等温扩增技术在疟原虫及巴贝虫检测中的应用

近年来,等温扩增技术（isothermal amplification technology）凭借恒温条件下对核酸高效率扩增的优势在病原体检测领域展现出了巨大的潜力。疟疾与巴贝虫病作为两类严重危害人类健康的寄生虫病在临床表现与诊断方式上相似,存在误诊的风险。同时,这两类寄生虫病可通过血液传播。因此,高效、快速的检测技术对疟疾与巴贝虫病的诊断和保证血液制品安全有重要的意义。本文对现有针对疟原虫与巴贝虫的环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）、重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification, RPA）、重组酶介导等温扩增技术（recombinase-aided amplification,RAA）以及依赖解旋酶等温扩增技术(helicase-dependent amplification, HDA)等四类等温扩增技术的原理、特点及检测方式进行综述并对其应用前景进行展望。     

环介导等温扩增技术的研究进展和微生物检测应用

环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是一种新型的核酸扩增技术。本文概述其反应原理、技术特点、相关技术、微生物检测应用及发展前景。     

重组酶聚合酶扩增技术在寄生虫快速检测中的应用

重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification, RPA）是一种新型核酸等温扩增技术,具有特异性强、灵敏度高、恒温反应、操作简单和耗时短等优点。该技术自2006年面世以来,被逐渐应用于医学、食品安全、公共卫生和农业生产等领域。寄生虫病不仅会影响人畜健康,还阻碍经济发展,带来严重的社会问题。对寄生虫病实现准确而快速的诊断有助于推进该类疾病的治疗进程,最大程度降低危害。本文综述了RPA技术的反应原理、反应条件以及在寄生虫快速检测方面的应用,分析RPA技术在原虫、吸虫和线虫检测中的敏感性和特异性。在原虫检测方面,RPA技术较为成熟,它的灵敏度明显优于传统的检测方法。在吸虫检测方面,RPA技术的敏感性和特异性等于或优于传统的检测技术。RPA技术在线虫检测方面的灵敏度优于聚合酶链式反应。此外,本文还对该技术在寄生虫病防疫工作的应用前景进行了展望。     

荧光定量环介导等温扩增技术检测恶性疟原虫方法的研究

目的建立一种简便、快速和高灵敏度的恶性疟原虫的荧光定量环介导等温扩增检测方法。方法针对恶性疟原虫环子孢子蛋白（CSP）种属特异性基因保守区域8个位点设计3对引物,同时使用PCR法扩增恶性疟原虫219bp保守序列,经克隆后转化入工程菌株JM109感受态细胞中并提取重组质粒作为模板。以探索建立恶性疟原虫荧光定量环介导等温扩增检测技术,并对其试验重复性、灵敏度、特异性及适用性子以评估。结果在重组质粒浓度为1．06×10^4∽10^9拷贝／反应的范围内,标准曲线循环阈值与模板浓度有良好线性关系（相关系数0．9995）,CT值变异系数为6．29％,无非特异性扩增,初步临床试验结果表明,试验的灵敏度为90．00％,特异度为93．33％,准确性为91．67％,试验可在30min内完成。结论荧光定量环介导等温扩增技术检测恶性疟原虫简便、快速、敏感,具有广阔的应用前景。     

重组酶介导等温扩增技术检测疟原虫方法的建立和评价

目的 建立一种重组酶介导等温扩增技术（RAA）检测疟原虫的方法。方法 针对疟原虫属保守18S小亚基核糖体RNA （18S rRNA）基因设计特异性引物,筛选确定最佳引物对组合并建立疟原虫重组酶介导核酸等温扩增体系。通过该RAA体系检测疟原虫标准质粒、4种疟原虫[恶性疟原虫( Plasmodium falciparum, P.f )、间日疟原虫( P. vivax, P.v)、三日疟原虫( P. malaria, P.m)、卵形疟原虫( P. ovale, Po)]病原体以及其他6种输血传播寄生虫（婴儿利士曼原虫、杜氏利士曼原虫、刚地弓形虫、溶组织阿米巴虫、犬吉氏巴贝西虫、田鼠巴贝虫）,以评估该体系的灵敏度和特异度。 结果 筛选出一组扩增效果较好的引物对,整个RAA体系使用最佳引物对在37 ℃,20 min即可完成扩增,对标准质粒的检测下限为10^-2 copies/μL,恶性疟原虫、间日疟原虫和卵形疟原虫为10² copies/μL,三日疟原虫为10 copies/μL。RAA检测体系未与其他输血传播寄生虫产生交叉反应,特异性良好。应用RAA方法检测外籍学生献血者标本,结果与荧光定量PCR结果一致。结论 成功建立了一种快速、简便和特异的疟原虫RAA检测方法,将会给血液筛查和一些基层偏远医院的临床检测提供很大帮助。     

几种主流恒温扩增技术及其优化策略进展

2019年末爆发的新型冠状病毒(2019-n CoV)疫情严重威胁着人类健康与经济发展,遏制疫情发展的关键是如何准确、快速地完成2019-nCoV病毒检定。虽然2019-n CoV检测主流技术平台为PCR聚合酶链反应,但恒温扩增技术因其无需昂贵设备、操作流程简便、即时检验、结果判读简易可视化等优势,逐步成为某些紧急场景PCR替代技术。本文综述了六种主流恒温扩增技术,即依赖核酸序列扩增、滚环核酸扩增、链置换扩增、解旋酶依赖扩增、重组酶聚合酶扩增、环介导恒温扩增,并从等温核酸扩增原理、优化反应策略及其应用领域进行了阐述。     

环介导等温扩增技术在疾控机构微生物检测中的应用

环介导等温扩增技术(LAMP)是一种新型的体外等温扩增特异核酸片段的技术,具有特异性强、灵敏度高、快速简便等优点.本文综述了近年来LAMP在微生物检测领域的具体应用实例和研究进展,并对其应用前景做了展望.     

新型冠状病毒实验室检测方法及应用

随着新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus?2,SRAS?CoV?2）分离培养与基因组测序的完成,新型冠状病毒肺炎（corona virus disease,COVID?19）的确诊主要依靠RT?PCR 法检测SARS?CoV?2 核酸基因,重组酶介导等温核酸扩增技术（recombinase aided amplification,RAA）等新型常温核酸扩增技术也得到进一步应用。免疫学诊断包括胶体金和ELISA IgM 和IgG 抗体检测技术,主要用于人群的筛查和辅助诊断。基于CRISPR技术的新型诊断技术等也在进一步完善过程中。     

环介导等温扩增技术及其应用

环介导等温扩增法（LAMP）是一种新的核酸扩增法.该方法在一定温度下一步即可完成扩增反应.由于其扩增效率极高、反应简单快速、高特异性和反应结果只需肉眼观察的特点,LAMP法已广泛应用于病毒、细菌等的定性定量检测和临床疾病的诊断.本文介绍了LAMP方法的原理及其在微生物分子检测方面的应用.     

LAMP结合核酸试纸条技术快速检测粪便中艰难梭菌的方法研究

目的 研究利用环介导等温扩增（loop–mediated isothermal amplification,LAMP）结合核酸试纸条技术建立艰难梭菌（Clostridium difficile,CD）的快速检测方法,为艰难梭菌检测提供一种快速检测的方法。方法 收集2016年1月至2017年12月杭州市临安区第一人民医院临床感染性腹泻患者的粪便标本201份。根据艰难梭菌毒素A基因特异序列设计引物,选择6条最佳引物,用LAMP环介导等温扩增曲线、钙黄绿素目视法和核酸试纸条测试实验结果,再优选反应体系,最后检测粪便中的艰难梭菌。结果 LAMP法能在60℃条件下扩增1h检出艰难梭菌,对1株艰难梭菌和7株非艰难梭菌检测,只有艰难梭菌能检出阳性扩增,设计的引物具有良好的特异性。脱氧核糖核酸（deoxyribo nucleic acid,DNA）检出限为0.8pg/μl。结论 LAMP结合核酸试纸条技术快速检测粪便艰难梭菌具有敏感度高、操作简便、特异性强、可视化、方便快捷的特点,适用于艰难梭菌的快速检测。     

环介导等温扩增技术在诊断结核病中的研究进展

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）技术是利用两对特殊设计的引物和链置换活性的DNA聚合酶,在恒温条件下对目的片段进行特异、高效扩增的技术。LAMP技术具有简单、快速、特异、灵敏、经济等优点,因此在结核分枝杆菌的现场快速检测和基层应用中具有广阔前景。基于此,本文主要阐述了LAMP 技术的基本原理和特点、诊断结核病的主要分子标志物,以及利用不同的分子标志物和各种类型的新型技术在诊断肺结核、肺外结核、耐药性结核病中的应用。LAMP 技术在诊断结核病中已经得到了广泛的应用,且具有较高的灵敏性和特异性,但该技术仍存在部分缺陷。本文综述了近年来LAMP 技术在结核病中的应用进展,并对其发展前景进行了展望,以期在资源有限的环境中为结核病的快速诊断提供合理的研究方向。     

滚环扩增原理及其在医药领域的应用

滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）是新近发展起来的一种恒温核酸扩增方法。这种方法不仅可以直接扩增DNA和RNA，还可以实现对靶核酸的信号放大，灵敏度达到一个拷贝的核酸分子，因此在核酸检测中具有很大的应用价值和潜力。本文结合了滚环扩增技术在医药领域中的最新研究进展，介绍了滚环扩增的原理及其在医药领域中的应用。     

实时荧光核酸恒温扩增技术在淋球菌检测中的应用分析

目的采用统计学方法评价实时荧光核酸恒温扩增技术(SAT)在临床淋球菌检测中的应用。方法以淋球菌培养法为标准对照,采用实时荧光核酸恒温扩增技术同时对150例疑似患者的生殖道拭子标本和尿液标本进行检测,对结果进行统计学分析比较,并用PCR法进行验证。结果使用SAT检测的生殖道拭子和尿液阳性检出均为110例,培养法阳性检出为108例,其中培养法检出阴性的2例通过PCR验证为阳性。两种取样方式的SAT检测法和培养法三者阳性率差异均无统计学意义(P0.05);以培养法为金标准,SAT检测拭子的敏感度为100.0%,特异度为95.2%;SAT检测尿液标本的敏感度为100.0%,特异度为95.2%。结论采用实时荧光核酸恒温扩增技术对生殖道拭子和尿道标本的检测效果与培养法相比,阳性率高,敏感度较高,且尿道标本收集方法比较简便,患者依从性好,可代替拭子道取样方法,此方法可在临床推广应用。     

核酸恒温扩增-免疫层析技术在布鲁菌病诊断中的应用

目的：探讨核酸恒温扩增-免疫层析检测方法对布鲁菌病（布病）诊断的应用价值,为核酸检测标准化推广应用提供实验室参考依据。方法：分别以全血和血清为样本提取布鲁菌核酸,应用恒温扩增技术进行核酸扩增,以免疫层析检测装置直接判读核酸扩增结果;免疫学检测应用试管凝集试验（SAT）;数据处理应用配对校正χ2检验。结果： 29例就诊者全血核酸扩增阳性率为55.2%,血清核酸扩增阳性率为23.1%,二者比较差异有统计学意义（P＜0.05）;以全血为核酸提取样本,190例不同病程SAT诊断为阳性和阴性的就诊者核酸检测结果与SAT检测结果符合率为57.9%;93例首诊SAT诊断为阳性和阴性的急性早期就诊者核酸
检测结果与SAT检测结果符合率为63.4%。结论：核酸恒温扩增-免疫层析检测方法作为一项实验室辅助诊断和治疗的参考依据,对急性早期的布病患者具有较高的临床应用价值,在鉴别诊断布病患者和非患者方面无参考价值。     

环介导等温扩增技术检测间日疟原虫方法的建立及应用分析

目的建立一种快速、简便的检测间日疟原虫的环介导等温扩增方法(LAMP)并与常规PCR方法作比较。方法根据间日疟原虫环子孢子蛋白(CSP)基因序列合成2对特异性LAMP引物,优化Mg2+浓度、dNTPs浓度、BstDNA聚合酶添加量、反应温度、时间以及设计引物缺省试验。评估优化后的LAMP反应的特异性和灵敏性。检测133份患者血样,以显微镜检方法为金标准,比较LAMP和多重PCR法检测间日疟原虫的敏感性和特异性。结果 LAMP法检测重组质粒DNA(Pv-rDNA)的灵敏度达到10-10,为传统PCR方法的100倍。镜检确诊的68例间日疟、43例恶性疟和22例非疟疾患者中,LAMP法和多重PCR检测间日疟原虫的敏感性为98.53%和97.06%,两法基本相当(χ2=0.34,P>0.05);特异性为86.15%和100%,LAMP法低于多重PCR法,差异有统计学意义(χ2=9.67,P<0.05)。LAMP法的阳性预测值和阴性预测值分别为88.16%和98.25%,多重PCR的阳性预测值和阴性预测值分别为100%和97.01%。结论 LAMP法检测间日疟原虫具有快速简便、敏感性高、设备要求低的特点,具有较好的应用前景。     

恒温扩增技术在分子诊断中的应用

聚合酶链反应(PCR)技术是近年来广泛应用于科学研究和临床检验的一项技术。目前传统的PCR技术中核酸的扩增存在效率不高且需要专用的仪器设备等缺陷,而恒温扩增技术由于引物种类多样,检测方法多变,从而克服了传统PCR核酸扩增技术的缺点,使其越来越多地被应用于分子诊断中。经国内外学者的研究证实,恒温扩增技术有着广泛的应用前景,现着重对恒温扩增技术予以综述。     

LAMP技术检测弓形虫感染方法的建立

目的建立一种快速、简便的检测弓形虫感染的环介导等温扩增方法(LAMP)。方法根据弓形虫RH株SAG1基因序列合成2对特异性LAMP引物,优化扩增体系与参数。通过与常规PCR方法的比较,评估优化后的LAMP反应的特异性和灵敏性。利用建立的LAMP初步检测人工感染弓形虫4 d后白兔与大鼠的肌肉组织。结果 LAMP法检测弓形虫基因组DNA的灵敏度是传统PCR方法的100倍。LAMP法检测与其他常见寄生原虫、寄生虫无非特异性阳性结果。LAMP法检测人工接种动物的肌肉组织,阳性率达到100%,对照组为0,差异有统计学意义(P0.01)。结论 LAMP法检测弓形虫感染快速简便、敏感性高、设备要求低,具有较好的应用前景。     

改良环介导等温扩增技术在疟原虫耐药基因SNP检测中的价值及可行性

目的 探讨改良环介导等温扩增技术(LAMP)对常见药物抗性基因SNP的检测价值及可能性.方法 采集非洲赤道几内亚马拉博地区医院提供的500例当地疟疾患者的外周血液样本,以巢式PCR为金标准,比较改良环介导等温扩增技术与其在恶性疟原虫耐药基因SNP检测中的反应效率、敏感性及特异性.结果 对照金标准巢式PCR方法,对500例患者进行检测,两种方法的检测符合率为96.4%,差异无统计学意义(P>0.05).检测效率比较显示,通过与金标准进行比较,改良LAMP的初反应时间较快,在10 min内即起跳并迅速达到阳性反应阈值,而巢式PCR扩增效率相对较低,明显落后于改良LAMP(q浑浊度=6.492,P<0.001;q反应速率=0.931,P=0.079);敏感性比较显示,改良LAMP扩增的阳性反应阈值较巢式PCR出现得早,并且随着时间推移,反应扩增量逐渐增加,在反应的20 min内,改良LAMP反应起跳时间较早(q浑浊度=20.171,P<0.001;q反应速率=0.326,P=0.674);特异性比较显示,改良LAMP对四种疟原虫均有较好的特异性,无论是起跳时间、扩增产物速率均优于巢式PCR(q浑浊度=18.619,P<0.001;q反应速率=1.927,P=0.073).结论 改良环介导等温扩增技术具有较好的反应速率、特异性及敏感性,操作简便、诊断效率高,值得推广.