Both TGF-beta1 and PDGF-BB suppressed CysC expression. Furthermore, CysC secretion was induced by the treatment with TGF-beta1. Although CysC induced an increased binding affinity of TGF-beta receptor type III (beta-glycan) as assessed by chemical cross-linking with [125I]-TGF-beta1, it did not modulate TGF-beta1 signal transduction as shown by evaluating the Smad2/3 phosphorylation status and [CAGA]-MLP-luciferase reporter gene assay. Interestingly, the shedding of type III TGF-beta receptor beta-glycan was reduced in CysC-treated cells. Our data indicated that CysC expression was upregulated during trans-differentiation. CONCLUSION: Increased CysC levels in the serum of patients suffering from liver diseases are at least partially due to a higher expression in activated hepatic stellate cells. Furthermore, TGF-beta1 influences the secretion of CysC, highlighting a potentially important role of cysteine proteases in the progression of hepatic fibrogenesis.     

二十二碳六烯酸对大鼠心室肌细胞钠通道和瞬时外向钾通道的影响

目的 研究二十二碳六烯酸(DHA)对大鼠心室肌细胞钠通道电流(INa)和瞬时外向钾通道电流(Ito)的动力学影响.探讨DHA抗心律失常的机制.方法 采用膜片钳技术在全细胞模式下,记录20、40、60、80、100和120μmol/L DHA对大鼠心室肌细胞INa和Ito的影响.结果 (1)DHA对INa呈浓度依赖性阻滞,使稳态失活曲线左移、失活后恢复时间延长,对稳态激活曲线无影响.在指令电压-30 mV,上述浓度DHA对INa阻滞分别为(1.51±1.32)%、(21.13±4.62)%、(51.61±5.73)%、(67.62±6.52)%、(73.49±7.59)%和(79.95±7.62)%(P<0.05,n=20),DHA对INa的半效作用浓度为(47.91±1.57)μmol/L.(2)DHA对Ito呈浓度依赖性阻滞,使稳态失活曲线左移、失活后恢复时间延长,对稳态激活曲线无影响.在指令电压+70 mV,上述浓度DHA对Ito阻滞分别为(2.61 ±0.26)%、(21.79±4.85)%、(63.11±6.57)%、(75.52 ±7.26)%、(81.82 ±7.63)%和(84.33±8.25)%(P<0.05,n=20),DHA对Ito的半效作用浓度为(49.11±2.68)μmol/L.结论 DHA对钠通道和瞬时外向钾通道的抑制作用可能是其抗心律失常机制之一.

Abstract：

Objective To investigate the effects of docosahexaenoic acid(DHA)on sodium channel current(INa)and transient outward potassium channel current(Ito)in rat ventricular myocytes and to evaluate potential anti-arrhythmic mechanisms of DHA.Methods INa and Ito of individual ventricular myocytes were recorded by patch-clamp technique in whole-cell configuration at room temperature.Effects of DHA at various concentrations(0,20,40,60,80,100 and 120 μmol/L)on INa and Ito were observed.Results (1) INa was blocked in a concentration-dependent manner by DHA,stably inactivated curves were shifted to the left,and recover time from inactivation was prolonged while stably activated curves were not affected by DHA.At-30 mV,INa was blocked to(1.51 ±1.32)%,(21.13±4.62)%,(51.61 ±5.73)%,(67.62 ±6.52)%,(73.49±7.59)%and(79.95±7.62)%in the presence of above DHA concentrations(all P<0.05,n=20),and half-effect concentration(EC50)of DHA on INa was(47.91±1.57)μmol/L(2) Ito were also blocked in a concentration-dependent manner by DHA,stably inactivated curves were shifted to the left,and recover time from inactivation was prolonged with increasing concentrations of DHA,and stably activated curves were not affected by DHA.At+70 mV,Ito was blocked to(2.61 ±0.26)%,(21.79±4.85)%,(63.11 ±6.57)%,(75.52 ±7.26)%,(81.82 ±7.63)%and(84.33±8.25)%,respectively,in the presence of above DHA concentrations(all P<0.05,n=20),and the EC50 of DHA on Ito was(49.11±2.68)μmol/1.Conclusion The blocking effects of DHA on APD and Ito may serve as one of the anti-arrhythmia mechanisms of DHA.     

Hepatic immune tolerance induced by hepatic stellate cells

The liver, which is a metabolic organ, plays a pivotal role in tolerance induction. Hepatic stellate cells(Hp SCs), which are unique non-parenchymal cells, exert potent immunoregulatory activity during cotransplantation with allogeneic islets effectively protecting the islet allografts from rejection. Multiple mechanisms participate in the immune tolerance induced by Hp SCs, including the marked expansion of myeloid-derived suppressor cells(MDSCs), attenuation of effector T cell functions and augmentation of regulatory T cells. Hp SC conditioned MDSC-based immunotherapy has been conducted in mice with autoimmune disease and the results show that this technique may be promising. This article demonstrates how Hp SCs orchestrate both innate immunity and adaptive immunity to build a negative network that leads to immune tolerance.     

活化肝星状细胞的信号传导

肝纤维化是肝脏对各种急慢性肝损伤的疤痕修复反应的结果,是各种慢性肝病向肝硬化进展的共同环节,其最主要的特征是以胶原为主的细胞外基质(ECM)的生成与降解失衡,在肝脏中的过度沉积.活化的肝星状细胞(HSC)是肝纤维化发生时ECM的主要来源.HSC持续激活后增殖、迁移和表型转化,成为肌成纤维样细胞,是肝纤维化发生和发展的核心环节.活化HSC具有如下特点:(1)合成和分泌间质胶原等各种ECM;(2)自分泌产生致纤维化细胞因子如转化生长因子(TGF)β I;(3)释放胶原酶抑制物组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP);(4)分泌趋化因子及其他炎症性细胞因子;(5)具有细胞收缩特性;(6)合成基质金属蛋白酶(MMP),使ECM降解异常;(7)对凋亡刺激的耐受性等.     

褪黑素抑制大鼠肝脏星状细胞增殖机制

目的 观察褪黑素抑制大鼠肝脏星状细胞增殖的机制。方法 MTT法测定活细胞数量,流式细胞仪检测凋亡率和细胞周期, western blotting 检测NF-κB表达水平,放射免疫法检测细胞内cAMP浓度,免疫荧光法测定细胞内钙离子浓度。结果 Mel作用后HSCs增殖能力下降,亚G1凋亡峰增高,细胞内钙离子浓度、cAMP浓度和NF-κB表达水平下降。结论 Mel可能下调细胞内钙离子浓度、cAMP浓度及NF-κB表达水平而促进HSCs凋亡和G1期阻滞,从而抑制增殖。