靶向抑制Par-4基因表达对人骨髓间充质干细胞中CD2相关蛋白表达的影响及意义

目的 研究小RNA干扰靶向抑制Par-4基因表达对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)中CD2相关蛋白(CD2AP)表达的影响及意义.方法 利用构建靶向抑制Par-4基因的SiRNA真核表达载体转染hBMSCs.采用实时荧光定量PCR检测Par-4基因的mRNA水平.采用谷氨酸诱导hBMSCs凋亡.采用流式细胞术检测hBMSCs凋亡百分率.Western blot检测hBMSCs CD2AP蛋白表达量.应用SPSS 10.0软件进行统计学分析.结果 1.Par-4-SiRNA可下调hBMSCs Par-4-mRNA水平,抑制率为88%(P＜0.01).而非抑制的对照序列未见抑制作用(P＞0.05).2.流式细胞术检测结果 显示,与正常对照组比较,谷氨酸加常规hBMSCs组凋亡百分率为(59.12±5.43)%(P＜0.01).而在Par-4-SiRNA转染的Par-4-SiRNA-hBMSCs组中,谷氨酸对hBMSCs的凋亡诱导作用被显著抑制,凋亡百分率显著下调为(39.49±5.01)%(P＜0.01).3.Par-4-SiRNA转染的Par-4-SiRNA-hBMSCs组,谷氨酸对hBMSCs中CD2AP的下调作用被显著抑制,CD2AP蛋白的表达量显著上升(P＜0.01).结论 靶向抑制Par-4基因的表达能够拮抗谷氨酸诱导的hBMSCs凋亡及CD2AP表达的下调.     

5-氮杂胞嘧啶核苷诱导小鼠骨髓间充质干细胞凋亡

目的 研究5-氮杂胞嘧啶核苷(5-AZA)对小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)凋亡的影响.方法 从小鼠股骨和胫骨骨髓中分离BMSCs;利用免疫荧光染色检测间充质干细胞特异性标记分子CD44和CD90在BMSCs上的表达;应用0、10和20 μmol/L的5-AZA体外诱导培养BMSCs 48 h,应用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色和荧光标记的半胱天冬酶抑制剂(FLICA)凋亡试剂盒检测5-AZA处理后细胞的凋亡率;应用Western blot检测凋亡相关蛋白Annexin V和Caspase-3在处理后的细胞表达水平.结果 实验中,BMSCs阳性表达间充质干细胞特异性标记蛋白CD44和CD90.DAPI染色和Caspase-3染色均显示10和20 μmol/L 5-AZA可增加BMSC的凋亡率;对照组、10 μmol/L组5-AZA和20 μmol/L 5-AZA组DAPI染色阳性凋亡率分别为(21.086±2.601)％、(34.467 ±3.724)％和(46.512±3.864)％,Caspase-3染色阳性凋亡率分别为(5.354±0.735)％、(15.462±2.385)％和(28.190 ±4.190)％,组间比较差异均有统计学意义(P均＜0.01).Westernblot检测显示Annexin V和Caspase-3在5-AZA处理后表达均显著增高;对照组、10 μmol/L组5-AZA和20μmol/L 5-AZA组Annexin V相对表达水平分别为(26.612±2.184)％、(42.873 ±4.313)％和(50.056±4.457)％,Caspase-3的相对表达水平分别为(19.231 ±2.683)％、(38.618 ±5.385)％和(91.235 ±7.116)％,组间比较差异均有统计学意义(P均＜0.01).结论 常规剂量的5-AZA可诱导BMSCs凋亡.     

谷氨酸对人骨髓间充质干细胞中Par-4蛋白表达的影响

目的探讨谷氨酸对人骨髓间充质干细胞(BMSCs)中Par-4蛋白表达的影响及意义。方法用BMSCs分离液和密度梯度离心分离和培养人BMSCs,取第3～5代培养的细胞,分别加入小鼠抗人CD29-FITC、CD44-FITC、CD105-FITC、CD45-FITC、CD14-FITC、CD34-FITC单克隆抗体,流式细胞术鉴定其免疫表型。采用0.1nmol/L、1.0nmol/L、10.0nmol/L等不同剂量谷氨酸处理人BMSCs24h,并设正常对照组。Westernblot测定各组Par-4与突触素1(Synapsin-1)的蛋白表达量,并进行2种蛋白表达的相关性分析。结果在显微镜下,BMSCs呈星形或梭形。流式细胞术鉴定发现培养的细胞中CD29、CD44、CD105表达阳性,而CD45、CD14、CD34表达阴性,符合BMSCs特点。正常对照组Par-4蛋白相对表达量为17.43±5.9,0.1nmol/L、1.0nmol/L、10.0nmol/L谷氨酸诱导人BMSCs中Par-4蛋白表达依次升高,分别为39.33±8.2、49.45±11.5、86.41±14.9(Pa<0.01)。谷氨酸处理导致BMSCs中Synapsin-1表达下调,并呈剂量依赖性(F=49.1P<0.01)。10.0nmol/L谷氨酸处理24h后,Par-4蛋白的表达与Synapsin-1的表达量呈显著负相关(r=-0.643P<0.01)。结论谷氨酸诱导人BMSCs中Par-4表达升高,并可能使植入到缺血微环境中的BMSCs发挥神经细胞替代的作用受到负面影响。     

谷氨酸诱导骨髓间质干细胞凋亡及其对Smac基因转录影响

目的观察谷氨酸能否诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)凋亡,探讨Smac基因是否参与谷氨酸诱导的BMSCs凋亡。方法原代培养大鼠BMSCs,加谷氨酸培养后,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测分别经10、30、50mmol/L谷氨酸作用24h后BMSCs存活率,并用PI/Annexin-V双染法流式细胞仪计数各组凋亡细胞比例,通过逆转录聚合酶链反应观察经30、50mmol/L谷氨酸作用24h后Smac基因mRNA表达变化。结果谷氨酸诱导组BMSCs凋亡率较对照组升高(P<0.05),且随谷氨酸浓度增加,凋亡细胞百分率也相应增加;RT-PCR法发现谷氨酸作用后,BMSCsSmac基因表达较对照组升高(P<0.05),且随谷氨酸浓度增加,Smac基因表达也增加。结论谷氨酸能诱导BMSCs凋亡,Smac基因可能参与谷氨酸诱导的BMSCs凋亡。     

血清剥夺诱导大鼠骨髓间充质干细胞凋亡及其对Smac基因转录的影响

目的观察体外血清剥夺诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)凋亡及BMSCs凋亡过程中Smac基因表达变化,进一步探索BMSCs凋亡机制。方法用密度梯度离心和差异贴壁相结合法分离BMSCs,体外培养、扩增。流式细胞术对培养的BMSCs进行免疫表型鉴定。BMSCs体外血清剥夺培养0h(正常对照组)、24h、48h,用AnnexinⅤ-FITC和碘化丙啶(PI)双标记行流式细胞术凋亡检测。通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)生成cDNA,以荧光定量PCR检测分析Smac mRNA的丰度。结果体外培养第5代BMSCs流式细胞术免疫表型鉴定结果符合BMSCs特点。与0h比较,血清剥夺24、48h后,BMSCs发生显著凋亡,各组比较有统计学差异(F=170.96P<0.01),且24h点早期凋亡百分率达到(32.99±2.52)%。同时荧光定量PCR检测显示24h点Smac mRNA表达与正常对照组相比显著升高(t=2.814P<0.05)。结论血清剥夺能诱导BMSCs凋亡,被诱导凋亡的BMSCs中Smac基因转录增加。     

小儿病毒性心肌炎与Fas/Fasl介导的外周血淋巴细胞凋亡的关系

目的 探讨Fas/Fasl介导的外周血淋巴细胞凋亡在病毒性心肌炎发病中的作用.方法 选择临床诊断病毒性心肌炎患儿和正常小儿各25例,采用Annexin V/PI双参数法经流式细胞仪定量检测两组小儿外周血淋巴细胞凋亡百分率,并用双色流式细胞仪检测外周血淋巴细胞Fas、Fasl蛋白表达结果心肌炎患儿外周血淋巴细胞凋亡率[(0.697 6±0.110 9)%]较正常对照组[(0.128 8±0.106 9)%]明显升高(t=18.459,P＜0.001),且与肌酸激酶同工酶、乳酸脱氢酶、肌酸激酶、羟丁酸脱氢酶升高程度均呈正相关(r=0.817,P＜0.01;r=0.785,P＜0.01;r=0.726,P＜0.01;r=0.712,P＜0.01);心肌炎患儿外周血淋巴细胞Fas、Fasl蛋白表达[(2.8804±0.3020)、(4.4496±0.4836)]较对照组[(2.1300±0.6200)、(0.123 8±0.0384)]明显增加(t=17.321,P＜0.001;t'=44.577,P＜0.001);心肌炎患儿外周血淋巴细胞凋亡百分率与 Fas、Fasl蛋白表达均呈正相关(r=0.972,P＜0.01;r=0.958,P＜0.01)结论病毒性心肌炎患儿外周血淋巴细胞凋亡增加,可能为细胞免疫功能下降的原因之一,且与心肌损害程度相关 Fas、Fasl基因在病毒性心肌炎患儿外周血淋巴细胞凋亡中起着重要作用.     

应用5-杂氮脱氧胞苷诱导人羊水来源间充质干细胞向成肌细胞样细胞分化的体外研究

目的 探讨5-氮杂脱氧胞苷(5-AzaC)体外诱导人羊水来源间充质干细胞向成肌细胞样细胞分化的可行性.方法 B超引导下穿刺抽得孕中期羊水,体外分离、培养得到羊水来源间充质干细胞,传代后计数细胞并绘制生长曲线.体外成骨、成脂诱导观察人羊水来源间充质干细胞多向分化能力.采用5-AzaC对羊水来源间充质干细胞成肌诱导2周,观察细胞形态学变化,RT-PCR、免疫荧光染色方法鉴定成肌细胞特异mRNA及蛋白表达.结果 人羊水来源间充质干细胞体外培养后迅速进入对数生长期,培养7 d未达到平台期.茜素红和油红O染色证实人羊水来源间充质干细胞可诱导分化为成骨、成脂细胞样细胞.人羊水来源间充质干细胞经5-AzaC诱导2周逐渐变长梭形.而对照组细胞呈扁平多角形.免疫荧光染色及RT-PCR结果提示实验组细胞表达肌结蛋白(Desmin)、肌钙蛋白I(Tn I)、横纹肌辅肌动蛋白(α-Actinin)及mRNA;对照组呈阴性.结论 人羊水来源间充质干细胞体外增殖能力强,能分化为成骨、成脂细胞样细胞.5-AzaC能在体外诱导人羊水来源间充质干细胞向成肌细胞样细胞分化.     

过敏性紫癜患儿血清IgA1对人脐血管内皮细胞凋亡影响的实验研究

目的 探讨过敏性紫癜(HSP)患儿血清IgA1对脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡的影响.方法 培养人HUVEC,分为HSP组、正常对照组和空白对照组.亲和层析法分离HSP患儿及正常儿童血清IgA1,分别用50、100、200 μg/ml予以刺激HUVEC,空白对照组采用RPMI-1640培养.6、12、24 h后分别行流式细胞仪和TUNEL法检测细胞凋亡率.Real time PCR和Western blot检测HUVEC中Fas和Caspase-3表达情况.结果 HSP患儿的IgA1(200 μg/ml)可诱导脐静脉内皮细胞发生凋亡,其凋亡率显著高于空白对照组[(14.77 ±2.23)％ vs.(2.25 ±0.77)％,P＜0.01];健康对照的IgA1(200μg/ml)也可诱导脐静脉内皮细胞发生凋亡,凋亡率也显著高于空白对照组[(7.97±1.48)％ vs.(2.25±0.77)％,P＜0.01].HSP患儿的IgA1诱导HUVEC的凋亡呈浓度依赖及时间依赖性.而且HSP患儿的IgA1能显著促进HUVEC中Caspase-3及Fas的表达(P＜0.01).结论 HSP患儿体内IgA1可诱导HUVEC凋亡,其可能参与了HSP发生发展的过程.     

凋亡相关蛋白在激素性幼兔股骨头缺血坏死动物模型中的表达及意义

目的 观察各凋亡相关蛋白在激素性幼兔股骨头缺血坏死动物模型股骨头组织中的表达情况,探讨该模型中调控凋亡的主要通路.方法 选用2月龄的新西兰大白兔,制作糖皮质激素性幼兔股骨头缺血坏死模型及对照组模型,根据是否发病将激素注射组分为未发病组和发病组.取股骨头软骨及软骨下骨组织用免疫组织化学法检测凋亡通路中凋亡相关蛋白天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、Caspase-8、人结合凋亡蛋白酶活化因子-1(apaf-1)、钙蛋白酶-1(calpain-1)的表达情况.分别测定在单位视野中Caspase-3、Caspase-8、apaf-1、calpain-1的积分光密度(IOD)值.结果 1.Caspase-3的IOD值分别为发病组25 142.72 ±21 528.48,未发病组2 069.63±1 096.96,对照组301.80±99.66.Caspase-8的IOD值分别为发病组24 942.63±18 942.99,未发病组2016.31±1 518.70,对照组236.85±97.94.Apaf-1的IOD值分别为发病组8 514.23±6 384.20,未发病组1 118.49±1 360.59,对照组95.13±38.05.Calpain-1的IOD值分别为发病组9 636.71 ±9 123.81,未发病组1 881.10±3 277.86,对照组126.71±47.35.Caspase-3在发病组和未发病组、对照组间差异有统计学意义(H=11.470、23.996,p＜0.01);Caspase-8在发病组和对照组间差异有统计学意义(H=22.178,P＜0.01);apaf-1在发病组和对照组间差异有统计学意义(H=22.808,P＜0.01);calpain-1在发病组和对照组间差异有统计学意义(H=13.553,P ＜0.01).2.线性回归分析:Caspase-8能够显著的预测Caspase-3,且回归方程回归效应显著,回归方程能够解释40.3％的变异,而apaf-1和calpain-1对Caspase-3的回归效应不显著.结论 凋亡受体通路可能在股骨头缺血坏死的凋亡过程中发挥主要调控作用.     

短链RNA抑制神经母细胞瘤MYCN基因表达诱发肿瘤细胞凋亡的研究

目的 探讨MYCN高扩增神经母细胞瘤肿瘤细胞中MYCN基因的表达改变对肿瘤细胞凋亡、增殖的影响.方法 采用RNA干扰抑制MYCN基因表达,荧光定量PCR法及Westernblot法检验基因表达受抑制情况;ELISA法检验肿瘤细胞凋亡情况,Western-blot法检验神经元特异性烯醇酶表达变化.结果 siRNA转染12 h、24 h MYCN mRNA表达,相对灰度值分别为0.53±0.10(对照组为1)、0.28±0.09(对照组为1.12±0.31),表达显著降低(P＜0.05);Western-blot结果显示转染12 h、24 h MYCN蛋白表达,相对灰度值分别为0.76±0.13,对照组为1.25±0.21、0.44±0.07,对照组为1.39±0.29,表达显著降低(P＜0.05);MYCN基因表达抑制后肿瘤细胞凋亡增加,抑制组DNA碎片值1.90±0.12,对照组1.13±0.09,P＜0.05;神经元特异性烯醇酶表达增高,抑制组相对灰度值为1.04±0.14,对照组相对灰度值为0.47±0.10,P＜0.05.结论 抑制MYCN基因的表达可以促进神经母细胞瘤细胞凋亡及分化.     

黄芩苷预处理对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠的神经保护作用及机制

目的 探讨黄芩苷(BAC)预处理对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠神经元凋亡及核因子(NF)-κB P65蛋白和mRNA表达的影响,探讨神经元凋亡的调节机制.方法 健康Wistar大鼠随机分为对照组、EAE组、地塞米松(DXM)组、BAC组.各组于EAE模型制作当日分别给予预处理,每日1次,共7 d.观察各组发病率,记录神经功能评分.分别于第7、14、21天处死大鼠,留取脊髓行NF-κB P65免疫组化染色,TUNEL法检测神经元凋亡,提取总RNA检测NF-κB P65 mRNA的表达.结果 (1)对照组大鼠无发病,DXM组和BAC组发病率分别为56.25%、50.00%,较EAE组(87.50%)明显降低,差异有非常显著性(P＜0.01).DXM组、BAC组神经功能评分分别为1.56±0.34、1.46±0.20,与EAE组(2.78±0.31)相比明显降低,差异有非常显著性(P＜0.01).(2)对照组各时间点凋亡神经元少见,EAE组3个时间点神经元凋亡指数(AI)分别为23.25±1.82、63.00±4.66和31.50±3.63,DXM组为16.75±1.28、33.88±1.46及22.00±2.45,BAC组为15.25±1.67、34.25±3.28及21.88±3.09,差异有非常显著性(P＜0.01).(3)对照组偶见NF-κB P65阳性神经元.在3个时间点,EAE组、DXM组和BAC组脊髓内神经元NF-κB P65阳性率均较EAE组明显减低,差异有显著性(P＜0.05).(4)在3个时间点,对照组脊髓内NF-κB P65 mRNA灰度比值变化不明显.DXM组和BAC组脊髓内神经元NF-κB P65 mRNA灰度比值均较EAE组明显下降,差异均有非常显著性(P＜0.01).结论 BAC预处理能明显抑制大鼠脊髓内NF-κB P65的活化,减少神经元的凋亡,起到神经保护作用.     

新生鼠缺氧缺血脑损伤脑细胞凋亡与钙超载的研究

目的　研究在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤时脑细胞凋亡的规律;探讨细胞凋亡与钙超载的关系及钙离子通道拮抗剂对细胞凋亡的干预作用。方法　用流式细胞仪测定缺氧缺血（HI）后1h～10d内不同时间点脑细胞凋亡比例,并通过激光共聚焦扫描显微镜,观察硫酸镁和川芎嗪对由谷氨酸刺激造成的神经元细胞内Ca     

裸鼠皮下移植人神经母细胞瘤模型的建立和HIF-1α及其相关蛋白的表达

目的 探讨应用人神经母细胞瘤细胞株建立裸鼠皮下神经母细胞瘤模型,测定缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1α)及其相关蛋白在该模型中的表达,了解HIF-1α及其相关蛋白在神经母细胞瘤发生发展中的作用,为神经母细胞瘤(neuroblastoma NB)的发病机制研究和诊治提供新的思路与方法.方法 应用KP-N-NS人肾上腺神经母细胞瘤细胞株建立模型.采用S-P免疫组织化学方法检测裸小鼠皮下移植瘤、手术切除的神经母细胞瘤肿瘤标本、正常人肾上腺髓质组织中HIF-1α、VEGF及TGF-α的表达情况.结合免疫组化结果对HIF-1α阳性组与HIF-1α阴性组裸鼠的体重变化、瘤体重量、存活天数进行比较,并对实验结果进行统计学处理.结果 4周后解剖结果证实成模率80%;HIF-1α、VEGF及TGF-α在肿瘤组织中的阳性表达率显著高于正常组织(P＜0.01),肿瘤组与阳性对照组HIF-1α、VEGF、TGF-α三种蛋白的阳性染色的积分光密度(integrating optical density,IOD)值明显高于阴性对照组(P＜0.01).HIF-1α在肿瘤组与阳性对照组中的表达与VEGF的表达成正相关(P＜0.05),与TGF-α的表达无明显相关性(P＞0.05);HIF-1α阳性组与HIF-1α阴性组体重变化、瘤体重量及存活天数比较,差异有统计学意义(P＜0.01);HIF-1α阳性组较HIF-1α阴性组裸鼠生存时间短(P＜0.05).结论 该模型用于研究人类神经母细胞瘤,造模时间短,成瘤率高,生物学行为与人类神经母细胞瘤接近.HIF-1α、VEGF及TGF-α蛋白的阳性表达与神经母细胞瘤的浸润及转移有关.HIF-1α与VEGF在神经母细胞瘤的发生发展过程中可能存在一定的协同作用.HIF-1α的高表达是预后不良的一个重要指标.

Abstract：

Objective To study the HIF-1αand its related proteins' expression in an athymic mouse human neuroblastoma xenograft model. Methods The was established by subcutaneous injection of human adrenal neuroblastoma cells. The expressions of HIF-1α, VEGF and TGF-α were detected by S-P immunohistochemical techniques. The tumor group was divided into HIF-1α positive group and the HIF-1α negative group according to the immunohistochemistry results. The body weight,tumor weight and survival days of the HIF-1αpositive mice and HIF-1αnegative mice were statistically analyzed. Results Four weeks later, significant neuroblastoma growth occurred in 40 mice (80%).The positive HIF-1α, VEGF and TGF-α rate of the tumor group was (73. 70 ± 10. 68) %, (69. 80 ±9. 91) %, and (71.43 ± 8. 52) 0% , respectively. It is significantly increased compared with the control group (P＜0. 01 ), which were (9. 67 ± 4. 53) %, (6. 80 ± 3. 40) %, and (6. 50 ± 4. 44) %, respectively. The integrated optical density (IOD) of HIF-1α, VEGF and TGF-α was 141.97 ± 7. 98,151.85 ±14. 35, and 139. 94 ± 4. 50 in tumor group, and 141.34 ± 6. 44, 144. 06 ± 8. 51 and 149. 00 ± 13. 63 in positive control group. They were significantly higher than those of the negative control group (P＜0. 01 ). In the tumor group and positive control group, the expression of HIF-1α was positively correlated with the expression of VEGF (x2 = 7. 778,r= 0. 504,P＜0. 01). However, no correlation between the expression of HIF-1α and TGF-α was found(x2 = 0. 208,r= 0. 934,P＞0. 05). The body weight,tumor weight and survival days of HIF-1α positive mice were significantly different with those of HIF-1α negative mice (P＜0. 01 ). The mice with positive HIF-1α expression had shorter survival time than the mice with negative HIF-1α (x2 = 19. 013,P＜0. 05). Conclusions The athymic mouse human neuroblastoma xenograft model is a good model to research the biology behavior of human neuroblastoma.The overexpression of HIF-1α, VEGF and TGF-αwere found in neuroblastoma which may play important roles in tumor invasion and metastasis. HIF-1αis synergistic with VEGF to promote carcinogenesis. The overexpression of HIF-1αis correlated with poor prognosis.     

α-干扰素对血管瘤血管内皮细胞周期、凋亡的影响

目的 观察α-干扰素对体外培养血管瘤内皮细胞周期、凋亡的影响,探讨干扰素治疗血管瘤的机制.方法 用组织块法培养增生期血管瘤内皮细胞,分别用1×104U,1×105U,1×106Uα-干扰素干预,对照组不加任何药物,继续培养24h后,用流式细胞仪检测细胞周期、凋亡变化.结果 α-干扰素作用24 h后血管瘤内皮细胞G1期前出现二倍体凋亡峰;1×104U、1×105U、1×106Uα-干扰素组G1期百分率分别为(63.68±0.66)%、(72.97±1.56)%、(63.27±5.64)%,对照组为(58.75±0.32)%,与对照组比较,P＜0.05;1×104U、1×105U、1×106Uα-干扰素组S期百分率分别为(32.99±2.01)%、(25.02±1.31)%、(37.93±5.31)%,对照组为(26.46±1.94)%,与对照组比较,P＞0.05;1×104U、1×105U、1×106Uα-干扰素组G2/M期百分率分别为(0.01±0.05)%、(2.43±0.27)%、(3.99±1.27)%,其百分率随α-干扰素浓度升高而增高.细胞凋亡百分率随α-干扰素浓度增加而增高,1×104U、1×105U、1×106Uα-干扰素组凋亡百分率分别为(11.89±0.56)%、(18.88±3.04)%、(31.92±1.92)%,对照组凋亡率为(3.25±0.23)%,与对照组比较,P＜0.01.结论 α-干扰素能导致血管瘤血管内皮细胞G1、G2期阻滞和凋亡,细胞凋亡率与药物浓度存在剂量依赖关系.干扰素可能通过血管内皮细胞G1、G2期阻滞,抑制血管瘤血管内皮细胞的增殖、诱导血管内皮细胞凋亡而达到治疗血管瘤的作用.     

舒尼替尼及联合顺铂对小儿睾丸卵黄囊瘤荷瘤鼠模型的抗肿瘤作用

目的 探讨舒尼替尼(Sunitinib)、顺铂(CDDP)及两者联合用药对小儿睾丸卵黄囊瘤(TYST)异种移植荷瘤鼠模型的抗肿瘤作用及相关作用机制.方法 肿瘤标本来自本实验室的小儿睾丸卵黄囊瘤裸鼠第17代模型,并接种在雄性裸鼠单侧腹股沟皮下区,成瘤后随机分成4组(n=5):对照组、CDDP组、Sunitinib组和Sunitinib+CDDP组.绘制肿瘤体积和裸鼠体重变化曲线图,计算肿瘤消退率;HE染色观察肿瘤组织形态学变化;免疫组织化学法检测AFP、Ki-67、Glypican-3、CD105在各组肿瘤中的表达:CD105测定微血管密度(MVD),Ki-6表示细胞增殖率(PI);TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡率(AI);实时荧光定量PCR(RT-qPCR)验证靶向因子的mRNA表达变化.结果 各治疗组均能显著抑制肿瘤生长,并能消退肿瘤体积.在治疗后肿瘤体积上,除顺铂组与舒尼替尼组间无统计学差异外(41.61±7.61比67.15±5.39,P＞0.05),其余各组间都有统计学差异:对照组与顺铂(651.72±121.16比41.61±7.61,P＜0.05),对照组与舒尼替尼组(651.72±121.16比67.15±5.39,P＜0.05),对照组联合舒尼替尼±顺铂组(651.72±121.16比23.03±2.37,P＜0.05),舒尼替尼组与联合舒尼替尼+顺铂组(67.15±5.39比23.03±2.37,P＜0.05),顺铂组与联合舒尼替尼+顺铂组(41.61±7.61比23.03±2.37,P＜0.05);在裸鼠体重上,相比对照组,除舒尼替尼组无统计学差异外(25.90±0.75比26.66±0.65,P＞0.05),其余各组间差异均有统计学意义:对照组与顺铂组(25.90±0.75比18.90±0.63,P＜0.05),对照组与联合舒尼替尼+顺铂组(25.90±0.75比18.26±1.20,P＜0.05);AFP、Glypican-3在各治疗组阳性表达面积(Pixels)均少于对照组(AFP:对照组与顺铂组,1.26×106土1.48×105比5.54×105±8.14×104,P＜0.05;对照组与舒尼替尼组,1.26×106±1.48×105比7.09×105±6.64×104,P＜0.05;对照组与联合舒尼替尼+顺铂组,1.26×106±1.48×105比3.62×105±4.83×104,P＜0.05.Glypican-3:对照组与顺铂组,9.68×105±7.63×104比4.04×105±5.04×104,P＜0.05;对照组与舒尼替尼组,9.68×105±7.63×104比4.59×105±2.32×104,P＜0.05;对照组与联合舒尼替尼+顺铂组,9.68×105±7.63×104比1.89×105±2.55×104,P＜0.05).两者在顺铂组与舒尼替尼组的比较中差异无统计学意义(P＞0.05);PI和AI在各治疗组中相比对照组,差异都具有统计学意义(PI和AI:对照组与顺铂组,58.97土1.38比42.36±1.28和1.69±0.20比54.62±2.49,P＜0.01;对照组与舒尼替尼组,58.97±1.38比43.48±1.00和1.69±0.20比47.32±2.00,P＜0.01;对照组与联合舒尼替尼+顺铂组,58.97±1.38比33.34±1.19和1.69±0.20比63.41土2.23,P＜0.01).顺铂组相比联合舒尼替尼+顺铂组,PI:P=0.001,AI:P=0.002;舒尼替尼组相比联合舒尼替尼+顺铂组,PI和AI:P＜0.001;顺铂组相比舒尼替尼组,PI.P=0.597,AI:P=0.059;RT-qPCR证实M-CSFR、PDGFR-β、RET、VEGFR-2的mRNA表达受到抑制.结论 Sunitinib能显著抑制小儿睾丸卵黄囊瘤的生长,并消退肿瘤体积:主要通过直接抑制肿瘤细胞的生长和肿瘤血管的新生,从而诱导肿瘤细胞凋亡,同时伴有直接细胞毒作用引起坏死;Sunitinib相比CDDP具有更轻的毒副作用,且联合CDDP具有增强抗肿瘤作用.

Abstract：

Objective To study the antitumor effects of Sunitinib or Sunitinib combind with cis - diamminedichloroplatinum (CDDP) on an athymic mouse human testicular yolk sac tumor xenograft model. Methods The athymic mouse human testicular yolk sac tumor xenograft model was established by subcutaneous injection of 17th passage pediatric testicular yolk sac tumor cells in the unilateral inguinal region of the male nude mice. The mice of control group didn't receive any treatment. The tumor bearing mice were treated with either CDDP, or Sunitinib group, or Sunitinib combined with CDDP. The tumor-bearing nude mice were divided into 4 groups (5 in each) according the treatment they underwent. The tumor volumes and mice weight were measured to calculate the regression rate of tumor. The tumor was collected for H&E staining and immunohistochemical staining of AFP, Ki-67,Glypican-3 and CD105. Microvessel density (MVD) was measured by analyzing the CD105 expression. The tumors' proliferation index (PI) was studied by analyzing Ki-67 expression. The apoptosis of the tumor was quantitated using TUNEL staining. The mRNA expressions of cytokines were determined by quantitative real-time PCR (RT-qPCR). Results The tumor volumes were significantly decreased after chemotherapy. No difference of tumor volume was found between CDDP group and Sunitinib group (41.61 ± 7. 61 vs. 67. 15 ± 5. 39, P＞0. 05). Significant differences of tumor volumes were found between CDDP group and CDDP+ Sunitinib group (41.61 ± 7. 61 vs. 23. 03 ± 2. 37, P＜0. 05), and between Sunitinib group and CDDP+ Sunitinib group (67. 15 ± 5. 39 vs. 23.03 ± 2. 37, P＜0. 05). Of the body weight of tumor-bearing mice, no difference was found between controls and Sunitinib group (25. 90 ± 0. 75 vs. 26. 66 ± 0. 65, P＞0. 05). And significant differences of the body weight were noted between controls and CDDP group (25.90 ± 0. 75 vs. 18. 90 ± 0. 63, P＜0. 05),controls and CDDP+ Sunitinib group (25. 90 ± 0. 75 vs. 18. 26 ± 1.20,P＜0. 05). The positive areas (pixels) of AFP in the mice with chemotherapy were less than those of control mice (Control vs. CDDP: 1.26 × 106±1.48 × 105 vs. 5. 54 × 105 ± 8. 14 × 104 , P＜0. 05. Control vs. Sunitinib: 1.26 × 106 ± 1.48 × 105 vs. 7. 09 × 105 ± 6. 64 × 104, P＜0. 05. Control vs. CDDP + Sunitinib: 1.26 × 106 ± 1.48 × 105 vs. 3. 62 × 105 ± 4. 83 × 104, P＜0. 05). The positive areas (pixels) of Glypican-3 in the mice with chemotherapy were less than those of control mice (Control vs. CDDP: 9. 68 × 105 ± 7. 63 × 104 vs. 4. 04 × 105 ± 5. 04 × 104 , P＜0. 05. Control vs. Sunitinib: 9. 68 × 105 ± 7. 63 × 104 vs. 4. 59 × 105 ± 2. 32 × 104 , P＜0. 05. Control vs. CDDP + Sunitinib: 9. 68 × 105 ± 7. 63 × 104 vs. 1.89 × 105 ± 2. 55 × 104, P＜0. 05). However, there were no statistical differences of the positive areas (pixels) of AFP and Glypican-3 between CDDP and Sunitinib groups (P＞0. 05). The PI was significantly decreased after chemotherapy (Control vs. CDDP: 58. 97 ± 1.38 vs. 42. 36 ± 1.28, P＜ 0. 01. Control vs.Sunitinib: 58. 97 ± 1.38 vs. 43. 48 ± 1.00, P＜0. 01. Control vs. CDDP+ Sunitinib: 58. 97 ± 1.38 vs.33. 34 ± 1.19, P＜0. 01 ). The apoptosis index (AI) was also significantly increased after chemotherapy (Control vs. CDDP: 1.69 ± 0. 20 vs. 54. 62 ± 2. 49, P＜0. 01. Control vs. Sunitinib: 1.69 ± 0. 20vs. 47. 32 ± 2. 00, P＜0. 01. Control vs. CDDP + Sunitinib: 1.69 ± 0. 20 vs. 63. 41 ± 2. 23, P＜0. 01). Significantly differences of PI and AI were found between CDDP and CDDP + Sunitinib groups (P＜0. 01 ), and Sunitinib and CDDP + Sunitinib (P＜0. 01 ). RT-qPCR study confirmed that the mRNA expressions of M-CSFR, PDGFR-β, RET and VEGFR-2 were decreased in the mice underwent chemotherapy. Conclusions Sunitinib is effective to suppress the pediatric testicular yolk sac tumor growth, and reduce the tumor volume. Sunitinib can inhibit the angiogenesis in tumor, induce apoptosis of tumor cells, and kill the tumor cells directly. Sunitinib is less toxic than CDDP, and synergistic with the antitumor effect of CDDP.     

α-干扰素对体外培养血管瘤内皮细胞Fas、Caspase-8表达的影响

目的 观察α-干扰素对体外培养血管瘤内皮细胞Fas、Caspase-8的影响,探讨α-干扰素治疗血管瘤的机制.方法 用组织块法培养增生期血管瘤内皮细胞,检测第Ⅷ凝血因子相关抗原对血管瘤血管内皮细胞进行鉴定,用流式细胞仪检测α-干扰素作用后血管内皮细胞凋亡和Caspase-8表达变化,荧光免疫组化检测Fas抗原表达.结果 α-干扰素作用后,Fas阳性表达率为90％,对照组阳性表达率为15％,二者比较P＜0.01.α-干扰素作用后6h、24 h、48h,Caspase-8的荧光平均值分别为148.99±12.72、87.06±6.81、55.17±9.06,比对照组25.82±3.59增高(P＜0.01或0.05).各α-干扰素组血管瘤血管内皮细胞凋亡百分率分别为:1×104μ组11.89±0.56、1×105μ组18.88±3.04、1×106μ组31.92±1.92,均比对照组3.25±0.23高(P＜0.01).结论 α-干扰素可以诱导体外培养的血管瘤血管内皮细胞Fas、caspase-8高表达,促进血管瘤内皮细胞凋亡.     

儿童肿瘤化疗后粒细胞减少期并发ARDS肺泡巨噬细胞活性检测

目的 研究儿童肿瘤化疗后粒细胞减少期并发感染后出现ARDS,肺泡巨噬细胞(AM)HLA-DR的表达情况.方法 收集13例儿童肿瘤化疗后并发ARDS患者,其中5例为粒细胞减少期,予粒细胞集落刺激因子治疗.所有患儿行纤维支气管镜检查,收集支气管肺泡灌洗液(BALF)进行细胞计数、分类,流式细胞仪检测AM HLA-DR表达率.结果 粒细胞减少组ARDS患儿肺泡细胞总数、AM绝对值和AM百分比分别为(62.6±9.6)/μl、(40.8±4.3)/μl和65.9%±9.0%,粒细胞正常组ARDS患儿分别为(124.0±6.7)/μl、(67.6±10.7)/μl和54.6%±8.7%,两组差异均有显著性(P＜0.05).粒细胞减少组BALF中AM HLA-DR表达率较粒细胞正常组明显下降(35.3%±5.8%vs62.2%±5.8%),差异有非常显著性(P＜0.01).结论 粒细胞减少的ARDS患儿呈"肺泡细胞减少症"状态,AM呈失活状态.